Protocolos de Microbiologia Ambiental Parte 3. Microbiologia ambiental aplicada

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1 2013 Protocolos de Microbiologia Ambiental Parte 3. Microbiologia ambiental aplicada Escola Superior Agrária Instituto Politécnico de Coimbra Manuela Abelho

2 Índice Qualidade do ar interior e de superfícies... 3 Ar ambiente... 3 Legislação sobre qualidade do ar ambiente... 3 Ar interior... 4 Microrganismos no ar interior... 4 Legislação sobre qualidade do ar interior... 5 Procedimentos gerais... 5 Superfícies... 6 Procedimentos gerais... 6 Avaliação da qualidade do ar interior e de superfícies... 6 Protocolo Amostragem do ar por sedimentação... 6 Material... 7 Procedimento... 7 Protocolo Amostragem do ar por filtração... 7 Material... 7 Procedimento... 7 Protocolo Amostragem de superfícies pelo método da zaragatoa... 8 Material... 8 Procedimento... 8 Qualidade da água... 8 O conceito de qualidade da água... 9 Os conceitos de poluição e contaminação da água... 9 Microrganismos e qualidade da água Os microrganismos como poluentes Microrganismos como indicadores de poluição Água destinada ao consumo humano Legislação aplicável Localização dos pontos de amostragem Valores paramétricos Controlo da qualidade Métodos analíticos de referência (Decreto-Lei 306/2007) Águas para produção de água para consumo humano, para suporte de vida aquícola e águas de rega Legislação aplicável Águas doces superficiais e subterrâneas destinadas à produção de água para consumo humano.. 14 Águas para suporte de vida aquícola Águas de rega Métodos analíticos de referência (Decreto-Lei 236/98) Águas balneares Legislação aplicável Ponto de amostragem, recolha e conservação das amostras Métodos analíticos de referência (Decreto-Lei 135/2009) Métodos gerais de análise microbiológica da água Inoculação de tubos múltiplos e determinação do NMP Filtração por membrana...20 Avaliação da qualidade das águas...20 Protocolo 3.4 Recolha de amostras de água...20 Norma aplicável: EN ISO :

3 Recolha de amostras de água de uma torneira Recolha de amostras de água de um curso de água, de um reservatório ou de uma praia Protocolo 3.5 Enumeração de microrganismos cultiváveis: contagem de colónias por sementeira em meio ágar extrato de levedura Protocolo 3.3 Deteção e enumeração de coliformes totais, coliformes fecais e Escherichia coli pelo método do Número Mais Provável (NMP) Protocolo 3.4 Deteção e enumeração de estreptococos fecais pelo método do Número Mais Provável (NMP) 20 Protocolo 3.5 Deteção e enumeração de Clostridium perfringens (incluindo esporos) pelo método do NMP 22 Referências

4 Protocolos de Microbiologia Ambiental Parte 3. Microbiologia ambiental aplicada Qualidade do ar interior e de superfícies Ar ambiente A qualidade do ar é o termo que se usa para traduzir o grau de poluição no ar que respiramos. A poluição do ar é provocada por uma mistura de substâncias químicas, lançadas no ar ou resultantes de reações químicas, que alteram o que seria a constituição natural da atmosfera. Estas substâncias poluentes podem ter maior ou menor impacte na qualidade do ar, consoante a sua composição química, concentração na massa de ar em causa e condições meteorológicas. Assim, por exemplo, a existência de ventos fortes ou chuvas poderão dispersar os poluentes, ao passo que a presença de luz solar poderá acentuar os seus efeitos negativos (APA, 2011). Na legislação não está contemplado o uso de parâmetros microbiológicos na avaliação da qualidade do ar ambiente; apenas na avaliação da qualidade do ar interior. Legislação sobre qualidade do ar ambiente Lei 11/87, de 7 de Abril Lei de Bases do Ambiente Define a orientação de partida da proteção do ar que, como componente ambiental natural, tem necessariamente que conhecer um nível de proteção coerente e compatível com as demais componentes ambientais naturais e humanas, previstas neste diploma basilar da definição da política ambiental em Portugal. Decreto-Lei 276/99, de 23 de Julho Define as linhas de orientação da política de gestão da qualidade do ar e transpõe para a ordem jurídica interna a Directiva 96/62/CE, do Conselho, de 27 de Setembro, relativa à avaliação e gestão da qualidade do ar ambiente. Decreto-Lei 279/ Primeira alteração ao Decreto-Lei 276/99, de 23 de Julho, que define as linhas de orientação da política de gestão da qualidade do ar e transpõe para a ordem jurídica interna a Directiva 96/62/CE, do Conselho, de 27 de Setembro, relativa à avaliação e gestão da qualidade do ar ambiente. 3

5 Decreto-Lei 111/2002, de 16 de Abril Estabelece os valores limite das concentrações no ar ambiente do dióxido de enxofre, dióxido de azoto e óxidos de azoto, partículas de suspensão, chumbo, benzeno e monóxido de carbono, bem como as regras de gestão da qualidade do ar aplicáveis a esses poluentes, em execução do disposto nos artigos 4º e 5º do Decreto-Lei 276/99 de 23 de Julho, transpondo para a ordem interna as Directivas Comunitárias 1999/30/CE, do Conselho, de 22 de Abril, e 2000/69/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 16 de Novembro. Decreto-Lei 320/2003, de 20 de Dezembro Estabelece objetivos a longo prazo, valores alvo, um limiar de alerta e um limiar de informação ao público para as concentrações do ozono no ar ambiente, bem como as regras de gestão da qualidade do ar aplicáveis a esse poluente, em execução do disposto nos artigos 4º e 5º do Decreto-Lei 276/99 de 23 de Julho, transpondo para a ordem jurídica nacional a Directiva 2002/3/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 12 de Fevereiro, relativa ao ozono no ar ambiente. Decreto-Lei 351/2007, de 23 de Outubro Transpõe para a ordem jurídica interna a Directiva 2004/107/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 15 de Dezembro, estabelecendo valores alvo para as concentrações de arsénio, cádmio, mercúrio, níquel e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos no ar ambiente. Ar interior A qualidade do ar no interior dos edifícios é um dos fatores básicos no conforto dos utilizadores e também influencia a sua saúde, bem como o rendimento e duração do equipamento e maquinaria existentes na área de tratamento do ar. A qualidade do ar interior deve, assim, ser avaliada periódica e sistematicamente, com o objetivo de garantir níveis mínimos de qualidade (SGS, 2011). Microrganismos no ar interior Além das partículas poluentes não biológicas, o ar contém bioaerossóis, que correspondem a material biológico transmitido pelo ar. Os contaminantes biológicos incluem microrganismos (bactérias, fungos, vírus), ácaros, pólen, traças, pelo e fezes de animais. As bactérias (e.g., Staphylococcus spp. e Micrococcus spp.) e fungos (e.g., Penicillium spp., Aspergillus spp. e Cladosporium spp.) são os mais frequentemente associados com biocontaminantes e com queixas quanto à qualidade de ar de interiores. Entre as principais fontes de contaminação fúngica estão os sistemas de ventilação mecânica, em função do seu funcionamento deficiente e de misturar ar filtrado externo com ar reciclado (Filho et al., 2000). A quantidade e o tipo de microrganismos existentes dentro de um espaço fechado estão diretamente relacionados com a existência de suspensões orgânicas e minerais no ar, a temperatura e a humidade relativa, as condições de manutenção dos sistemas de climatização existentes, a higiene das instalações, o número e o nível de higiene dos seus ocupantes. 4

6 Legislação sobre qualidade do ar interior Em 2006 foi instituído o Sistema Nacional de Certificação Energética e da Qualidade do Ar Interior nos Edifícios SCE, composto por um extenso pacote legislativo (Decretos-Lei 78, 79 e 80 de 4 de Abril de 2006), que prevê a obrigatoriedade de auditorias à qualidade do ar interior. Essas auditorias incluem a avaliação microbiológica da qualidade do ar. Decreto-Lei 79/2006, de 4 de Abril Aprova o Regulamento dos Sistemas Energéticos de Climatização em Edifícios, publicado em anexo. Transpõe parcialmente para a ordem jurídica nacional a Directiva 2002/91/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho de 16 de Dezembro, relativa ao desempenho energético dos edifícios. Define os parâmetros microbiológicos a avaliar e os valores máximos admissíveis para cada parâmetro (Tabela 3.1). Tabela 3.1 Parâmetros microbiológicos e valores máximos admissíveis a considerar na determinação da qualidade do ar interior (Decreto-Lei 79/2006). Nº UFC/m 3 Bactérias 500 Fungos 500 Legionella Procedimentos gerais Para a amostragem dos microrganismos do ar pode utilizar-se a monitorização passiva e a monitorização ou amostragem ativa. A monitorização passiva é levada a cabo por sedimentação do ar em caixas de Petri standard com meio de cultura generalista, abertas e expostas ao ar durante um período de tempo conhecido. Este método pode ser limitante porque não permite, pelo menos diretamente, a contabilização do número de unidades formadoras de colónia por unidade de volume de ar. Para além disso, as caixas de Petri podem ser contaminadas por microrganismos provenientes de outras fontes de contaminação que não o ar. Por outro lado, é um método fácil de usar e com baixos 1 Em edifícios com sistemas de climatização em que haja produção de aerossóis (e.g., torres de arrefecimento ou humidificadores por água líquida), ou com sistemas de água quente para chuveiros onde a temperatura de armazenamento seja inferior a 60ºC. Pesquisa em amostras de água recolhidas nos locais de maior risco (e.g., tanques das torres de arrefecimento, depósitos de água quente e tabuleiros de condensação). A Legionella é uma bactéria Gram-negativa, móvel, com forma de bastonete. Pode causar pneumonia (doença dos legionários) ou uma doença semelhante à gripe (doença de Pontiac). Ao contrário de outras bactérias, pode sobreviver com baixos níveis de oxigénio dissolvido e é parcialmente resistente à desinfeção com cloro. Existem pelo menos 48 espécies de Legionella, das quais 18 podem causar doenças. Pensa-se que a maioria das infeções é devida à espécie Legionella pneumophila. 5

7 custos. A monitorização ativa necessita de um amostrador de ar, que filtra volumes conhecidos através de um filtro que depois é incubado num meio apropriado. Embora ambos os métodos sejam válidos e possam ser utilizados, na legislação portuguesa está indicado o método da filtração para a quantificação das bactérias e dos fungos do ar. Para a distinção de fungos e leveduras pode recorrer-se a diferentes meios de cultura, à observação macroscópica das colónias e à observação microscópica das suas células. A determinação de Legionella é efetuada nas águas. Superfícies A amostragem e a análise dos microrganismos presentes em superfícies permitem determinar se os métodos de limpeza e desinfeção utilizados são eficazes. Este tipo de análise está normalmente relacionado com a produção de alimentos e o controlo microbiológico é um dos passos exigidos no sistema HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point, que se traduz por Análise de Perigos e Controlo de Pontos Críticos), um sistema de controlo da segurança alimentar. Na legislação não estão previstos valores-limite, mas no controlo da segurança alimentar utilizam-se os valores indicados na Tabela 3.2 para bactérias aeróbias mesófilas totais (Downes & Ito, 2001). Tabela 3.2 Valores limite para bactérias aeróbias mesófilas totais em superfícies na indústria alimentar (Downes & Ito, 2001). Satisfatório <1 Aceitável 2-10 Não satisfatório >10 NºUFC/cm 2 Procedimentos gerais Para a determinação de bactérias aeróbias mesófilas totais utiliza-se o método da zaragatoa (objeto semelhante a um cotonete gigante) seguido por inoculação por incorporação. Avaliação da qualidade do ar interior e de superfícies Protocolo Amostragem do ar por sedimentação Os microrganismos presentes no ar sedimentam a taxas variadas dependendo do tipo e do tamanho das partículas em suspensão e do movimento do ar da sala. A amostragem por sedimentação não determina diretamente o número de microrganismos presentes num dado volume de ar, mas é possível transformar os resultados deste método (nº de UFC/unidade de área) em nº de UFC/unidade de volume. Para isso, é necessário conhecer a área da caixa de Petri exposta ao ar e a razão entre o número de células na superfície e número de células no ar (SAR). A SAR para ambientes com sedimentação espontânea, i.e., sem aparelhos que forcem o ar, é 23:1 (Morais et al., 2010). O número de UFC em cada metro cúbico de ar calcula-se de acordo com a Equação 3.1 (Friberg et al., 1999a; Friberg et al., 1999b): Equação 3.1 Cálculo do número de UFC/m 3 de ar pelo método da amostragem por sedimentação. Para calcular a área (A) de uma caixa de Petri, mede-se o seu diâmetro (cm), divide-se por 2 para obter o raio (r) e aplica-se a Equação 3.2. Para transformar o resultado obtido (cm 2 ) em m 2, divide-se 6

8 por (1 m 2 tem cm 2 ). Existem caixas de Petri de vários tamanhos. As mais comuns têm diâmetro de 8 cm, pelo que a sua área é aproximadamente 50 cm 2 ou seja, m 2. Equação 3.2 Cálculo da área de um círculo. Material Caixas de Petri com meio de cultura PDA (Potato Dextrose Agar); caixas de Petri com meio de cultura PCA (Plate Count Agar). Procedimento 1. Identificar as caixas com o nome do meio de cultura e a data de elaboração; 2. Deitar o meio nas caixas de Petri, deixar arrefecer e solidificar; 3. Abrir as caixas ao ar no local desejado, tendo o cuidado de utilizar pelo menos duas repetições para cada um dos tipos de microrganismo; 4. Deixar em exposição durante 30 minutos; 5. Fechar as caixas, inverter, identificar e colocar na estufa (30ºC para as bactérias e 25ºC para os fungos); 6. Deixar incubar durante horas e contabilizar o número de UFC em cada caixa; 7. Calcular o número de UFC de fungos e de bactérias por m 3 do ar da sala (Equação 3.1); 8. Comparar o resultado obtido com a legislação e concluir. Protocolo Amostragem do ar por filtração A forma correta de aplicação deste método consiste na utilização de um amostrador que permite determinar com exatidão o volume de ar filtrado. O método aqui descrito pretende ultrapassar a limitação imposta pela não existência de um amostrador, utilizando um aparelho de filtração normalmente existente nos laboratórios não especializados. Material Caixas de Petri com meio de cultura PDA (Potato Dextrose Agar); caixas de Petri com meio de cultura PCA (Plate Count Agar); filtros estéreis de 0.45 m; aparelho de filtração; bico de Bunsen; pinças. Procedimento 1. Ligar a bomba de vácuo ao aparelho de filtração, colocar uma membrana e cronometrar o tempo que o aparelho demora a filtrar um volume conhecido de água. Utilizar este resultado para fazer uma estimativa do ar filtrado pelo aparelho durante um dado período de tempo; 2. Com uma pinça estéril, colocar uma membrana estéril no aparelho de filtração, ligar a bomba de vácuo e cronometrar o tempo necessário para filtrar o volume de ar pretendido; 3. Desligar a bomba de vácuo e, em condições de assepsia, retirar o filtro com uma pinça estéril, colocar sobre o meio de cultura; 4. Em condições de assepsia e utilizando a pinça estéril, colocar o filtro sobre o meio de cultura na caixa de Petri; 5. Fazer pelo menos duas repetições para cada um dos tipos de microrganismo; 6. Fechar as caixas, inverter, identificar e colocar na estufa (30ºC para as bactérias e 25ºC para os fungos); 7. Deixar incubar durante horas e contabilizar o número de UFC em cada caixa; 8. Calcular o número de UFC de fungos e de bactérias por m 3 do ar da sala; 9. Comparar o resultado obtido com a legislação e concluir. 7

9 Protocolo Amostragem de superfícies pelo método da zaragatoa Material Caixas de Petri estéreis; meio de cultura PCA mantido a 45ºC; zaragatoas estéreis; tubos de ensaio com 10 ml de soluto de Ringer estéril; pipetas estéreis de 1 ml; bico de Bunsen. Procedimento 1. Humedecer uma zaragatoa estéril com água destilada; 2. Percorrer com a zaragatoa uma área de tamanho conhecido, no mínimo 100 cm 2 (por exemplo um quadrado de 10 cm 10 cm); 3. Em condições de assepsia, imergir a zaragatoa num tubo com 10 ml de soluto de Ringer, espremendo várias vexes contra a parede interior do tubo; 4. Homogeneizar o conteúdo do tubo de ensaio e, em condições de assepsia, retirar 1 ml para uma caixa de Petri estéril; 5. Deitar na caixa de Petri cerca de 15 ml de meio de cultura e homogeneizar (ver Erro! A rigem da referência não foi encontrada., página Erro! Marcador não definido.); 6. Esperar que solidifique, identificar a caixa de Petri, inverter e incubar a 30ºC durante h; 7. Contar o número de UFC; 8. Comparar o resultado obtido com a legislação e concluir. Qualidade da água A água é um recurso essencial à vida, indispensável para a humanidade mas também para os outros organismos e para a manutenção das funções e da integridade dos ecossistemas (Mendes, 2010). A água é um elemento fundamental para o desenvolvimento sustentável dos países, pelo que a falta de água ou a falta de água com qualidade diminuem a qualidade de vida das populações. Devido ao aumento da população humana as necessidades de água têm vindo a aumentar; no entanto, as atividades humanas direta ou indiretamente podem diminuir a qualidade da água, tornando-a imprópria para determinados fins, ou seja, podem diminuir a quantidade de água com qualidade para ser utilizada nalgumas atividades. Na União Europeia, a legislação regula a gestão das águas superficiais, designadamente as águas interiores, de transição e costeiras, e das águas subterrâneas, de forma a: a) Evitar a continuação da degradação e proteger e melhorar o estado dos ecossistemas aquáticos e também dos ecossistemas terrestres e zonas húmidas diretamente dependentes dos ecossistemas aquáticos, no que respeita às suas necessidades de água; b) Promover uma utilização sustentável de água, baseada numa proteção a longo prazo dos recursos hídricos disponíveis; c) Obter uma proteção reforçada e um melhoramento do ambiente aquático, nomeadamente através de medidas específicas para a redução gradual e a cessação ou eliminação por fases das descargas, das emissões e perdas de substâncias prioritárias; d) Assegurar a redução gradual da poluição das águas subterrâneas e evitar o agravamento da sua poluição; e) Mitigar os efeitos das inundações e das secas; f) Assegurar o fornecimento em quantidade suficiente de água de origem superficial e subterrânea de boa qualidade, conforme necessário para uma utilização sustentável, equilibrada e equitativa da água; g) Proteger as águas marinhas, incluindo as territoriais; 8

10 h) Assegurar o cumprimento dos objetivos dos acordos internacionais pertinentes, incluindo os que se destinam à prevenção e eliminação da poluição no ambiente marinho (Lei nº58/2005). O conceito de qualidade da água O conceito de qualidade da água é relativo, já que depende do uso a que se destina ou do objectivo do seu utilizador. Assim, a qualidade da água pode ser definida, para fins específicos, como o conjunto de características físicas, químicas e biológicas adequadas à sua utilização para determinado uso. Para cada uso da água é pois necessário estabelecer as exigências relativas à sua qualidade, isto é, definir parâmetros de qualidade e estabelecer os seus valores-limite (Mendes, 2010). O Decreto-Lei 236/98, de 1 de Agosto define quatro tipos principais de utilização da água: águas para consumo humano, águas para suporte de vida aquícola, águas balneares e águas de rega. As águas para consumo humano são águas doces que podem ter origem em águas superficiais, em águas subterrâneas ou em águas de abastecimento. As águas para suporte de vida aquícola são águas superficiais, doces ou salobras, continentais ou litorais, destinadas à produção de peixe (águas piscícolas) ou de bivalves (águas conquícolas). As águas balneares são águas doces lóticas e lênticas, comummente designadas de correntes e paradas, assim como a água do mar e as águas estuarinas, que se encontrem classificadas como águas balneares ou, não estando classificadas, onde o banho não esteja interdito e seja habitualmente praticado por um número considerável de banhistas (aproximadamente 100/dia, durante a época balnear). A água de rega é água superficial ou subterrânea ou água residual, que vise satisfazer ou complementar as necessidades hídricas das culturas agrícolas ou florestais (artigo 3º do Decreto-Lei 236/98). Os limites paramétricos estabelecidos na legislação são principalmente desenvolvidos para a prevenção da ocorrência de surtos sanitários, fornecendo uma informação limitada sobre a protecção do ambiente e da saúde. Os limites paramétricos podem definir-se como (i) a concentração de uma substância ou organismo que não representa um perigo significativo para a saúde de um número significativo de utilizadores; (ii) as condições nas quais a exposição a essa substância ou organismo não são prováveis, ou (iii) uma combinação de ambos (Mendes, 2010). Assim, são normalmente impostos na legislação dois limites paramétricos, o valor máximo recomendável (VMR) e o valor máximo admissível (VMA). O VMR é o valor de norma de qualidade que não deverá ser ultrapassado (Decreto-Lei 236/98) e garante a manutenção da saúde do consumidor e a cobertura das suas necessidades alimentares. O VMA é o valor da norma de qualidade que, de preferência, deve ser respeitado ou não excedido (Decreto-Lei 236/98); ou seja, como nem sempre os valores obtidos são VMR, toma-se em conta o VMA, na perspetiva de que nesse intervalo de valores (VMR-VMA) não se verificarão riscos significativos para a saúde dos consumidores. Os conceitos de poluição e contaminação da água A poluição da água pode ser definida como: (i) a inadequação da sua aplicabilidade para algum objetivo considerado, (ii) qualquer modificação natural ou artificial que direta ou indiretamente modifique, altere ou destrua o equilíbrio dos ecossistemas e dos recursos naturais de tal modo que traga perigo para a saúde pública, diminua a sua adequabilidade ou eficiência e o bem-estar do Homem e das suas comunidades, ou (iii) a alteração da composição ou do estado da água de tal forma que se torne menos adequada para todas ou algumas das funções e fins a que pode ser adequada no seu estado natural. O conceito de contaminação é definido como a introdução ou descarga na água de organismos patogénicos ou de substâncias tóxicas que a tornem imprópria para consumo público e/ou usos domésticos, ou seja, a contaminação pode ser considerada um aspeto específico da poluição. 9

11 Microrganismos e qualidade da água Os microrganismos como poluentes Os poluentes podem ser inorgânicos, organismos e biológicos, incluindo-se os microrganismos neste último grupo. Os perigos mais significativos da poluição biológica por microrganismos devem-se à contaminação das águas por resíduos fecais ou urinários, provenientes do metabolismo dos animais homeotérmicos. Embora muitos microrganismos associados a este tipo de resíduos sejam inofensivos para pessoas saudáveis, alguns são agentes patogénicos. Quando existe contaminação da água por fezes, as bactérias de origem fecal (associadas às fezes) são uma causa potencial de várias doenças que podem ocorrer sob a forma epidémica doença que afeta simultaneamente muitos indivíduos, por contágio ou sob a forma endémica doença que se verifica permanentemente numa dada região. Para além das bactérias fecais, outros microrganismos presentes na água vírus, helmintas, protozoários, podem representar perigos para as populações humanas, mas não fazem em geral parte da análise sistemática incluída nas normas legais da maioria dos países não tropicais. Microrganismos como indicadores de poluição O número de microrganismos presentes nos materiais fecais é muito elevado, cerca de 109 (i.e., ) de cada um dos grupos pesquisados por cada grama de material fecal, dos quais apenas alguns são patogénicos (Mendes, 2010). Ou seja, juntamente com os microrganismos patogénicos são libertados microrganismos não patogénicos ou de patogenia limitada, pelo que a presença ou ausência desses microrganismos numa amostra indica se a água em questão foi ou não contaminada por fezes, isto é, se apresenta o perigo de conter microrganismos fecais patogénicos. Os microrganismos não patogénicos ou de patogenia limitada são indicadores de contaminação fecal e são utilizados para monitorizar as águas para a contaminação por fezes (Mendes, 2010). A escolha dos indicadores de qualidade microbiológica da água obedece a vários critérios (Mendes, 2010): 1. A concentração do microrganismo indicador na água contaminada deve ter uma relação direta com o grau de contaminação; 2. O microrganismo indicador deve ser suficientemente conhecido, de forma a permitir a atribuição de valores-limite; 3. A análise do microrganismo indicador deve ter uma metodologia padronizada e específica para o microrganismo em causa (i.e., a presença de outros microrganismos não deve gerar resultados positivos) e suficientemente sensível para detetar níveis baixos do indicador; 4. A análise do microrganismo indicador deve ser rápida, inequívoca e de baixo custo; 5. O microrganismo indicador deve estar presente sempre que microrganismos fecais patogénicos estejam também presentes, e em quantidade superior aos patogénicos; 6. O microrganismo indicador deve ser mais resistente aos agentes desinfetantes que os microrganismos patogénicos (i.e., deve sobreviver mais tempo); 7. O microrganismo indicador não deve reproduzir-se na água (para não causar sobre estimativas da poluição) 8. O microrganismo indicador deve distribuir-se de forma aleatória na massa de água; 9. O microrganismo indicador deve ser propício para a análise de todos os tipos de água: torneira, rios, subterrânea, barragens, estuários, oceanos, águas residuais (i.e., deve ser capaz de sobreviver nos vários tipos de água); 10. O microrganismo indicador deve ser inofensivo para o ser humano. Os indicadores clássicos de contaminação fecal são o grupo dos coliformes fecais e não fecais, o grupo dos enterococos fecais; Clostridium perfringens e o número de UFC a 22ºC e a 37ºC. 10

12 O grupo dos coliformes é constituído por bactérias da família Enterobacteriaceae, habitantes do aparelho intestinal do homem e de outros animais homeotérmicos. São bactérias Gram-negativas, em forma de bacilo e anaeróbias facultativas. Algumas são oxidase-positivas e crescem em condições aeróbias em meio de cultura seletivo contendo sais biliares; outras são capazes de fermentar lactose a 37ºC com libertação de gás e de ácido e outras são capazes de fazer a fermentação a 44.5ºC. A fermentação da lactose a 44.5ºC permite distinguir os coliformes não fecais (37ºC) dos coliformes fecais (44.5ºC). Nos coliformes fecais inclui-se, por exemplo, a bactéria Escherichia coli (Mendes, 2010). Os enterococos fecais são caracterizados pela capacidade de crescerem entre 10 e 45ºC, a ph 9.6, em meio de cultura contendo 6.5% de cloreto de sódio (NaCl), na presença de 40% de sais biliares e em concentrações de azida inibidoras do crescimento dos coliformes. São bactérias Gram-positivas que reduzem azul-de-metileno em 0.1% de leite e conseguem sobreviver a 60ºC durante 30 minutos. Nos enterococos fecais inclui-se, por exemplo, Enterococcus faecalis (Mendes, 2010). Clostridium perfringens é uma bactéria anaeróbia, esporulada, redutora de sulfito, Gram-positiva, em forma de bacilo, habitante do intestino do homem e de outros animais homeotérmicos. Esta bactéria tem interesse como indicador de poluição fecal antiga, devido ao seu longo tempo de permanência na água e à grande capacidade de sobrevivência dos seus esporos (Mendes, 2010). O número de UFC a 22ºC e a 37ºC não é um indicador específico de poluição fecal mas sim de enriquecimento por matéria orgânica facilmente degradável. As contagens de colónias são úteis para a avaliação do estado da água e dos processos de tratamento utilizados, por exemplo, nas ETARs. O principal interesse da contagem de colónias reside na possibilidade de detetar as alterações em relação ao histórico, baseando-se num controlo frequente e a longo prazo. A ocorrência de um aumento repentino do número de UFC pode significar que existe um foco de poluição. Devido ao aprofundamento dos estudos microbiológicos, atualmente utilizam-se, em substituição ou em adição aos indicadores clássicos, outros microrganismos, chamados novos indicadores. A bactéria Escherichia coli substituiu, na legislação atual, os coliformes fecais como indicadores de contaminação fecal. Esta bactéria apresenta uma grande diversidade de adaptações ao meio, podendo causar várias doenças que originam diarreias (Mendes, 2010). A bactéria Pseudomonas aeruginosa é outro dos chamados novos indicadores. Não é um habitante específico do intestino mas aparece em 12% da população. É uma bactéria oportunista, aeróbia, Gramnegativa, patogénica e com elevada resistência a antibióticos (Mendes, 2010). Existem outros microrganismos presentes na água que podem representar perigo para as populações humanas, como os vermes helmintas, alguns protozoários (e.g., Giardia, Cryptosporidium, Entamoeba, Acanthamoeba, ) e vírus, mas a legislação actual não prevê a sua análise de rotina (Mendes, 2010). Água destinada ao consumo humano Legislação aplicável Decreto-Lei 306/2007, de 27 de Agosto 11

13 Estabelece o regime da qualidade da água destinada ao consumo humano, procedendo à revisão do Decreto-Lei 243/2001, de 5 de Setembro, que transpôs para o ordenamento jurídico interno a Directiva 98/83/CE, do Conselho, de 3 de Novembro, tendo por objetivo proteger a saúde humana dos efeitos nocivos resultantes da eventual contaminação dessa água e assegurar a disponibilização tendencialmente universal de água salubre, limpa e desejavelmente equilibrada na sua composição. Define como água destinada ao consumo humano: Toda a água no seu estado original, ou após tratamento, destinada a ser bebida, a cozinhar, à preparação de alimentos, à higiene pessoal ou a outros fins domésticos, independentemente da sua origem e de ser fornecida a partir de uma rede de distribuição, de um camião ou naviocisterna, em garrafas ou outros recipientes, com ou sem fins comerciais; Toda a água utilizada numa empresa da indústria alimentar para fabrico, transformação, conservação ou comercialização de produtos ou substâncias destinados ao consumo humano, assim como a utilizada na limpeza de superfícies, objetos e materiais que podem estar em contacto com os alimentos, exceto quando a utilização dessa água não afeta a salubridade do género alimentício na sua forma acabada. Define os métodos de controlo da qualidade da água, estabelecendo a localização dos pontos de amostragem, as frequências mínimas de amostragem (variáveis consoante o volume de água fornecida; Anexo II do Decreto-Lei 306/2007), estabelecendo um controlo de rotina e um controlo de inspeção da qualidade da água. Localização dos pontos de amostragem A localização dos pontos de amostragem depende da proveniência da água (artigo 10º, número 2): No caso da água fornecida a partir de uma rede de distribuição, no ponto em que, no interior de uma instalação ou estabelecimento, sai das torneiras normalmente utilizadas para consumo humano; No caso da água fornecida a partir de fontanários não ligados à rede de distribuição, no ponto de utilização; No caso da água fornecida por entidades gestoras em alta, nos pontos de amostragem dos pontos de entrega aos respetivos utilizadores; No caso da água fornecida a partir de camiões, navios--cisterna e reservatórios não ligados à rede de distribuição, no ponto de utilização; No caso da água destinada à venda em garrafas e outros recipientes, com ou sem fins comerciais, no fim da linha de enchimento; No caso da água utilizada numa empresa da indústria alimentar, no ponto de utilização. Valores paramétricos Os valores paramétricos e os parâmetros microbiológicos que a água destinada ao consumo humano deve respeitar são divididos em duas partes, uma relativa à água fornecida por redes de distribuição, fontanários, camiões ou navios-cisterna, reservatórios e utilizada na indústria alimentar (Tabela 3.3) e outra relativa à água colocada à venda em garrafas ou noutros recipientes (Tabela 3.4). Tabela 3.3 Parâmetros microbiológicos e valores paramétricos para a água fornecida por redes de distribuição, fontanários, camiões ou navios-cisterna, reservatórios e água utilizada na indústria alimentar (Decreto-Lei 306/2007, anexo I, parte I). Parâmetro Valor paramétrico Unidade Escherichia coli (E. coli) 0 Número/100 ml Enterococos 0 Número/100 ml 12

14 Tabela 3.4 Parâmetros microbiológicos e valores paramétricos para a água colocada à venda em garrafas ou outros recipientes (Decreto-Lei 306/2007, anexo I, parte I). Parâmetro Valor paramétrico Unidade Escherichia coli (E. coli) 0 Número/250 ml Enterococos 0 Número/250 ml Pseudomonas aeruginosa 0 Número/250 ml Nº UFC a 22ºC 100 Número/mL Nº UFC a 37ºC 20 Número/mL Controlo da qualidade Os parâmetros microbiológicos a analisar nos controlos de rotina são os constantes da Tabela 3.5. No controlo de inspeção devem ser analisados os parâmetros constantes da tabela 3.1 ou 3.2, consoante a proveniência da água. Tabela 3.5 Parâmetros microbiológicos a analisar nos controlos de rotina (Decreto-Lei 306/2007, anexo II). Controlo de rotina 1 Controlo de rotina 2 Bactérias coliformes Clostridium perfringens, incluindo esporos Escherichia coli (E. coli) Número de colónias a 22 C Número de colónias a 37 C Pseudomonas aeruginosa Métodos analíticos de referência (Decreto-Lei 306/2007) Bactérias coliformes e Escherichia coli (E. coli): norma ISO Filtração por membrana, em duplicado, seguida de incubação em meio TTC Chapman agar durante 213 horas a 362ºC (coliformes) e 444ºC (E. coli). As colónias que crescem a 36ºC são consideradas coliformes fecais e as colónias que crescem a 44ºC são consideradas E. coli. Após a incubação, as colónias de várias espécies diferentes apresentam diferentes características: E. coli e Citrobacter spp. apresentam colónias amarelas com centro laranja; Enterobacter spp. forma colónias vermelhas ou amarelo-escuro com o centro laranja e o meio de cultura amarelo; Klebsiella spp. forma colónias vermelhas ou amarelas, sem coloração diferenciada no centro e o meio de cultura amarelo; As bactérias que não fermentam lactose formam colónias púrpuras e alteram a cor do meio de cultura para azul. Enterococos: norma ISO Filtração por membrana, em duplicado, seguida de incubação em meio de bílis azida agar durante 213 horas a 352ºC. As colónias de enterococos aparecem rodeadas de uma cor castanha. Transferência dos filtros com as colónias, sem inverter, para uma caixa de Petri com meio agar de bílis azida pré-aquecido a 44ºC e incubação a 440.5ºC durante 2 horas para confirmação imediata. As colónias que apresentem meio com coloração castanha-negra em seu redor são confirmadas como enterococos. Pseudomonas aeruginosa: norma EN ISO Filtração por membrana, em duplicado, seguida de incubação em meio CN agar durante horas. Contagem de todas as colónias que apresentem cor azul-esverdeada como sendo Pseudomonas aeruginosa. Exame das membranas sob radiação ultravioleta e contagem de todas as colónias que não 13

15 sejam azul-esverdeadas mas que emitam fluorescência como possíveis P. aeruginosa. Contagem de todas as colónias avermelhadas que não emitam fluorescência como possíveis P. aeruginosa. Para confirmação, repicagem das colónias que necessitam de confirmação para meio agar nutritivo durante 222 horas a 362ºC. Teste da oxidase a todas as colónias que eram inicialmente avermelhadas. Repicagem das colónias com reacção oxidase-positiva para meio B King agar durante 213 horas (mas o período de incubação pode prolongar-se por um máximo de 5 dias) a 362ºC. O crescimento das colónias é observado diariamente sob radiação ultra-violeta (UV). A presença de colónias de Pseudomonas aeruginosa revela-se, sob a radiação UV, pela emissão de fluorescência. Enumeração de microrganismos viáveis número de UFC a 22 C e a 37ºC: norma EN ISO 6222 Diluições decimais seguidas de inoculação por incorporação, de caixas de Petri, em quadruplicado, com meio de extrato de levedura agar. Incubação de duas caixas a 20-22ºC durante 3 dias e das outras duas a 37ºC durante 44 horas. Contagem de UFC. Clostridium perfringens (incluindo esporos) Filtração em membrana, em duplicado, seguida de incubação anaeróbia da membrana em m-cp agar a 44 C ± 1 C durante 21 ± 3 horas. Contagem das colónias amarelas opacas que passam a rosa ou vermelho após exposição, durante vinte a trinta segundos, a vapores de hidróxido de amónio. Águas para produção de água para consumo humano, para suporte de vida aquícola e águas de rega Legislação aplicável Decreto-Lei 236/98, de 1 de Agosto Estabelece normas, critérios e objetivos de qualidade com a finalidade de proteger o meio aquático e melhorar a qualidade das águas em função dos seus principais usos: utilização da água para consumo humano, para suporte de vida aquícola, para efeitos balneares (que passou a ser regulamentada pelo Decreto-Lei 135/2009, de 3 de Junho) e para rega. No que respeita à utilização da água para consumo humano, consideram-se três tipos: (i) águas doces superficiais destinadas à produção de água para consumo humano; (ii) águas subterrâneas destinadas à produção de água para consumo humano e (iii) águas de abastecimento para consumo humano (que passaram a ser regulamentadas pelo Decreto-Lei 306/2007). Águas doces superficiais e subterrâneas destinadas à produção de água para consumo humano As águas superficiais destinadas à produção de água para consumo humano são classificadas nas categorias A1, A2 e A3, de acordo com as normas de qualidade fixadas no anexo I do Decreto-Lei 236/98 (Tabela 3.6), a que correspondem esquemas de tratamento tipo distintos, definidos no anexo II do mesmo Decreto-Lei, para as tornar aptas para consumo humano: classe A1-tratamento físico e desinfeção, classe A2-tratamento físico e químico e desinfeção, classe A3-tratamento físico, químico de afinação e desinfeção. 14

16 Tabela 3.6 Parâmetros microbiológicos e valores máximos recomendáveis para as águas doces superficiais destinadas à produção de água para consumo humano (Decreto-Lei 236/98, anexo I). Valor máximo recomendável Parâmetro 2 Unidade A1* A2 A3 Coliformes totais Número/100 ml Coliformes fecais Número/100 ml Estreptococos fecais Número/100 ml Salmonelas 0 / 5000 ml 0 / 1000 ml - *Categoria também aplicável à qualidade das águas subterrâneas utilizáveis para produção de água para consumo humano. Consideram-se aptas para poderem ser utilizadas como origem de água para a produção de água para consumo humano as águas subterrâneas que apresentem qualidade superior ou igual à da categoria A1 (Tabela 3.6) das águas doces superficiais destinadas à produção de água para consumo humano, correspondendo-lhes o esquema de tratamento indicado no anexo II do Decreto-Lei 236/98 para aquela categoria de águas, com as devidas adaptações. Águas para suporte de vida aquícola Do conjunto de águas para suporte de vida aquícola (águas doces superficiais lóticas e lênticas - piscícolas; águas do litoral e salobras - conquícolas e píscicolas), apenas estão definidas normas de qualidade microbiológica para as águas do litoral e salobras com fins conquícolas (Tabela 3.7), controlo a exercer de no mínimo de três em três meses, não na água mas no corpo do molusco. As normas de qualidade das águas do litoral e salobras para fins aquícolas águas conquícolas têm por finalidade proteger e melhorar a qualidade dessas águas a fim de permitir a vida e o crescimento de moluscos (bivalves e gastrópodes), equinodermes, tunicados e crustáceos, contribuindo para a boa qualidade dos produtos conquícolas passíveis de consumo pelo homem. Tabela 3.7 Parâmetros microbiológicos e valores máximos recomendáveis para o corpo dos moluscos e para o líquido intervalar (Decreto-Lei 236/98, anexo II). Parâmetro Unidade VMR Coliformes fecais Número/100 ml Na legislação mais recente relativa à qualidade microbiológica de outros tipos de águas, os estreptococos fecais foram substituídos pelos enterococos um subgrupo mais resistente às condições do meio, nomeadamente a salinidade, os coliformes fecais foram substituídos por Escherichia coli e os coliformes totais deixaram de ser considerados indicadores específicos de poluição fecal e apenas são considerados indicadores de poluição. No entanto, a avaliação da qualidade microbiológica deste tipo de águas continua a ser ainda regulada pelo Decreto-Lei 236/98. 15

17 Águas de rega Os critérios e normas de qualidade das águas de rega visam proteger a saúde pública, a qualidade das águas superficiais e subterrâneas, as culturas que podem ser afectadas pela má qualidade das águas de rega e os solos cuja aptidão para a agricultura pode ser degradada pelo uso sistemático de águas de rega de má qualidade. Nas águas de rega, os parâmetros microbiológicos a considerar são os indicados na Tabela 3.8. Tabela 3.8 Parâmetros microbiológicos e valores máximos recomendáveis para a água de rega (Decreto-Lei 236/98, anexo XVI). Parâmetro Unidade VMR VMA Coliformes fecais Número/100 ml Ovos de parasitas intestinais Número/L - 1 Métodos analíticos de referência (Decreto-Lei 236/98) Coliformes totais, coliformes fecais e estreptococos fecais Podem usar-se dois métodos analíticos: filtração por membrana ou inoculação de tubos múltiplos. A temperatura de incubação é 37ºC 1ºC para os coliformes totais e para os estreptococos fecais e 44.5ºC 0.5ºC para os coliformes fecais. Na filtração por membrana, a inoculação é feita em meio sólido específico adequado para o efeito e contagem das colónias (UFC). As amostras devem ser diluídas ou, quando apropriado, concentradas a fim de que o número de colónias fique compreendido entre 10 e 100. Na inoculação de tubos múltiplos, para os coliformes totais e fecais utiliza-se o método de diluição com fermentação em substratos líquidos em pelo menos três tubos em 3 diluições, com subcultura dos tubos positivos em meios de confirmação e contagem em número mais provável (NMP). Para os estreptococos fecais, utiliza-se o método de diluição em caldo de azoteto de sódio em pelo menos três tubos para cada uma das três diluições e contagem em NMP. Salmonelas Concentração por filtração (através de membrana ou filtro apropriado). Sementeira em meio de préenriquecimento. Enriquecimento, subcultura em meio de isolamento. Identificação. Ovos de parasitas intestinais Contagem ao microscópio. Águas balneares Legislação aplicável Decreto-Lei 135/2009, de 3 de Junho Estabelece o regime jurídico de identificação, gestão, monitorização e classificação da qualidade das águas balneares e de prestação de informação ao público sobre as mesmas, transpondo para a ordem jurídica interna a Directiva n.º 2006/7/CE, do Parlamento Europeu e do Conselho, de 15 de Fevereiro, relativa à gestão da qualidade das águas balneares, e complementando a Lei da Água, aprovada pela Lei 58/2005, de 29 de Dezembro. 16

18 Define como águas balneares as águas superficiais, quer sejam interiores, costeiras ou de transição, tal como definidas na Lei da Água, aprovada pela Lei n.º 58/2005, de 29 de Dezembro, em que se preveja que um grande número de pessoas se banhe e onde a prática balnear não tenha sido interdita ou desaconselhada de modo permanente. A monitorização das águas balneares deve ser efetuada no prazo máximo de quatro dias a contar da data indicada no calendário de amostragem, o qual é estabelecido pelo INAG para cada época balnear, antes do seu início. O ponto de amostragem é estabelecido no local onde: (i) se preveja maior afluência de banhistas; ou (ii) de acordo com o perfil das águas balneares, onde exista maior risco de poluição, entendida como a presença de contaminação microbiológica ou outros organismos ou resíduos que afetem a qualidade das águas balneares e constituam um risco para a saúde dos banhistas. A monitorização deve ser efetuada com a frequência especificada no anexo II do Decreto-Lei 135/2009, sendo os resultados dessa monitorização utilizados na constituição dos conjuntos de dados sobre a qualidade das águas balneares. Os parâmetros microbiológicos a avaliar na avaliação da qualidade das águas balneares são os mesmos para as águas interiores (Tabela 3.9) e para as águas costeiras e de transição (Tabela 3.10), mas os valores diferem entre os dois tipos de água. Tabela 3.9 Valores paramétricos microbiológicos a observar na avaliação da qualidade das águas balneares interiores (Decreto-Lei 135/2009, anexo I). Qualidade Parâmetro Unidade Excelente Boa Aceitável Enterococos intestinais Número/100 ml Escherichia coli Número/100 ml Tabela 3.10 Valores paramétricos microbiológicos a observar na avaliação da qualidade das águas balneares costeiras e de transição (Decreto-Lei 135/2009, anexo I). Qualidade Parâmetro Unidade Excelente Boa Aceitável Enterococos intestinais Número/100 ml Escherichia coli Número/100 ml Ponto de amostragem, recolha e conservação das amostras As amostras deverão ser recolhidas 30 cm abaixo da superfície das águas e onde a sua profundidade seja no mínimo de 1 m. Os frascos a utilizar devem ser de material transparente e incolor (vidro, polietileno ou polipropileno), com capacidade mínima de 250 ml e devem encontrar-se estéreis. As amostras devem ser claramente identificadas com tinta indelével na amostra e no formulário relativo à amostra. As amostras de água devem, em todas as fases do transporte, ser protegidas da exposição à luz, em especial à luz direta do sol e conservadas a uma temperatura de cerca de 4ºC até à sua análise. Se for provável que o transporte para o laboratório demore mais de quatro horas, é obrigatório o transporte em frigorífico. O período de tempo decorrido entre a recolha da amostra e a realização da análise deve ser o mais curto possível, sempre que possível no mesmo dia e no prazo máximo de vinte e quatro horas. Métodos analíticos de referência (Decreto-Lei 135/2009) Enterococos intestinais: normas ISO ou ISO Consultar a secção relativa à análise das águas destinadas ao consumo humano, para as quais é referido o mesmo método. 17

19 Escherichia coli: normas ISO ou ISO Consultar a secção relativa à análise das águas destinadas ao consumo humano, para as quais é referido o mesmo método. Métodos gerais de análise microbiológica da água Para a pesquisa de coliformes, coliformes fecais, Escherichia coli, estreptococos/enterococos fecais e Clostridium perfringens existem dois métodos básicos de referência: o método da inoculação de meio líquido em tubos múltiplos com leitura do Número Mais Provável (NMP) e o método da filtração por membrana com inoculação de meio sólido. Na legislação portuguesa mais antiga o método de referência era o dos tubos múltiplos, mas na legislação mais recente o método de referência passou a ser o da filtração por membrana. Apesar desta alteração das normas legais, ambos os métodos possuem vantagens e desvantagens (Tabela 3.11). Tabela 3.11 Vantagens e desvantagens da filtração por membrana em relação à inoculação de tubos múltiplos e determinação do NMP. Vantagens da filtração por membrana 1. Tem boa reprodutibilidade 2. Os resultados são relativamente rápidos 3. Os filtros podem ser transferidos para diferentes meios de cultura 3. Permite o processamento de grandes volumes de amostra de forma a aumentar a sensibilidade do teste 4. As filtrações podem ser efetuadas no local de recolha da água 5. É um método mais económico que o NMP Desvantagens da filtração por membrana 1. As amostras com água muito turva impedem a filtração de grandes volumes 2. Quando existe grandes populações de outras bactérias, o crescimento pode ser demasiado elevado para permitir a contagem 3. Se existirem metais e fenóis presentes na amostra, podem adsorver aos filtros e inibir o crescimento bacteriano Inoculação de tubos múltiplos e determinação do NMP O método da inoculação de tubos múltiplos e determinação do número mais provável (NMP) pode ser usado para estimar o número de microrganismos viáveis presentes numa determinada população. A amostra é diluída (diluições sucessivas ou inoculação de volumes 10 vezes inferiores para a mesma quantidade de meio 3 ) inoculando-se um meio de cultura líquido, específico para o microrganismo a pesquisar, com um volume preciso dessas diluições. Desta forma, presume-se que os meios de cultura inoculados com as últimas diluições não vão apresentar qualquer crescimento (resultados negativos) e que ocorrerá crescimento nos tubos que tenham, pelo menos, um microrganismo viável. 3 A utilização de inóculos de 10 ml, 1 ml e 0.1 ml é semelhante a inocular a amostra e duas diluições decimais sucessivas dessa amostra. 18

20 Se a amostra e as diluições forem homogéneas e se houver um número suficiente de repetições, é possível tratar estatisticamente os resultados e generalizá-los à amostra inicial. Por cada diluição da amostra inoculam-se, geralmente, 3, 5 ou 10 séries de tubos com o referido meio de cultura (repetições). A própria designação do método aponta claramente para o carácter probabilístico que lhe deve ser atribuído. O número de tubos positivos nos quais ocorreu crescimento em cada diluição é utilizado para determinar o Número Mais Provável (NMP) desse microrganismo na amostra de água analisada, consultando uma tabela estatística (tabela de McGrady) semelhante à Tabela Tabela 3.12 Tabela de McCrady para a determinação do número mais provável (NMP) de microrganismos com base em 5 repetições de cada diluição. Número de tubos positivos nas diluições NMP / 100 ml de Número de tubos positivos nas diluições NMP / 100 ml de 10 ml 1 ml 0.1 ml amostra 10 ml 1 ml 0.1 ml amostra