CENTRO UNIVERSITÁRIO FUNDAÇÃO SANTO ANDRÉ JESSICA ALINE DA COSTA ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS EM CARTÕES DE BANCO

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1 CENTRO UNIVERSITÁRIO FUNDAÇÃO SANTO ANDRÉ JESSICA ALINE DA COSTA ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS EM CARTÕES DE BANCO SANTO ANDRÉ 2012

2 JESSICA ALINE DA COSTA ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS EM CARTÕES DE BANCO Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como exigência parcial para obtenção do grau de Licenciatura e Bacharelado em Ciências Biológicas à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras do Centro Universitário Fundação Santo André. Orientadora: Profª. Dra. Priscila Reina Siliano da Silva SANTO ANDRÉ 2012

3 Costa, Jessica Aline Isolamento e identificação de bactérias em cartões de banco /Jessica Aline. - Santo André, f. Trabalho de conclusão de curso Centro Universitário Fundação Santo André. Curso de Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dra. Priscila Reina Siliano da Silva. 1. Cartões de Banco 2. Microrganismos 3. Higiene.

4 Aprender é a única de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende." Leonardo da Vinci

5 Dedicatória Ao meu grande amigo Alex Jorge de Oliveira (in memoriam), uma das melhores pessoas que já conheci e que viverá para sempre em meu coração. Aos meus pais Luiza e Adão que com seu apoio incondicional me mostraram que o amor é a força mais poderosa do mundo. A minha irmã, amiga e companheira Bruna, que está sempre ao meu lado, a melhor companhia para se ter em todos os momentos, sempre fazendo me sentir melhor.

6 AGRADECIMENTOS A minha orientadora Priscila Reina Siliano pela atenção, compreensão e sabedoria dispensadas a mim durante o período de elaboração deste trabalho. Ao Professor Roberto Carlos Sallai pelo apoio e incentivo para a elaboração do trabalho, ajudando sempre que possível. A minha amiga Cibele Mello de Amaral pela ajuda no desenvolvimento do trabalho pratico e pelo apoio e carinho. A todos os meus amigos e colegas de sala, que com certeza plantaram um pedaço de si em meu coração. Mas, especialmente à Lívia, Viviane, Cibele, Luiz, Jessica, Gisele, Marcio, Valéria e Ariane. Pessoas antes desconhecidas e tão diferentes de mim, que me fizeram ver a vida com outros olhos, obrigada pela amizade! Aos meus amigos e companheiros de todas as horas, que me acompanhou em toda a minha trajetória, com paciência e incentivo, Camila, Carla, Noelle, Décimo, Allan, Flavia e Xavier. Que fez os meus dias mais felizes com muita diversão e alegria.

7 RESUMO O cartão de banco, chamado como dinheiro de plástico, é bastante manuseado, estando em contato com diversos microrganismos, tais como do ar, do solo, das mãos entre outros. O objetivo deste estudo é de isolar e identificar bactérias. Foi coletada uma amostra de 50 cartões, retirando assim o material a coletar e aplicando-o em Meios de cultura, para analise e identificação dos supostos microrganismos a ser encontrado. Pressupondo existência de microrganismos presentes nos cartões devido ao intenso manuseio relacionados com a falta de higiene. No meio Agar Sangue 100% das amostras foram positivas para bactérias Gram positivo e Catalase positivo, sento assim identificado o gênero Staphylococcus. em Agar MacConkey, assim negativando a presença de bactérias Gram negativas. Palavras chave: Cartões de banco. Microrganismos. Higiene.

8 LISTA DE ILUSTRAÇÃO FOTOGRAFIA Fotografia 01 Meio de cultura Agar Sangue com colônias bacterianas do gênero Staphylococcus sp e fungos

9 LISTA DE ILUSTRAÇÃO - TABELAS Tabela 01 Tabela de crescimento em Agar sangue Tabela 02 Tabela de crescimento em MacConkey... 26

10 LISTA DE ILUSTRAÇÃO - GRAFICOS Gráficos 01 Gráfico de crescimento em Agar sangue e MacConkey Gráficos 02 Amostras com crescimento e sem crescimento por Gêneros de Bactérias em Agar Sangue

11 SUMÁRIO 1. Introdução Objetivo Material e Metodologia Materiais Metodos Coleta Analise microbiana Analise por coloração de Gram Preparo dos esfregaços Fixação dos esfregaços Coloração de Gram Teste de Catalase Teste bioquímicos Análise dos testes bioquimicos Análise do meio EPM Análise do meio MILi Análise do meio Citrato de Simmons Identificação dos bactérias Resultados e Discussão Tabelas de Resultados Resultados e Discussão Considerações Finais Referências Anexo A... 37

12 10 1. INTRODUÇÃO O dinheiro é uma unidade de troca que expressa o preço, logo, é qualquer objeto com o qual seja possível comprar ou vender bens, mercadorias e serviços (RIORI, 2002). Desde as primeiras civilizações o homem busca por maneiras mais cômodas e eficazes de realizar transações comerciais. Inicialmente havia trocas de mercadorias, ou seja, trocava-se o excedente da produção por outra que tivesse valor equivalente, essa relação é suprimida pelo uso de moedas que posteriormente evoluíra para cédulas, cheques, e hoje os cartões eletrônicos, sendo essa a forma mais segura e simples, mediante aos avanços da tecnologia. A utilização de moedas e cédulas está sendo substituída paulatinamente por dinheiro de plástico. Segundo Rosalen (2009), é fato que os cartões plásticos estão presentes em nossas vidas mais do que percebemos. O cartão de PVC tem uma história relativamente recente, mas sua evolução nos processos de fabricação é significativamente relevante. O primeiro cartão de crédito, por exemplo, surgiu apenas em 1946, feito de papelão, foi usado para dar crédito em empréstimos aos clientes preferenciais de um banco americano. O seu uso para compras, só foi difundido 4 amos mais tarde, por acaso. Em 1950, surgiu a Dinners Club Card, primeira operadora de cartões de créditos do mundo. Um ano depois já contava com mais de (vinte mil) clientes. Somente em 1959, a American Express, desenvolveu um cartão feito de plástico. No mesmo ano desenvolveu um circulo fechado de informações e vendeu esse sistema para bancos de todo o mundo, tornado tendência mundial o consumo através deste tipo de operação. Posteriormente também entraram no mercado e ajudaram a difundir essa prática a Visa e a MasterCard. (GOMES, 2010). A principal matéria-prima para produção de cartões é o PVC. O Cloreto de polivinila é um material que se diferencia por não ser 100% feito de petróleo. Ele é constituído em 53% de cloro (derivado do cloreto de sódio) e 47% de eteno (derivado do petróleo). Este material é atóxico e resistente a ação de fungos e bactérias e também a reagentes químicos. Tem boa conservação, e de uma maneira geral resistente a condições climáticas adversas como alta exposição ao sol chuva,

13 11 vento e maresia. O processo produtivo pode ser resumido em 8 principais etapas de produção. São elas: Impressão, Soldagem, Laminação, Coste Primário, Corte Fino, Seleção de qualidade, Impressão Birô e Expedição. (GOMES, 2010). Os cartões, no geral, são produzidos em PVC branco ou transparente, também chamado de cristal de PVC. Outros materiais também podem ser utilizados, porém são menos comuns. (ROSALEN, 2009). O plástico (PVC) torna-se então habitat de diversas espécies microbianas que se proliferam podendo formar biofilmes. O fato de o cartão ser um objeto constantemente manuseado, apoiado em diversos locais, por vezes podendo cair ao chão, e hora ou outra entra em contato com o rosto por descuido de manuseio, torna-o grande foco para análise e identificação de bactérias, sendo possível encontrar microrganismos oriundos do ar, da terra, da mão, e até mesmo de gotícula de saliva eliminadas durantes a fala de uma pessoa. A presença destas bactérias é indicadora de Higiene-sanitária insatisfatória, sendo assim focar nos cartões como uma superfície que permitem o crescimento microbiano, podendo originar processos de adesão bacteriana e formação de biofilmes. Entretanto, a habilidade da bactéria em se aderir a superfície de contato de objetos compromete a higiene desses materiais. (PELCZAR JR, 1996). Sendo assim, este trabalho tem como objetivo avaliar a contaminação microbiana nos cartões bancários dos estudantes do Centro Universitário Fundação Santo André - SP.

14 12 2. OBJETIVO Isolar e identificar bactérias em cartões de bancos.

15 13 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Materiais Meio de Cultura MacConkey (Merk, Alemanha); Meio de Cultura Agar sangue (Probac, Brasil); de Cultura Agar Chocolate (Probac, Brasil); Enterokit B (Probac, Brasil) MILi, EPM e Citrato de Simmons; Água Oxigenada (H 2 O 2 ); Solução Salina, Safranina. 3.2 Métodos Coleta Para realizar as análises foi necessário mergulhar o swab (um swab estéril para cada cartão utilizado) em solução salina estéril (NaCl 0,9%) e passá-lo sobre o cartão, em toda a área do mesmo Análise microbiana Depois de realizar a coleta, o swab foi semeado em meio de cultura MacConkey e Agar sangue. Se for considerado o teste positivo em nos meios de cultura onde foi observado ao menos o crescimento de uma colônia bacteriana após incubação em estufa á 37 ºC durante24 horas. Para a identificação de bactérias crescidas em meio Agar sangue e Agar chocolate foi realizado o teste de coloração de Gram e teste de catalase, e em bactérias crescidas em meio MacConkey foi realizado teste com Enterokit B.

16 Análise por coloração de Gram Preparo dos esfregaços Com auxilio de uma alça de inoculação, previamente esterilizada, foi colocado uma gota de solução salina na superfície de uma lâmina de vidro. Por meio da alça de inoculação foi colocada nesta lâmina uma alíquota da cultura bacteriana, misturando-a a solução salina e deixando secar perto do fogo Fixação dos esfregaços Após secagem os esfregaços foi fixados expondo a lâmina cerca de 3 (três) vezes sobre a chama do bico de gás Coloração de Gram A lâmina foi colocada, após a fixação, num recipiente para coloração de Gram. A lâmina foi coberta por solução de violeta genciana por 1 (um) minuto. Após este período de tempo o corante foi desprezado no recipiente. Após esta etapa a lâmina foi coberta por lugol durante 1(um) minuto, sendo este corante também desprezado após este período de tempo. A lâmina após estas duas etapas foi inclinada e sobre ela foi despejado álcool etílico a 95%, até não haver desprendimento de corante, lavando a lamina em água corrente logo depois. Após lavagem a lâmina foi coberta por safranina por 30 (trinta) segundos e após este período, a lâmina foi lavada em água corrente e seca com papel toalha sem esfregar a lâmina. Após a coloração as lâminas foram observadas ao microscópio ao maior aumento (objetiva de imersão) com 1(uma) gota de óleo mineral. (SILIANO, 2009) Teste de Catalase Outro teste comumente utilizado para diferenciação de bactérias é o teste de catalase. A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 )

17 15 em oxigênio e água. Este teste é utilizado na diferenciação de membros dos gêneros Staphylococcus e Streptococcus. O teste foi realizado pela transferência de colônias para uma lâmina de microscopia e a adição de uma gota de água H 2 O 2 a 10%. O aparecimento imediato de borbulhamento na superfície da suspensão indicará reação positiva (desprendimento de O 2 ) Testes bioquímicos Para a identificação das espécies de bactérias obtidas no crescimento em meio MacConkey foi utilizados os testes bioquímicos do Enterokit B, que consiste dos meios: MILi, EPM e Citrato de Simmons (Anexo A). As inoculações nestes meios serão realizadas com agulha de platina a partir de uma colônia crescida em meio MacConkeye estes estão serão incubados à 37º C por 24 horas.

18 16 4. ANÁLISES DOS TESTES BIOQUÍMICOS 4.1 Análise do meio EPM Neste meio foi possível observar 5 tipos diferentes reações bioquímicas: produção de gás, fermentação da glicose, produção de H 2 S, uréase e L- triptofanodesaminase (LTD). A produção de gás foi detectada através do aparecimento de bolhas ou do deslocamento do meio de cultura do fundo do tubo. Para fermentação da glicose o meio apresenta coloração amarela pela alteração do ph. A produção de H 2 S foi positiva quando ocorrer enegrecimento do meio. A hidrólise da uréia foi observada através da coloração, e considerada positivo os meios que tiverem aparecimento da cor azul se estendendo para a base do meio. A desaminação do triptofano (LTD) também foi observada pela coloração, e considerado positivo os meios que tiverem o aparecimento de cor verde-garrafa na superfície. 4.2 Análise do meio MILi No meio MILi foi possível observação de 3 reações bacterianas: motilidade, produção de indol e lisina descarboxilase. A motilidade foi observada através do crescimento da bactéria além da linha picada com a agulha de platina. A descarboxilação da lisina foi observada através da coloração, onde serão considerados positivos os testes que adquirirem a cor púrpura. Para analisar a produção de indol foi necessário a utilização do reativo de Kovacs, em que foram acrescentados 4 gotas na superfície do meio, considerados positivo o meio que teve a formação de um anel vermelho na parte superior. 4.3 Análise do meio Citrato de Simmons Foram observados a coloração e considerado os testes positivos sempre que ocorrer o aparecimento da cor azul na superfície dos meios, indicando que a

19 bactéria é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono para seu metabolismo Identificações das bactérias Com os resultados obtidos e com o auxílio do apêndice A fornecida pela empresa Probac, fabricante do Enterokit B, foi possível fazer as identificações das espécies.

20 18 5. RESULTADOS E DISCUSÃO Tabela 01: Crescimento em Agar Sangue Agar sangue Catalise Gram Forma Espécie Amostra 1 Colônias branca, amarela e bege sem halo de Amostra 2 Colônias brancas e bege sem halo de Amostra 3 Colônias brancas e amarelas sem halo de, com crescimento de fungo no meio Amostra 4 Colônias brancas e amarelas sem halo de, com crescimento de fungo no meio Amostra 5 Colônias brancas e amarelas sem halo de

21 Amostra 6 Colônias brancas sem halo de, com crescimento de fungo no meio 19 Amostra 7 Colônias brancas e amarelas sem halo de Amostra 8 Colônias brancas e amarelas sem halo de Amostra 9 Colônias brancas e poucas amarelas sem halo de, com crescimento de fungo no meio Amostra 10 Colônias brancas e amarelas sem halo de, com crescimento de fungo no meio Amostra 11 Colônias amarelas e bege sem halo de

22 Amostra 12 brancas, amarelas e beges sem halo de, com crescimento de fungo no meio 20 Amostra 13 bege sem halo de Amostra 14 brancas e amarelas sem halo de Amostra 15 amarelas sem halo de Amostra 16 beges sem halo de Amostra 17 beges sem halo de Amostra 18 beges sem halo de

23 Amostra 19 beges e amarelas sem halo de 21 Amostra 20 beges sem halo de Amostra 21 brancas sem halo de Amostra 22 brancas e amarelas sem halo de Amostra 23 brancas sem halo de Amostra 24 brancas sem halo de Amostra 25 brancas e amarelas sem halo de Amostra 26 beges sem halo de

24 Amostra 27 beges e amarelas sem halo de 22 Amostra 28 beges sem halo de Amostra 29 beges sem halo de Amostra 30 brancas e beges sem halo de Amostra 31 brancas e amarelas sem halo de Amostra 32 brancas sem halo de Amostra 33 brancas sem halo de Amostra 34 brancas sem halo de

25 Amostra 35 brancas e amarelas sem halo de 23 Amostra 36 brancas e amarelas sem halo de Amostra 37 brancas sem halo de Amostra 38 brancas sem halo de Amostra 39 brancas e amarelas sem halo de Amostra 40 brancas sem halo de Amostra 41 beges sem halo de Amostra 42 beges sem halo de

26 Amostra 43 amarelas sem halo de 24 Amostra 44 amarelas sem halo de Amostra 45 brancas sem halo de Amostra 46 beges sem halo de Amostra 47 amarelas sem halo de Amostra 48 brancas sem halo de Amostra 49 brancas sem halo de Amostra 50 amarelas sem halo de

27 25 Como observado na tabela 01, 100% das amostras foram positivas para bactérias Gram positivo e Catalase positivo, sento assim identificado o gênero Staphylococcus.

28 26 Tabela 02: Crescimento em Agar MacConkey Agar MacConkey Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7 Amostra 8 Amostra 9 Amostra 10 Amostra 11 Amostra 12 Amostra 13 Amostra 14

29 27 Amostra 15 Amostra 16 Amostra 17 Amostra 18 Amostra 19 Amostra 20 Amostra 21 Amostra 22 Amostra 23 Amostra 24 Amostra 25 Amostra 26 Amostra 27 Amostra 28 Amostra 29

30 28 Amostra 30 Amostra 31 Amostra 32 Amostra 33 Amostra 34 Amostra 35 Amostra 36 Amostra 37 Amostra 38 Amostra 39 Amostra 40 Amostra 41 Amostra 42 Amostra 43 Amostra 44 Amostra 45

31 29 Amostra 46 Amostra 47 Amostra 48 Amostra 49 Amostra 50 em Agar MacConkey, assim negativando a presença de bactérias Gram negativas.

32 30 O gráfico a seguir demonstra o numero de cartões de banco que apresentaram crescimento de bactéria, em meio Agar Sangue, Agar Chocolate e Agar MacConkey. Crescimento de bactérias 100% 0% Agar sangue e Agar Chocolate Agar MacConkey Gráfico 01 Gráfico de crescimento em Agar sangue e MacConkey Ao Observar este gráfico chegamos a conclusão de que a taxa de cartões de bancos contaminados por bactéria é de 100%. Sendo o crescimento de colônias em meio de cultura com Agar Sangue e Agar Chocolate e nenhum crescimento em Agar MacConkey. Observando o gráfico a seguir podemos verificar o gênero bacteriano mais encontrado nas amostras retiradas de cartões de bancos.

33 31 Crescimento de bactérias por gênero - Agar Sangue e Agar chocolate 100% 0% Staphylococcus sp Outras espécies de bacterias Gráfico 02 - Amostras com crescimento e sem crescimento por Gêneros de Bactérias em Agar Sangue. A bactéria com prevalência total foi a do gênero Staphylococcus sp, que são células esféricas Gram positivas que geralmente se dispõem em cachos irregulares semelhantes a cachos de uva, fermentando carboidratos e produzindo pigmentos que variam de branco a amarelo intenso. Os fungos e Staphyloococcus são microrganismos comumente presentes na pele, podendo ter um papel potencial patogênico. As espécies encontradas no meio Agar Sangue e Agar Chocolate podem ser: Staphyloococcus aureus, Staphylococcus epidermidis ou Staphylococcus saprophyticus. O Staphyloococcus aureus embora encontrado com relativa freqüência como membro da microbiota normal do corpo humano, o staphylococcus aureus é uma das bactérias patogênicas mais importantes, uma vez que atua como agente de uma ampla gama de infecções, variando desde aquelas localizadas geralmente superficiais até algumas disseminadas com elevada gravidade. Em geral, as doenças causadas por esse microorganismo podem ser classificadas como somente superficiais invasivas ou tóxicas e invasivas. Sua importância clinica tem variado ao longo dos anos tendo crescido particularmente devido ao aumento na ocorrência de

34 32 infecções hospitalares graves causadas por amostras multi resistentes. (TRABULSI, 2008). A S. aureus pode causar diversos casos clinico que é dividido em três tipos: as infecções superficiais, tais como os abscessos cutâneos e as infecções de feridas; as infecções sistêmicas, tais como osteomielite, miosite tropical, endocardite, pneumonia e septicemia e os quadros tóxicos, tais como síndrome do choque tóxico, síndrome da pele escaldada e a intoxicação alimentarem. O Staphylococcus aureus pode ser encontrado em várias partes do corpo, como fossas nasais, garganta, trato intestinal e pele. (TRABULSI, 2008). O Staphylococcus epidermidis é uma espécie, dentre aquelas pertencentes a categoria dos estafilococos coagulase-negativos, mais frequentemente encontrada na microbiota normal ou como causa de infecções em seres humanos. Como um dos principais membros da microbiota normal do corpo humano, o S. epidermidis está regularmente presente na pele e nas mucosas e geralmente, é a espécie que predomina na pele de indivíduos normais. O S. epidermidis como patógeno está relacionado a sua capacidade de aderir a superfícies de polímeros formando biofilmes. (TRABULSI, 2008). O Staphylococcus saprophyticus, é, depois da Escherichie coli, o agente mais comum de infecção urinária em mulheres na faixa de 20 a 40 anos de idade. Pode também causar infecções urinarias no homem. Principalmente depois dos 50 anos. A patogenicidade está relacionada à sua capacidade de aderir as células do epitélio urinário. S. saprophyticus é um habitante normal da região periuretral do homem e mulheres. Todas são membros da microbiota normal da pele e mucosa, mas podem causar infecções em diferentes órgãos e tecidos. Como o Staphylococcus saprophyticus, são tipicamente bactérias oportunistas associadas, e gerais, com infecções hospitalares. (TRABULSI, 2008).

35 33 Fotografia 1 Meio de cultura Agar Sangue com colônias bacterianas do gênero Staphylococcus sp e fungos. Já em Agar MacConkey não foram encontradas nenhum gênero de bactéria, negativando a presença de bactérias Gram negativas. A identificação de fungos não foi o objetivo do estudo, porem 6 (seis) cartões de bancos apresentaram crescimento de fungos em meio de cultura Agar Sangue. Os fungos são organismos comuns em ar, água e pele e podem também apresentar potencial patógeno. (TORTORA, 2005). Não há na literatura trabalho semelhantes ao presente estudo. Uma estratégia de ações preventivas simples é a descontaminação de cartões de banco com álcool contendo desinfetantes, ou álcool a 70%, pode reduzir o numero de possíveis infecções causadas por todos estes microorganismos.

36 34 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS Neste estudo conclui-se que: Todos os cartões de bancos (100%) estão contaminados por algum tipo de bactéria. A bactéria com prevalência total foi a do gênero Staphylococcus sp. Em 100% das amostras em Agar Sangue e Agar Chocolate houve crescimento de bactérias Gram positiva do gênero Staphylococcus sp. Em todas as amostras em Agar MacConkey não houve nenhum crescimento de Bactérias, evidenciando a ausência de Gram negativa.

37 35 REFERÊNCIAS GOMES, R. N. S. Análise e mapeamento do processo produtivo de uma fábrica de cartões de PVC. Trabalho de conclusão de curso de graduação Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Disponível em: < 1>. Acesso em: 17 nov MURRAY, P. R. et al. Microbiologia médica. 6. Ed. Espanha. Editora Gea Consultoria editorial SLL, p. PELCZAR JR., M.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia, conceitos e aplicações. 2. Ed., vol.1, Editora Makron Books p. RIORI, A. O que é dinheiro?. Domínio feminino Disponível em: < Acesso em: 17 nov ROSALEN, S. Todas as fases de produção dos cartões plásticos. Revista tecnologia gráfica, Ed. 67, SILIANO, P. R. Microbiologia. Apostila 3 ano Centro Universitário Fundação Santo André, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras

38 TRABULSI, L. R., ALTERTHUM, F. Microbiologia. 5 Edição. São Paulo: Atheneu, p. 36

39 37 ANEXO A - Tabela para identificação bacteriana Probac do Brasil BR PROBAC DO BRASIL Produtos Bacteriológicos Ltda. MEIOS PARA IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA PROBAC DO BRASIL ENTEROKIT B Indicações: O Enterokit B consiste dos seguintes meios: EPM, MILi e Citrato de Simmons. O meio EPM contem os testes de fermentacao e producao de gas em glicose, producao de H2S, hidrolise da ureia e desaminacao do triptofano. O meio MlLi contem os testes de motilidade, indol e descarboxilacao de lisina. O Citrato de Simmons oferece o teste de utilizacao do citrato como unica fonte de carbono. Os tres meios totalizam 8 testes que somados ao da fermentacao da lactose na placa de isolamento, permitem identificar com fidelidade a grande maioria das enterobacterias isoladas de especimes clinicos. Procedimento: Tocar a colonia com agulha de platina e semear os 3 meios na seguinte ordem: Citrato, EPM e MlLi. Para inocular o meio de Citrato deslizar a agulha pelo centro estriando toda a superficie inclinada. No meio EPM introduzir a agulha ate o fundo do tubo e ao retira-la semear a superficie do meio enquanto o MILi deve ser semeado por picada central que deve atingir o fundo do tubo. Incubar o Enterokit a 35 C ± 2 C com as tampas semi-rosqueadas e fazer a leitura apos 18 horas a 24 horas. Leitura e interpretação: 1. Meio EPM

40 38 Produção de gás: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio de cultura do fundo do tubo. Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade. Hidrólise da uréia: Aparecimento de cor azul ou verde azulada (reacao fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou nao. Desaminação do triptofano (LTD): Aparecimento de cor verde-garrafa na superficie do meio. 2. Meio MlLi Motilidade (MOT): A bacteria movel cresce alem da linha de picada. A imovel somente nesta linha. Descarboxilação da lisina: Quando a lisina e descarboxilada o meio adquire cor Púrpura acentuada ou discreta. Quando o aminoacido nao e utilizado, o meio adquire cor amarelada nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre que o meio nao estiver amarelo. Produção de indol: Adicionar 3 a 4 gotas do reativo de Kovacs a superficie do meio e agitar levemente. Quando a bacteria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não produz, o reativo mantem sua cor inalterada. 3. Meio Citrato de Simmons A utilizacao do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superficie do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor do meio nao sofre alteracao. Precauções: Apos o uso, o produto devera ser descartado conforme as recomendacoes vigentes para residuos de serviços de saude. Apresentação: Caixa com 16 conjuntos e um frasco de Reativo de Kovacs. Conservação: Manter em temperatura ambiente entre 10o e 25oC (local fresco). Validade: 6 meses. SOMENTE PARA USO DIAGNOSTICO IN VITRO Rev: 02 Rua Jaguaribe, 35- Santa Cecília - São Paulo - SP - CEP / Ltda.

41 39 SISTEMA NUMÉRICO PARA ENTEROKIT B A Probac do Brasil oferece aos usuários do Enterokit B um sistema numérico para facilitar a identificação das enterobacterias. As 8 reações bioquimicas do Enterokit B somadas ao da fermentacao da lactose na placa de isolamento foram agrupadas em 3 conjuntos de provas. A soma de cada um destes conjuntos produz um algarismo, de modo que o resultado produz um numero de 3 digitos, que identifica uma espécie bacteriana. Os 3 conjuntos de provas e seus valores sao: PRIMEIRO ALGARISMO (A) SEGUNDO ALGARISMO (B) TERCEIRO ALGARISMO (C) Lactose 4 Urease 4 Indol 4 Gas 2 LTD 2 Lisina 2 H2S 1 MOT 1 Citrato 1 Observações: 1) Para a interpretação das provas ver item Leitura e interpretação. 2) Quando a reação da cepa investigada e positiva (+), colocamos o numero correspondente. Exemplos: Urease + = 4, Lisina + = 2. Se a reação e negativa (-), colocamos para a mesma o valor 0. 3) Em seguida somamos os valores obtidos em cada serie. O valor de A indica o primeiro algarismo, o valor de B o segundo e o valor de C o terceiro algarismo. Por exemplo, uma cepa que apresente o seguinte resultado bioquímico: Lactose - 0 Urease + 4 Indol - 0 Gas - 0 LTD + 2 Lisina - 0 H2S + 1 MOT + 1 Citrato Terá o numero 171 que corresponde na relação a bacteria Proteus mirabilis. 4) Quando no numero encontrado existir mais de uma espécie bacteriana, deverão ser realizadas provas complementares como as do Enterokit C. 5) Também deverão ser usadas provas complementares quando o resultado obtido corresponde a um numero nao existente na tabela.

42 40 NÚMERO ESPÉCIE BACTERIANA 000 Shigella sonnei - Yersinia pestis - Shigella spp 004 Shigella spp - Yersinia enterocolitica - Escherichia coli 006 Escherichia coli 011 Citrobacter freundii 012 Hafnia alvei 013 Serratia marcescens - Hafnia alvei 014 Escherichia coli 015 Citrobacter diversus 016 Escherichia coli 035 Providencia stuartii - Providencia alcalifaciens 040 Yersinia pseudotuberculosis - Yersinia enterocolitica 044 Yersinia enterocolitica 051 Citrobacter freundii 053 Serratia marcescens 055 Citrobacter diversus 070 Proteus penneri 074 Morganella morganii 075 Providencia stuartii - Providencia rettgerii 111 Citrobacter freundii 112 Salmonella Typhi 113 Salmonella spp 151 Citrobacter freundii 170 Proteus mirabilis - Proteus penneri 171 Proteus mirabilis 174 Proteus vulgaris 175 Proteus vulgaris 202 Hafnia alvei 204 Escherichia coli 206 Escherichia coli 210 Salmonella Paratyphi A - Serratia liquefaciens 211 Citrobacter freundii - Serratia liquefaciens

43 Hafnia alvei - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens 213 Serratia marcescens - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens 214 Escherichia coli 215 Citrobacter diversus 216 Escherichia coli 235 Providencia alcalifaciens 251 Citrobacter freundii 253 Serratia marcescens 255 Citrobacter diversus 270 Proteus penneri 274 Morganella morganii 310 Salmonella Paratyphi A 311 Citrobacter freundii 312 Salmonella Choleraesuis 313 Salmonella Choleraesuis - Salmonella spp 316 Edwardsiella tarda 351 Citrobacter freundii 370 Proteus mirabillis - Proteus penneri 371 Proteus mirabillis 374 Proteus vulgaris 375 Proteus vulgaris 404 Escherichia coli 406 Escherichia coli 410 Serratia liquefaciens 411 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae - Serratia sp. 412 Serratia liquefaciens 413 Serratia sp 414 Escherichia coli 415 Citrobacter diversus 416 Escherichia coli 417 Serratia odorifera 443 Klebsiella pneumoniae

44 Klebsiella oxytoca 451 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae 455 Citrobacter diversus 511 Citrobacter freundii 551 Citrobacter freundii 604 Escherichia coli 606 Escherichia coli 607 Klebsiella oxytoca 610 Serratia liquefaciens 611 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae - Serratia sp 612 Serratia liquefaciens 613 Enterobacter aerogenes - Serratia sp 614 Escherichia coli 615 Citrobacter diversus 616 Escherichia coli 643 Klebsiella pneumoniae 647 Klebsiella oxytoca 651 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae 655 Citrobacter diversus 711 Citrobacter freundii 751 Citrobacter freundii Referências bibliográficas: 1. Ewing, W. H., Edwards and Ewing s Identification of Enterobacteriaceae, 4th edition. Elsevier Science. Publishing Co., Inc., N. York. 2. Toledo, M. R. F.; Fontes, C. F. & Trabulsi, L. R., EPM - Uma modificação do meio de Rugai e Araujo, para a realizacao simultanea dos testes de producao de gas a partir de glicose, H2S, urease e triptofano desaminase. Rev. Microbiol., 13: Toledo, M. R. F.; Fontes, C. F. & Trabulsi, L. R., MILi - Um meio para a realizacao dos testes de motilidade, indol e lisina descarboxilase. Rev. Microbiol., 13:

45 43 4. Farmer III, J. J. e cols Biochemical Identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol., 21: