RECUPERAÇÃO DE PLANTAS DE BATATA-DOCE LIVRES DE VÍRUS A PARTIR DA REGENERAÇÃO DIRETA DE ÁPICES CAULINARES 1

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1 209 RECUPERAÇÃO DE PLANTAS DE BATATA-DOCE LIVRES DE VÍRUS A PARTIR DA REGENERAÇÃO DIRETA DE ÁPICES CAULINARES 1 Antonio Carlos Torres 2,DjalmaM.C.Teixeira 2, Antonio W. Moita 2, Magnólia de Araújo Campos 3 Embrapa/CNP Hortaliças, CP 218, Brasília, DF, , Brasil. RESUMO - Um protocolo eficiente para a obtenção direta e rápida de plantas de batata-doce (Ipomoea batatas L. (Lam)) livres de vírus, sem formação de calo, foi estabelecido. Ápices caulinares com um primórdio foliar foram desenvolvidos em meio líquido contendo sais minerais de MS e, em µm: sacarose, ; i-inositol, 554,9; tiamina.hcl, 2,96; piridoxina.hcl, 0,24; ácido nicotínico, 0,40; glicina, 2,66; e ácido giberélico, 5,8, sob agitação orbital de 0,175g. As plantas obtidas foram indexadas via enxertia em Ipomoea setosa e microscopia eletrônica. De um total de 60 plantas amostradas, 71% apresentaram-se livres de vírus. Termos adicionais para indexação: Ipomoea batatas, micropropagação, morfogênese RECOVERY OF VIRUS-FREE PLANTS OF SWEET POTATO THROUGH DIRECT REGENERATION OF SHOOT TIP ABSTRACT- An efficient protocol for direct production of virus-free plants of sweet potato (Ipomoea batatas L. (Lam)), without callus formation, was developed. Shoot tip with one leaf primordium grew better in liquid medium consisting of MS salts and, in µm: sucrose, 87,639; i-inositol, 554.9; thiamine.hcl, 2.96; pyridoxine.hcl, 0.24; nicotinic acid, 0.40; glycine, 26.04; and giberellic acic 5.8. The cultures were maintained on orbital shaker at 0.175g. The plants were indexing through grafting in Ipomoea setosa and by eletronic microscopy. From 60 plants surveyed 71% was virus-free. Additional index terms: Ipomoea batatas, micropropagation, morphogenesis. INTRODUÇÃO A utilização das técnicas de cultura de tecidos, principalmente a de cultura de ápices caulinares, tem permitido a obtenção de plantas de batata-doce de alta qualidade sanitária, a partir de genótipos 1 Recebido em 20/09/1996 e aceito em 07/11/ Pesquisadores da Embrapa/CNP Hortaliças. 3 Bolsista do CNPq/RHAE infectados com vírus. Estas plantas têm demonstrado uma maior produtividade em relação às infectadas, além de possibilitar o intercâmbio internacional de germoplasma. Os trabalhos iniciais de regeneração e recuperação de plantas livres de vírus nesta espécie, foram desenvolvidos por Nielsen (1960) e Mori (1971). Desde então, diversos protocolos de regeneração já foram publicados, variando, basicamente, a combinação hormonal utilizada (Over de Linden & Elliot, 1971; Alconero et al., 1975; Kuo et al., 1985; Dodds & Ng, 1988; Gama, 1988; Peters et al., 1989; Carvalho et al., 1990). Os meios de cultura básicos mais recomendados, nestes trabalhos, foram constituídos de sais minerais de B5 (Gamborg et al., 1968) ou MS (Murashige & Skoog, 1962), normalmente solidificados com ágar (Kuo et al., 1985; Gama, 1988; CIP, 1987; Jarret, 1993; Zamora & Gruezo, 1993). No entanto, uma desvantagem foi a formação de calo freqüentemente em todos estes meios, visto que o calo pode retardar o desenvolvimento da parte aérea e, dependendo do genótipo, pode originar brotações diretamente deste tecido (Zamora & Gruezo, 1993). Um protocolo eficiente e aplicável a diferentes genótipos para a regeneração direta de plantas a partir da cultura de ápice caulinar, ainda não foi descrito para a batata-doce. O objetivo deste trabalho foi a otimização de um meio para a obtenção direta e, em alta freqüência, de plantas de batata-doce livres de vírus, destinadas à manutenção in vitro de germoplasma elite, propagação rápida, produção comercial, intercâmbio e pesquisa. MATERIAL E MÉTODOS Plantas de batata-doce (Ipomoea batatas L. (Lam)) das cultivares Brazlândia Roxa, Princesa, Jewel, White Star e do genótipo CNPH 186, cultivadas em casa de vegetação, foram utilizadas como fonte de explantes. Os ápices caulinares das ramas foram eliminados e, após 7 dias, segmentos nodais, com aproximadamente 20 mm de comprimento, contendo

2 210 uma gema lateral, foram retirados e desinfestados com solução de hipoclorito de sódio 0,5%, durante 10 minutos e, em seguida, lavados com água destilada autoclavada. Meristemas com um primórdio foliar foram excisados das gemas laterais e colocados individualmente, em frascos contendo meio nutritivo. O meio básico de cultivo continha macro e microelementos de Murashige & Skoog (1962) e, em µm: sacarose, ; i-inositol, 554; tiamina.hcl, 2,96; piridoxina.hcl, 0,24; ácido nicotínico, 0,40; e glicina, 26,60. A este meio foi adicionado, respectivamente, combinações de ácido giberélico (GA 3 ) a 0,0; 1,45; 2,9 e 5,8µM e cinetina a 0,0; 2,3; 4,6 e9,3µm. O ph dos meios líquidos foi ajustado para 5,0. Os meios foram distribuído em quantidades de 3 ml por frasco de base quadrada de dimensões 35 x 35mm e altura 65 mm. Os frascos foram fechados com tampas de polipropileno e autoclavados a 120 o C e 1,05 x 105 KPa, durante 15 minutos. As culturas foram mantidas, sob agitação orbital continua de 0,175g (125rpm, raio 10mm), em câmara de crescimento, com densidade de fluxo de fotons fotossintéticamente ativos de 64 µmol m -2 s -1, fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 27 o C. A avaliação foi feita após 45 dias de inoculação através da determinação do número de plantas regeneradas por tratamento. O delineamento foi o inteiramente casualizado, com a parcela experimental constituída de 10 tubos de ensaio contendo 1 explante/tubo, com quatro repetições, totalizando 40 explantes por tratamento. Para a análise estatística, os dados foram transformados para arco seno, onde p é a percentagem de plantas regeneradas, de acordo com Snedecor & Cochran (1980). A indexação das plantas para vírus foi realizada através de enxertia em Ipomoea setosa. Plantas produzidas no meio básico suplementado com 5,8µM de GA 3 (12 de cada genótipo), foram seccionadas ao meio e as porções apicais e basais foram transferidas para meio básico contendo 2,2µM de benziladenina (BA), para o desenvolvimento dos sistemas caulinar e radicular, originando duas plantas idênticas in vitro. Uma das duplicatas foi transplantada para vaso e indexada via planta indicadora. As plantas que não apresentaram sintomatologia de viroses foram analisadas em microscópio eletrônico (JEOl 100 C) para detecção de partículas virais, de acordo com o método de leaf-dip combinada com contrastação negativa (Kitajima, 1965). regenerar propágulos livres de vírus. Aliado a isto, na maioria dos casos, as células do meristema apical mantêm a estabilidade genética (Grout, 1990), preservando assim a identidade do genótipo regenerado. Em adição, este tecido apresenta a característica de permanecer embriônico (Fahn, 1967; Cutter, 1978), o que lhe confere um alto potencial morfogenético. Efeito do meio líquido - Observou-se a formação de parte aérea e do sistema radicular em meio líquido, sem o desenvolvimento de um calo (Fig. 1). Isto é uma vantagem em relação aos trabalhos descritos na literatura, para a recuperação de plantas de batata-doce livres de vírus, que utilizam rotineiramente, meio de cultura solidificado com ágar (Nielsen,1960; Mori,1971; Over de Linden & Elliot, 1971; Alconero et al., 1975; Kuo et al., 1985; Dodds & Ng, 1988; Gama, 1988; Peters et al., 1989; Carvalho et al., 1990; Zamora & Gruezo, 1993). Este agente solidificante tem uma composição indefinida, podendo alterar as características químicas e físicas do meio, afetando diretamente os tecidos e células cultivadas (Kohlembach & Wernicke, 1978 citados por Szabados et al., 1993). Além do mais é um componente caro. Em batata-doce, a sua utilização favorece a formação de um calo nos explantes de ápices caulinares (Peters et al., 1989; Zamora & Gruezo, 1993). Elliot (1969) citado por Jarret (1993), observou que meristemas de batata-doce cultivados em meio MS solidificado com ágar produziram maior quantidade de calos do que aqueles inoculados, em suportes de papel de filtro, em meio líquido. A formulação líquida aqui utilizada, mesmo sem pontes de papel de filtro, evitou a formação de calo no cultivo de ápices caulinares, e estes desenvolveram-se diretamente em propágulos, economizando tempo e insumos. Não foi necessário a alteração dos constituintes básicos do meio líquido. Apesar do cultivo ter sido mantido sob agitação contínua, notou-se que, mesmo estacionário, os explantes desenvolveram-se e não apresentaram vitrificação. Entretanto, a utilização de meio líquido pode implicar na necessidade de modificação da concentração de nutrientes e hormônios e, devido à baixa concentração de oxigênio, dentro do líquido, haver a necessidade de alguma forma de aeração (Hussey, 1986). Além disso, certas espécies são mais sensíveis à vitrificação quando cultivadas em meio líquido. Efeito da cinetina e GA 3 - Em meio desprovido de GA 3 e/ou cinetina não ocorreu desenvolvimento dos explantes, sugerindo que a suplementação com estas RESULTADOS E DISCUSSÃO Na propagação in vitro de plantas, a utilização de explante constituído do meristema apical com um ou substâncias, individualmente ou em combinação, é necessária (Tabela 1). A adição isolada de 2,3µM de cinetina ao meio, promoveu o mesmo crescimento e desenvolvimento dos propágulos que 1,4µM dega 3, dois primórdios foliares tem a vantagem, em geral, de em todas as cultivares. Não houve resposta

3 211 FIGURA 1- Plantas de batata-doce White Star desenvolvidas a partir de ápices caulinares, em meio liquido suplementado com 1,45; 2,90 e 5,80µM dega 3. significativa com o aumento da concentração de cinetina, até 9,3µM. O GA 3 nas concentrações de 2,9 e 5,8µM, isoladamente, promoveu a formação de propágulos de maior tamanho do que nos níveis de cinetina de 4,6 e 9,3µM. A adição combinada de cinetina e GA 3 propiciou o crescimento de 50-70% dos explantes, contrastando com os 75-90% obtidos com o uso apenas de GA 3 (Tabela 1). Zamora & Gruezo (1993) relataram que a utilização de 0,46µM de cinetina e 0,288µM dega 3 no meio MS solidificado propiciou a regeneração de 89 a 96% dos meristemas inoculados, em 8 a 9 semanas de cultivo. A formulação contendo 5,8µM dega 3 propiciou o desenvolvimento mais rápido dos explantes, formando plantas com até 40 mm de altura, em 50 dias de cultura (Figura 1). Neste meio foram observadas folhas emergentes já aos 10 dias após a inoculação. Posteriormente, ocorreu a diferenciação do sistema radicular e seu desenvolvimento, juntamente com a parte aérea. Plantas também foram produzidas em meio suplementado com GA 3 nas concentrações de 1,4 e 2,9µM, porém estas apresentaram um tamanho menor (15-25 mm, dados não apresentados). O emprego de GA 3 na cultura de tecidos é restrito, embora na cultura de ápices caulinares este fitohormônio tenha mostrado efeito benéfico no crescimento destes explantes. Em geral, as giberelinas estimulam o crescimento de órgãos mas reprimem o processo de iniciação (Murashige, 1963). Para o cultivo de meristemas de batata-doce, em geral, as respostas são genótipos dependentes, uma vez que várias combinações de substâncias reguladoras de crescimento têm sido utilizadas: 57,73µM dega 3 (Lizarraga et al.,1992), 4,64µM de cinetina e 5,7µM de ácido indolacético (AIA) (Kuo et al., 1985; Fernandez & Hu, 1988; Litz & Conover, 1978), 0,16µM de ácido naftalenoacético (ANA) e 1,33µM de BA (Love et al., 1987), 1,33-4,44µM deba e 0,053µM de ANA (Peters et al., 1989), 4,44µMdeBA (Litz & Conover, 1978), 2,32µM de cinetina e 1,14µM de AIA (Alconero et al., 1975) bem como, 0,46µM de cinetina e 0,28M de GA 3 (Zamora & Gruezo, 1993). Recuperação de plantas livres de vírus - Na propagação in vitro, a probabilidade de isolar tecidos livres de vírus é inversamente relacionada com o tamanho do explante (Murashige, 1977). Quanto menor o explante maior a chance de se obter regenerantes isentos de contaminações; entretando, maior é a dificuldade de sua regeneração (Murashige, 1977; Walkey, 1985). Em geral, explantes constituídos do meristema apical, terminal ou axilar, com um ou dois primórdios foliares são os recomendados. Com base nestas informações foi avaliada, em batata-doce, a eficiência de recuperação de plantas

4 212 TABELA 1- Efeito da cinetina e GA 3 na regeneração in vitro de genótipos de batata-doce, a partir do cultivo de ápice caulinar (meristema apical com um primórdio foliar), em meio contendo macro e microelementos MS e vitaminas. Cada parcela continha 10 explantes, com quatro repetições, num total de 40 explantes/tratamento. Cinetina µm µm B.Roxa Jewel Princesa 186 White Star 0,0 0,0 0,0e 0,0e 0,0c 0,0d 0,0d 0,0 1,45 50,0 cd 60,0 bcd 50,0 b 52,5 c 57,5 bc 0,0 2,90 80,0 ab 82,5 a 75,0 ab 80,0 a 90,0 a 0,0 5,80 85,0 a 80,0 ab 80,0 a 77,5 ab 82,5 ab 2,3 0,0 40,0 d 50,0 d 52,5 b 47,5 c 47,5 c 2,3 1,45 70,0 abc 75,0 abc 57,5 ab 65,0 abc 70,0 abc 2,3 2,90 72,5 abc 65,0 abcd 72,5 ab 65,0 abc 67,5 abc 2,3 5,80 70,0 abc 70,0 abcd 80,0 a 67,5 abc 70,0 abc 4,6 0,0 57,5bcd 50,0d 55,0 b 52,5 c 50,0 bc 4,6 1,45 60,0 bcd 62,5 abcd 57,5 ab 50,0 c 50,0 bc ,0 bcd 65,0 abcd 60,0 ab 62,5 abc 60,0 bc 4,6 5,80 65,0 abcd 60,0 bcd 55,0 b 62,5 abc 57,5 bc 9,3 0,0 60,0 bcd 52,5 bcd 55,0 ab 52,5 bc 52,5 bc 9,3 1,45 60,0 bcd 60,0 bcd 62,5 ab 60,0 abc 50,0 bc 9,3 2,90 67,5 abc 60,0 bcd 65,0 ab 67,5 abc 62,5 bc 9,3 5,80 62,5 bcd 62,5 abcd 60,0 ab 60,0 abc 60,0 bc CV(%) 18,8 16,3 18,6 17,8 17,6 Os dados foram transformados para arco seno, onde p é a percentagem de plantas regeneradas. As médias seguidas de letras iguais, na mesma coluna, não diferem entre si pelo teste de Duncan (P< 0,05). livres de vírus utilizando-se explantes constituídos do meristema apical com um primórdio foliar. Em todos os tratamentos testados, a porcentagem de sobrevivência dos explantes variou de 40 a 80%, valores estes bastante superiores aos 28% obtidos por Gama (1988). É possível que diferenças na habilidade de excisão destes explantes, por parte dos operadores, levaram a respostas diferenciadas na porcentagem de sobrevivência dos explantes. Em 43 plantas (71%) de I. setosa enxertadas com gemas de plantas provenientes da cultura in vitro não se observou sintomatologia de viroses. As plantas correspondentes foram avaliadas em microscópio eletrônico, não sendo detectada a presença de vírus. Desta maneira, obteve-se plantas livres de vírus das variedades Brazlândia Roxa, Princesa, Jewel, White Star e do genótipo 156. Este resultado contrasta com o baixo número de plantas livres de vírus obtido por Gama (1988), onde foi empregado termoterapia das plantas associada a cultura de ápices caulinares (meristema apical com um ou dois primórdios foliares). Baseando-se nos resultados apresentados, a termoterapia é desnecessária como técnica auxiliar na obtenção in vitro de plantas de batata-doce livres de vírus, concordando com as observações de Over de Linden & Elliot (1971) e Alconero et al. (1975). O método apresentado neste trabalho permite a diminuição dos custos envolvidos com a obtenção de plantas matrizes de alta qualidade sanitária e a introdução de acessos nos bancos de germoplasma in vitro. AGRADECIMENTOS Ao CNPq e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF) pelo apoio recebido. REFERÊNCIAS

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