UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DOUTORADO EM ODONTOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DOUTORADO EM ODONTOLOGIA AVALIAÇÃO DA TERAPIA FOTODINÂMICA NA INATIVAÇÃO DA CÂNDIDA: ESTUDO IN VITRO RACHEL DE QUEIROZ FERREIRA RODRIGUES Orientadora: Profa. Dra. Ângela Toshie Araki Co-Orientadora: Profa. Dra. Andrea Sarmento Queiroga Tese apresentada ao Doutorado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutora em Odontologia. SÃO PAULO 2014

2 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL R616a Rodrigues, Rachel de Queiroz Ferreira. Avaliação da terapia fotodinâmica na inativação da cândida: estudo in vitro / Rachel de Queiroz Ferreira Rodrigues. -- São Paulo; SP: [s.n], p. : il. ; 30 cm. Orientadora: Ângela Toshie Araki. Tese (doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul. 1. Terapia fotodinâmica - Odontologia 2. Candida 3. Azul de toluidina 4. Antifúngicos 5. Laser. I. Araki, Ângela Toshie. II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título. CDU: : (043.2)

3 UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO AVALIAÇÃO DA TERAPIA FOTODINÂMICA NA INATIVAÇÃO DA CÂNDIDA: ESTUDO IN VITRO RACHEL DE QUEIROZ FERREIRA RODRIGUES Tese de doutorado defendida e aprovada pela Banca Examinadora em 25/11/2014. BANCA EXAMINADORA: Profa. Dra. Ângela Toshie Araki Universidade Cruzeiro do Sul Presidente Prof. Dr. Fábio Valverde Rodrigues Bastos Neto Universidade Cruzeiro do Sul Profa. Dra. Andréa Kanako Yamazaki Arasaki Universidade Cruzeiro do Sul Prof. Dr. Jarbas Eduardo Martins Associação Paulista dos Cirurgiões Dentistas Profa. Dra. Maria Stella Nunes Araujo Moreira Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo

4 DEDICATÓRIA À DEUS minha fonte de vida e sabedoria, pelo Teu imensurável amor, proteção e ajuda, por permitir esta vitória em mais uma etapa de minha vida. Ao meu esposo Rodrigo, pelo incentivo, compreensão e ajuda na organização deste trabalho. Pelo exemplo de profissionalismo e determinação; Por ser pai e mãe nas minhas ausências; Por sempre acreditar em mim e vencermos juntos o que a vida nos oferece! Aos meus pais Jailson e Linalda, que desde de criança me ensinaram a beleza dessa profissão. Pela motivação, não medindo esforços, dando força, coragem, perseverança e muito auxílio durante esses anos. Pela dedicação, apoio e exemplos de vida e profissionalismo. Pelo exemplo de caráter e honestidade que desejo seguir na minha vida, e, principalmente, por todo amor que sempre foi cultivado dentro de nosso lar. Amo vocês! A minha linda filha Rafaela. Poucos momentos deixei de está com você, de ver o seu crescimento intelectual, de não participar de algumas apresentações na escola devido a este trabalho. Filha, o que posso deixar com esse estudo é o meu exemplo de perseverança e conquista. Hoje podemos recuperar esse tempo perdido e posso dizer que TUDO valeu a pena. Mamãe te ama muito!

5 AGRADECIMENTOS ESPECIAIS A minha orientadora Profa. Dra. Ângela Toshie Araki, pela simplicidade, sabedoria, paciência e dedicação. Pelas orientações e ensinos que me tornaram capaz, me mostrando os caminhos que facilitaram a finalização deste trabalho. Tive a felicidade de tê-la como orientadora. Muito Obrigada! A minha co-orientadora Profa. Dra. Andrea Queiroga Sarmento, pela compreensão, pelos ensinamentos compartilhados e pela maneira que me tranquilizou durante a realização deste trabalho. Aos professores Dr. Eduardo Gomes Seabra, Dr. Flávio Roberto Guerra Seabra, Msc. Michelline Cavalcanti Toscano de Brito pelos ensinamentos aprendidos, como também pelas oportunidades a mim proporcionadas. Aos Professores Fábio Bastos e Sueli, por ter aceitado em participar da banca de qualificação e pela contribuição pertinente em suas observações. Aos Professores Petrusc e Patrícia e aos técnicos em laboratório Alexandre, Cenira e Patrícia, pela disponibilidade de horário, auxílio e compreensão durante a execução desse trabalho. À Profa. Dra. Ruthinéia Diógenes pela transmissão de seus ensinamentos, e por introduzir à pesquisa desde da graduação.

6 AGRADECIMENTOS Aos meus irmãos, Samara, Ruth e Felipe que sempre me apoiaram e me ajudaram quando possível. Aos colegas de Doutorado em Odontologia, em especial Paula Vanessa, Renata, Faldryene, Luciana, Clarisse, Camila, Manuela e Tássia pelo convivência e pelos bons momentos que passamos juntas. Aos Professores do programa de pós graduação em Odontologia por todos os ensinamentos transmitidos que contribuiram para minha vida acadêmica. À UFCG em especial a Rodrigo Alves, Gymena e Julierme, pela compreensão de minhas ausências neste período. Aos funcionários da UNICSUL pelo auxílio e colaboração. Aos alunos da UFCG, Taynan Escarião, Brisa Garcia, Lucélia, Francisco Thaynan, Karoline, Talita, Jéssica, Bruna Honório, Nelmara, Rafael e Alzira pela colaboração no experimento, sem vocês esse trabalho não poderia ser concretizado. Ao amigo João Nilton Lopes de Souza, que juntos trabalhamos durante os testes experimentais dessa pesquisa, por enfrentarmos os mesmos obstáculos e conseguirmos juntos a conclusão de mais uma etapa. Como foi bom compartilharmos essa experiência e podermos perpetuar esta na graduação. Muito obrigada!

7 A glória de Deus está nas coisas encobertas; mas a honra dos reis, está em descobri-las. Provérbios 25:2

8 RODRIGUES, R. Q. F. Avaliação da terapia fotodinâmica na inativação da cândida: estudo in vitro f. Tese (Doutorado em Odontologia) Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, RESUMO Novas alternativas estão surgindo devido ao uso indiscriminado de antifúngicos que vêm acarretando resistência a Candida. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da Terapia Fotodinâmica utilizando o azul de toluidina (AT) na inativação de espécies do gênero Candida. Foram avaliados quatro grupos: PDT, AT, Laser e Solução Salina (SS). Para os grupos AT e PDT avaliamos quatro tempos de pré-irradiação (1, 5, 10 e 20 minutos) e quatro tipos de concentrações do fotossensibilizador (FS) (37,5 µg/ml; 75 µg/ml; 150 µg/ml e 300 µg/ml). Para o grupo PDT, alíquotas de 100µl da suspensão do fungo (10 6 UFC/ml) foram transferidas para um poço de uma placa de microdiluição, em seguida, foi acrescentado o mesmo volume de AT em uma das concentrações testadas. Após os tempos de incubação, as placas foram irradiadas com um diodo laser (660nm; 100mW; 426 J/cm 2 ) por 128 segundos. No grupo Azul de Toluidina, foi utilizado o mesmo protocolo sem a exposição da luz laser. O grupo Laser seguiu o protocolo substituindo o FS por SS, enquanto que no grupo Solução Salina não foi utilizado nem o FS e nem o Laser. Foram realizadas diluições seriadas de 1:3 a partir das amostras contidas nos poços das placas e plaqueadas. Após 48 horas de incubação a 37 o C, as placas de Petri foram submetidas à contagem de unidades formadoras de colônias. Os Resultados mostraram que com exceção do tempo de incubação de 1 minuto para todas as concentrações, como também no tempo de 5 minutos para concentração de 37,5 µg/ml não observamos diferenças significativas entre os grupos por concentração e tempo de incubação. Nas demais combinações de concentração e tempo de incubação foram verificadas diferenças significativas entre os grupos. A PDT utilizando o AT como FS promoveu inativação de espécies do gênero Candida albicans. Palavras-chave: Terapia fotodinâmica, Laser, Azul de toluidina, Candida sp.

9 RODRIGUES, R. F. Q. Photodynamic therapy evaluation in the inactivation of candida: in vitro study f. Tese (Doutorado em Odontologia) Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, ABSTRACT New alternatives are emerging due to the indiscriminate use of antifungal agents that are causing resistance to Candida. This study aimed to evaluate the effect of PDT using toluidine blue (TB) in the inactivation of Candida species. Four groups were evaluated: PDT, TB, Laser and Saline Solution (SS). For the TB and PDT groups we evaluated four pre-irradiation times (1, 5, 10 and 20 minutes) and four kinds of concentrations of the photosensitizer (PS) (37,5 µg/ml; 75 µg/ml; 150 µg/ml e 300 µg/ml). For the PDT group, aliquots of 100µl of the fungal suspension (106 CFU / ml) weretransferred to a well of a microdilution plate, then, the same volume of TB was added in one of the tested concentrations. After the incubation time, the plates were irradiated with a diode laser (wavelength 660nm, power of 100mW and a dose of 426 J / cm 2 ) for 128 seconds. In the Toluidine Blue group, the same protocol without the exposure of laser light was used. Laser group followed the protocol by substituting PS for SS, while the Saline Solution group was not used PS nor Laser. 1:3 serial dilutions were made from the samples contained in the wells of the plates and plated. After 48 hours incubation at 37 C, the Petri Plates were subjected to counting of colony forming units. Results showed that, with except for the incubation time of 1 minute for all concentrations, as well in the time of 5 minutes to concentration of 37.5 µg / ml, no significant difference between groups by concentration and incubation time were observed. In other concentration combinations and incubation time significant differences between groups were observed. We conclude that PDT using the TB as PS promoted inactivation of species of the genus Candida albicans. Keywords: Photodynamic therapy, Laser, Toluidine blue, Candida sp.

10 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Cepa de Candida albicans utilizada no experimento Figura 2 Preparo do meio de cultura Figura 3 Capela de fluxo laminar com a luz UV ligada (germicida) Figura 4 O fotossensibilizador (AT) em pó e suas concentrações utilizadas 43 Figura 5 Período de incubação com ausência de luz Figura 6 Laser semicondutor portátil utilizado no estudo Figura 7 Área do feixe de laser de 3 mm 2, a qual coincide com a área da abertura de cada poço Figura 8 Preparo do inóculo Figura 9 Controle do meio de cultura Figura 10 Grupo PDT Figura 11 Grupo AT Figura 12 Grupo Laser Figura 13 Grupo SS Figura 14 Esquema das diluições direta e seriadas em duplicatas Figura 15 Contagem de Colônias Tabela 1 Tabela 2 Tabela 3 Comparação da média e desvio padrão do log10 do número de unidades formadoras de colônias (UFC/ml) para os grupos controles nos diferentes tempos de incubação Avaliação do efeito citotóxico das concentrações (37,5; 75; 150 e 300µg/mL) de azul de toluidina, na ausência de luz, com tempos de incubação de 1, 5, 10 e 20 min Comparação da média e desvio padrão do log 10 UFC/mL entre os grupos AT e PDT AT segundo as concentrações de AT e tempos de incubação Quadro 1 Comparação da média do log10ufc/ml entre os grupos PDT AM e grupos controles... 58

11 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AIDS AM AT ASD CCT CL CLX CUR FIP FR FS L LED MEV MIN NAM PACT PB PDI RD SS SPSS PDT UFC UV Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Azul de Metileno Azul de Toluidina Agar Sabourad Dextrose Coleção de Culturas Tropical Clorofila Líquida Clorexidina Curcumina Faculdades Integradas de Patos Fluconazol Resistente Fotossensibilizador Laser Light Emitting Diode Microscópico Eletrônico de Varredura Minutos Novo Azul de Metileno Quimioterapia fotodinâmica como terapia antimicrobiana Paraíba Inativação Fotodinâmica Resistência Respiratória Solução Salina Statistical Package for the Social Sciences Terapia Fotodinâmica Unidade Formadora de Colônia Ultravioleta

12 LISTA DE SÍMBOLOS µg Micrograma ml Mililitros He-Ne Helio-Neônio µl Microlitro O 2 Oxigênio C graus celcius cm centímetro. ph potencial hidrogeniônico mm Milímetro GaAlAs Arseneto de gálio e alumínio InGaAlP Fosfeto de Índio- Gálio- Alumínio λ Lambda nm Nanômetro mw Miliwatts mm 2 milímetro quadrado Log Logarítmo J Joule % Porcentagem NaCl Cloreto de sódio

13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Terapia Fotodinâmica Histórico Mecanismo de ação Fotossensibilizadores Fontes de luz Inativação da Cândida pela PDT OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAL E MÉTODOS Tipo e local do estudo Instrumentos Microrganismo e meio de cultura Preparação do fotossensibilizador (FS) e tempo de incubação Fonte de irradiação para a terapia fotodinâmica (TFD) Preparo do inóculo de Candida albicans Condições Experimentais Grupo Terapia fotodinâmica / PDT (Grupo FS+L+) Grupo Azul de Toluidina/ AT (Grupo FS+L-) Grupo Laser / L (Grupo FS-L+) Grupo solução salina/ SS (FS-L-) Avaliação da viabilidade das células de Candida albicans Técnica de Contagem das Unidades Formadoras de Colônias/ml Análise estatística... 54

14 5 RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXOS Anexo A Certificado da Cultura utilizada no experimento... 69

15 14 1 INTRODUÇÃO A cavidade oral é amplamente colonizada por uma variedade relativamente complexa e altamente inter-relacionada de microrganismos, incluindo espécies bacterianas aeróbicas e anaeróbicas, Gram positivas e Gram negativas (AVILA; OJCIUS; YILMAS, 2009), além da presença de alguns fungos, como espécies de Candida (LEUNG et al., 2000). As espécies de Candida fazem parte da microbiota comensal da cavidade oral da maioria dos indivíduos saudáveis. Entretanto, na presença de fatores predisponentes podem se tornar patogênicas, produzindo infecções que vão desde lesões mucosas superficiais até disseminações sistêmicas graves e invasivas (DE REPENTIGNY et al., 2000, LEUNG et al., 2000). A infecção da cavidade oral por Candida spp. denominada de candidose é uma infecção significante em pacientes submetidos à terapia antineoplásica (quimioterapia e radioterapia) bem como em pacientes imunocomprometidos em decorrência de infecção pelo vírus HIV (CORMICK, et al., 2009). É considerada uma das infecções oportunistas mais comumente observadas em pacientes portadores de AIDS e, quando não corretamente tratada e prevenida, pode contribuir consideravelmente para a mortalidade desses pacientes (SARAMANAYAKE, 2006; THULER et al., 1998). O aumento de casos de infecções causadas por cepas de Candida e consequentemente a utilização excessiva de antimicrobianos, favoreceu nas últimas décadas a resistência dessas leveduras aos agentes antifúngicos convencionais (PINTO; WEIKERT-OLIVEIRA; LYON, 2008). Esses agentes antifúngicos demonstram efeito mais fungistático do que fungicida, resultando em uma profilaxia inadequada (DONNELLY; MCCARRON; TUNNEY, 2007). Cuidados devem ser tomados quanto aos possíveis efeitos colaterais, frente à administração de medicações sistêmicas dos antifúngicos. Dentre esses efeitos destacam-se a irritação local, distúrbios gastrintestinais, náuseas, vômito, diarreia, anorexia, cefaleia, dor epigástrica, sangramento gengival, parestesia,

16 15 trombocitopenia e risco de produzir anormalidades hepáticas, sendo necessário pesquisar alguma forma de tratamento coadjuvante (YAGIELA, 2000). Frente às limitações da terapia antifúngica convencional, torna-se importante o estudo de terapias alternativas para tratar as infecções causadas por estes microrganismos como a terapia fotodinâmica (TFD). Esta técnica foi originalmente desenvolvida para o tratamento de lesões cancerígenas e vem sendo aplicada com sucesso na área da Oncologia, promovendo danos irreversíveis nas células do tecido neoplásico (MACHADO, 2000). Acredita-se que a terapia fotodinâmica apresenta algumas vantagens em relação à terapia antifúngica tradicional, como o fato de que a morte celular pode ser mais veloz, não sendo necessária a manutenção do agente químico em altas concentrações sobre as lesões por um período de tempo maior, como ocorre com os agentes antifúngicos e antimicrobianos. Além disso, a morte celular mediada pela liberação de radicais livres torna improvável o desenvolvimento da resistência pelos microrganismos. Desta forma, este estudo tem como objetivo avaliar os efeitos da terapia fotodinâmica em Candida albicans, variando o tempo de incubação e a concentração do azul de toluidina.

17 16 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Terapia Fotodinâmica Histórico A partir da década de 90 que a terapia fotodinâmica começou a ser testada em bactérias orais, apresentando resultados significativos na redução bacteriana, utilizando o laser de He-Ne (Hélio-Neônio), l=632,8 nm e 7,3mW de potência, associada aos fotossensibilizadores azul de toluidina, azul de metileno, ftalocianina e hematoporfirinas, em bactérias das espécies Streptococcus sanguis, A. actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum e Porphyromonas gingivalis, retiradas do biofilme subgengival de pacientes com periodontite crônica (WILSON; DOBSON; SARKAR, 1993). A terapia fotodinâmica utiliza luz ativando um agente fotossensibilizador na presença de oxigênio, que resultará a formação de espécies de oxigênio e radicais livres, os quais causarão danos e morte celular. Apesar de ser uma terapia relativamente nova, data-se de 4000 anos atrás, em antigas civilizações, como a egípcia, indiana, grega, o hábito de ingerir plantas ou extratos associando com a luz solar para tratar doenças dermatológicas (SIMPLICIO; MAIONCHI; HIOKA, 2002). Em 1903, Von Tappeiner e Albert Jesionek utilizaram a aplicação tópica do corante eosina em exposição à luz para tratamento de câncer cutâneo, determinando, em 1907, este fenômeno como ação fotodinâmica, englobando todas as reações fotobiológicas que envolvesse um fotossensibilizador ocorrendo na presença de oxigênio molecular e levando à destruição de tecidos (FREEDBERG; EISEN; WOLFF 2003). Foi relatado, em 1900, a primeira demonstração de fotossensibilização letal de células por Raab, ao verificar que, no escuro, as baixas concentrações de acridina não causavam efeito algum ao Paramecium; porém, sob exposição à luz normal do dia, poderia inativar os microrganismos (ALFENAS, et al. 2011).

18 Mecanismo de ação A terapia fotodinâmica é baseada na administração tópica de agente fotossensibilizador não tóxico, o qual é submetido à irradiação com luz visível de comprimento de onda adequado. O agente fotossensibilizador ativado reage com as moléculas de oxigênio presentes nas células, por transferência de elétrons ou hidrogênio, produzindo radicais livres, ou por transferência de energia ao oxigênio, que leva à produção de oxigênio singleto, induzindo a morte celular. Pode ocorrer, durante as reações, apoptose ou necrose celular, sendo o primeiro o de maior ocorrência. O corante pode estar localizado na mitocôndria, onde irá acontecer a apoptose; ou o corante pode estar localizado nos lisossomos e na membrana celular, onde irá ocorrer a necrose celular (LAMBRECHTS; AALDERS; MARLE, 2005). A necessidade de tratamentos alternativos aos convencionais, os quais apresentavam alta taxa de resistência das doenças infecciosas, induziu a evolução dos estudos que buscavam alternativas terapêuticas para a inativação de microrganismos patogênicos. A terapia fotodinâmica surge apresentando vantagens para o tratamento de infecções originadas por microrganismos, como amplo espectro de ação, inativação dos microrganismos resistentes e baixo potencial mutagênico nas células expostas, sendo capaz de promover atividades citotóxicas contra bactérias, fungos e protozoários; danifica as membranas plasmáticas e as organelas celulares, alterando a permeabilidade e função de transporte entre os meios intra e extracelular, além de inibir enzimas mitocondriais (JORI et al., 2006). A reação do fotossensibilizador no estado excitado com o meio pode ocorrer de duas formas, os mecanismos do tipos I e II. O mecanismo do tipo I envolve a transferência de elétrons ou captação de átomos de hidrogênio entre o fotossensibilizador em seu estado excitado (tripleto) e moléculas de substrato, formando os radicais livres, que vão reagir com o oxigênio, resultando em espécies de oxigênio altamente reativas, como superóxido, radicais hidroxila e peróxido de hidrogênio. Os fotossensibilizadores associados a uma fonte de luz com comprimento de onda compatível para o seu pico de absorção são excitados, promovendo a produção das espécies reativas de oxigênio. As subsequentes reações nos tecidos resultam em inativação das células-alvo através de reações de

19 18 óxido-redução com lipídeos da membrana celular, ácidos nucléicos e proteínas (KONOPKA; GOSLINSKI 2007). O mecanismo do tipo II, o qual é o principal responsável pelo dano fotooxidativo à célula microbiana, é baseado na produção de um estado eletronicamente excitado e altamente reativo de oxigênio, o oxigênio singleto. O fotossensibilizador, no estado tripleto, transfere energia para a molécula de oxigênio em seu estado fundamental (tripleto), acarretando a produção da espécie altamente reativa de oxigênio, o oxigênio singleto. Esse oxigênio singleto reage com os componentes celulares, pois os compostos orgânicos insaturados são suscetíveis à ação de O 2. Por ter sua meia-vida curta, o oxigênio singleto possui uma limitada difusão, tendo os locais das lesões celulares da terapia relacionados com o local da aplicação do corante fotossensibilizador, ou seja, há uma resposta localizada, sendo ideal para infecções localizadas (TAKASAKI et al., 2009) Fotossensibilizadores A maioria das células não possui componentes fotossensíveis, é necessária a aplicação de um fotossensibilizador para atrair luz e iniciar a formação de radicais livres. Os agentes fotossensibilizadores devem ter picos de absorção muito próximos ao comprimento de onda de luz laser a ser utilizada no tratamento e não podem apresentar riscos ou danos tóxicos ao paciente (DÖRTBUDAK, et al., 2001). Foi amplamente observado que a Candida albicans, assim como outras leveduras, é ligeiramente mais difícil de matar pela terapia fotodinâmica que células bacterianas gram-positivas, necessitando, assim, de doses maiores de corante fotossensibilizador (ZEINA, et al., 2002). Apesar de necessitar de uma dose maior de fotossensibilizador, foi demonstrado que não ocorre número considerável de morte celular humana, além de não causar efeitos genotóxicos e mutagênicos detectáveis (ZEINA; GREENMAN; CORRY; PURCELL, 2003). A dificuldade de eliminar totalmente a Candida albicans pode ser explicada pela presença de uma membrana nuclear nas leveduras, além de um maior tamanho

20 19 da célula e menor número de alvos para o oxigênio singleto por unidade de volume da célula (DEMIDOVA; HAMBLIN, 2005a). Existem vários agentes fotossensibilizadores utilizados, podendo citar os fenotiazínicos, rosa bengala, cristal violeta, ftalocianina, tionina, protoporfirina. O azul de toluidina e o azul de metileno, pertencentes ao grupo fenotiazínicos, são os fotossensibilizantes mais utilizados em pesquisas na área odontológica. Apesar destes pertencerem ao mesmo grupo e possuírem estrutura química e propriedades físico-químicas semelhantes, as eficiências destas substâncias fotossensibilizadoras variam entre diferentes microrganismos (DEMIDOVA; HAMBLIN, 2005b). O sítio de ação primário em bactérias gram-negativas é a membrana externa, porém em bactérias gram-positivas e fungos, este sítio é a membrana plasmática. O fotossensibilizador conduz reações que envolvem a modificação de lipídios e/ou polissacarídeos, além de inativar proteínas e enzimas essenciais, presentes na membrana plasmática, provocando a morte celular (HARRIS; CHAPDTIELD; PHOENIX, 2005). O sucesso da terapia fotodinâmica depende de fatores relevantes do corante, como a concentração, a qual varia de um material para outro, por haver uma variação das características químicas de cada composto e da toxicidade. Além da concentração do corante, pode mencionar, como fator relevante, a interação do fotossensibilizador com o alvo, em que se espera que o corante se una ao microrganismo, ou ultrapasse a membrana citoplasmática. Para que isto seja possível, é fundamental que haja um espaço de tempo entre a aplicação do fotossensibilizador no alvo e a ativação pela fonte de luz escolhida, geralmente, variando de um a dez minutos (RIBEIRO et al., 2005). O azul de metileno tem se destacado por absorver na região de luz vermelha e produzir oxigênio singleto, possuir um máximo de absorção na região de 600 a 660nm, além de exibir um bom valor de atividade fotodinâmica e de ser compatível com o uso de LED; além disso, tem sido utilizado em pesquisas com ação antifúngica e antibacteriana (PELOI, 2007).

21 20 Os fotossensibilizadores da família dos fenotiazínicos se destacam na área odontológica pelo comprimento de onda necessário para ativá-los ( nm), dando-lhes um maior poder de penetração (ALMEIDA et al.,2008). O azul de toluidina tem sido muito usado, há vários anos, por ser eficiente na produção de oxigênio singleto sob o comprimento de onda máximo de absorção de 630nm, além de se classificar como eficiente na inativação de leveduras, bactérias gram-positivas e gram-negativas com a irradiação do laser (DONELLY; MCCARRON; TUNNEY, 2008). Dentre as propriedades desejadas para a escolha de um fotossensibilizador, pode-se citar: pureza química, intervalo pequeno entre a administração da droga e o acúmulo máximo no local aplicado, ativação por comprimentos de onda com ótima penetração no tecido, além de uma formulação simples e e baixa toxicidade no escuro (ISSA; MANELA-AZULAY, 2010) Fontes de luz Apesar de, convencionalmente, os lasers de baixa potência ser utilizados como fonte de irradiação na terapia fotodinâmica, o uso de Diodo Emissor de Luz (Light Emitting Diode LED) tem se fortalecido. O LED é considerado uma fonte de luz contínua de alta eficiência, baseado nas propriedades de um semicondutor dopado com duas impurezas diferentes, formando um diodo. Possui propriedades que resultam em bandas de emissão mais largas, beneficiando a agregação com o fotossensibilizador e a absorção de energia luminosa. Além disso, apresenta vantagens como: portáteis, fácil manejo e um menor custo (GENOVESE, 2000). Considera-se como uma fonte de luz ideal aquela que, por um baixo custo, fornece uma maior quantidade de luz possível no máximo de absorção do fotossensibilizador, sem causar efeitos térmicos significativos (MACHADO et al., 2000). Devem-se considerar as bandas de absorção dos fotossensibilizadores e a profundidade de penetração da luz nos tecidos biológicos na escolha da região do espectro eletromagnético de emissão da fonte de luz (NOWIS et al., 2005).

22 21 O laser pode ser classificado em duas categorias, baseando-se no nível de excitabilidade que possivelmente causará no tecido alvo biológico. Na primeira categoria, denominada de alta intensidade, a energia depositada no tecido é amplo, a ponto de romper as ligações químicas dessas moléculas ou remover elétrons, rompendo ou modificando de forma permanente o tecido alvo, através de corte, coagulação e ablação. Na segunda categoria, denominada de baixa intensidade, ocorre uma menor excitabilidade, ocorrendo bioestimulação ou bioinibição das reações químicas e fisiológicas naturais do tecido, regulando as funções fisiológicas celulares. Os lasers de baixa intensidade apresentam um efeito analgésico, antiinflamatório e biomodulador (LIZARELLI, 2005). O Laser, geralmente, possui um comprimento de onda correspondente ao pico de absorção do fotossensibilizante, com capacidade de emissão de luz monocromática de alta fluência, associada à precisão do foco. Além disso, pode ser aplicada em regiões de difícil acesso, por meio de fibras ópticas (DOVIGO, 2007). O Laser, forma de radiação não ionizante, altamente concentrada, com efeitos térmicos e fotoquímicos nos diferentes tecidos, tem sido eleito como fonte de luz por não ser invasiva e ser bem tolerada pelos tecidos, além de permitir um melhor controle de energia específica em estudos experimentais e apresentarem maior definição na penetração em tecidos biológicos (CARVALHO, 2012) Inativação da Cândida pela PDT Em 1999, Jackson et al. avaliaram o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica contra Candida albicans, utilizando o laser de baixa potência (HeNe), com energia de 35 mw e comprimento de onda de 632,8 nm, e azul de toluidina como fotossensibilizador. As variáveis estudadas foram a concentração do azul de toluidina, a dose de luz laser e o tempo pré-irradiação. Os resultados deste estudo demonstraram que ambas as formas de C. albicans, levedura e hifas, bem como cepas resistentes aos antifúngicos azólicos, podem ser sensibilizadas com baixas doses de luz laser, sendo 42 J dose mais eficaz, quando associadas a azul de toluidina em curto período de tempo (2-5 min).

23 22 Teichert et al. (2002) definiram que no tratamento de candidíase com a PDT, utilizando AM como FS, apresenta algumas vantagens em ralação à terapia medicamentosa tradicional, pois apresenta mecanismos de ação, nas células, diferentes das drogas antifúngicas, atenuando os casos de desenvolvimento de resistência ao medicamento, e pode ser uma alternativa terapêutica eficaz contra cepas já resistente de C. albicans. Além disso, nos pacientes HIV positivo, que recebem uma infinidade de prescrição de medicamentos, os profissionais devem sempre estar em alerta a possíveis interações entre medicamentos. Nestes casos, a PDT é modalidade de tratamento antifúngica segura, já que o FS é aplicado topicamente, fazendo com que a probabilidade de interações com outros medicamentos seja pequena. Strakhovskaya et al. (2002) pesquisaram novos métodos de controle de microrganismos patogênicos utilizando PDT. Os autores experimentaram a inativação de Candida albicans fotossensibilizada por corantes khlorin; estudadas as características específicas desse efeito; e compararam a fotossensibilidade relativa do estirpe de referência de C. albilatas, com algumas outras amostras desta espécie recém-isoladas de material clínico e leveduras não patogênicas dos resultados gênero Candida. Os resultados deste trabalho mostraram que uma série de características específicas de inativação da cepa Candida albicans ATCC fotossensível por corantes khlorin (dependência do efeito sobre a duração da préincubação com corantes, curvas de concentração e eficiência relativa das concentrações equimolares de fotossensibilizantes) foram semelhantes para as características específicas de fotossensibilização inativação de C. guilliermondii. Em outras palavras, as estirpes não patogênicas do gênero Candida podem ser utilizadas para avaliação laboratorial preliminar da eficiência de novos fotossensibilizadores. Os achados sugeriram que a PDT é um método suficiente e seletivo para inativar patógenos de superfície de origem microbiana e de fungos sem causar danos aos tecidos subjacentes. Bliss et al. (2004) pesquisaram a terapia fotodinâmica (PDT) e definiram que a mesma é um processo em que as células são tratadas com um agente que torna susceptíveis à morte por exposição à luz. Estes agentes, denominados fotossensibilizadores, são geralmente compostos macrocíclicos que exibem mínimas ou nenhuma toxicidade inerente mas resultam na geração de espécies de oxigênio

24 23 reativas citotóxicos quando ocorre excitação com luz de comprimento de onda adequado. Os autores usaram como FS o photofrin em PDT, verificando redução semelhante da atividade metabólica de Candida albicans e Candida krusei. No entanto, a Candida glabrata mostrou resistência a este tipo de terapia. Demidova e Hamblin (2005a) testaram o efeito da PDT na fotoinativação de cepas de Escherichia coli, S. aureus e Candida albicans em suspensões celulares com diferentes concentrações celulares. Os fotossensibilizadores testados foram o rosa bengala, azul de toluidina e conjugado de poli-lisina associados a uma fonte de luz não coerente. As suspensões celulares foram incubadas com os FSs em concentrações variadas durante 20 minutos. Após o período de incubação, alíquotas de 200µl das suspensões foram transferidas para uma placa de 96 poços e iluminadas com doses de luz que variaram entre 0 e 200J/cm 2. Os comprimentos de onda (ʎ) utilizados foram 552nm para as amostras impregnadas com o rosa bengala, 620nm para as amostras tratadas com o azul de toluidina e 400nm para as amostras tratadas com o conjugado de poli-lisina. Após a irradiação foram obtidas diluições seriadas de cada amostra que foram plaqueadas e mantidas a 37 C por 48 horas para a obtenção do número de ufc/ml. Os resultados demonstraram que quanto maior a concentração celular da suspensão, uma maior concentração do FS é necessária. O FS mais eficiente na fotossensibilização das espécies testadas foi o conjugado de poli-lisina. Candida albicans foi a espécie mais resistente aos efeitos da PDT. Os autores concluíram que, por possuir um tamanho 10 a 50 vezes maior que a célula bacteriana, a célula fúngica necessita de uma maior quantidade de oxigênio singleto para sua inativação e que a membrana nuclear das células fúngicas podem atuar como uma barreira adicional para a penetração do FS. Lambrechts, Aalders, Van Marle (2005), usaram a porfirina como um fotossensibilizador que, em combinação com luz pode inativar bactérias, fungos e vírus. Para a melhor eficácia da PDT de fungos clinicamente relevantes, como a Candida albicans, buscaram compreender o mecanismo de funcionamento, seguindo a resposta da Candida albicans exposta a PDT usando microscopia confocal de fluorescência e microscopia eletrônica de congelar-fratura. Concluíram que Candida albicans pode ser desativada com sucesso pelo FS, a membrana citoplasmática é a organela alvo.

25 24 Souza et al estudaram os efeitos da radiação laser (685 nm) associados a FS sobre a viabilidade de diferentes espécies do gênero Candida. Suspensões de Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida tropicalis e Candida krusei, contendo 10 6 células viáveis por mililitro foram obtidas de cada uma das espécies. Dez amostras da suspensão de células foram irradiadas com laser de díodo (685 nm) com 28 J/cm 2 na presença de AM (0,1 mg/ml), 10 amostras foram tratadas apenas com AM, 10 amostras foram irradiadas com o laser, na ausência do corante. De cada amostra, uma série de diluições de 10-2 e 10-3 foram obtidas e alíquotas de 0,1 ml de cada diluição foram plaqueadas em duplicata em ASD. Após incubação a 37 o C durante 48h, o número de unidades formadoras de colônias (UFC/ml) foi obtido. A radiação laser na presença de azul de metileno, reduziu o número de UFC/mL em 88,6% de C. albicans, de 84,8% para C. dubliniensis, 91,6 % para C. krusei e de 82,3% de C. tropicalis. Concluíram que a PDT apresentou efeito fungicida em todas as espécies de Candida estudadas. Munin et al. (2007) estudaram o efeito da quimioterapia fotodinâmica antimicrobiana (PACT), como um potencial tratamento antimicrobiano sobre a formação do tubo germinativo por Candida albicans. Formação do tubo do germe foi induzida por soro de cabra após diferentes tratamentos com azul de metileno (AM) e laser (683nm). Os resultados demonstraram que a PDT usando AM, inibe o crescimento e a formação do tubo germinativo de Candida albicans. Cadastro et al. (2008) estudaram a queilite angular tendo como agente etiológico o fungo Candida geralmente do tipo albicans. Frente às limitações das terapêuticas convencionais para o tratamento da candidíase oral, ou mesmo nos casos de resistência aos fungos nas medicações instituídas, outras formas de tratamento devem ser preconizadas. Este artigo evidencia a utilização da terapia fotodinâmica no tratamento da candidíase, como uma alternativa eficaz de tratamento, consistindo na associação do laser de baixa intensidade de potência ao fotossensibilizador azul de metileno, aplicado sobre a queilite angular. Conclui-se que o tratamento da queilite angular utilizando a PDT evidenciou ausência de lesões clínicas e citológicas, reforçando fácil aplicabilidade, sem a presença de efeitos colaterais adversos, tornando-se um método alternativo de tratamento efetivo e recomendado.

26 25 Chabrier-Rosello, et al. (2008) estudaram as infecções das mucosas causadas pelo fungo patogênico Candida. Estudos prévios demonstraram que as formas filamentosas e biofilmes de Candida albicans foram sensíveis a PDT utilizando o Photofrin como fotossensibilizador. Relataram que o FS de porfirina é eficaz na PDT contra as formas de levedura de C. albicans e C. glabrata. Estirpes com deficiência respiratória (RD) de C. albicans e C. glabrata exibiram um padrão de resistência pleiotrópica, incluindo a resistência aos membros da família de antifúngicos de azole. Em contraste com este padrão, RD mutantes de ambos C. albicans e a C. glabrata foram significativamente mais sensíveis à PDT em comparação com as estirpes parentais. Estes dados sugeriram que a função mitocondrial intacta pode fornecer um nível basal de defesa antioxidante contra a fototoxicidade induzida por PDT em Candida. Peloi et al propuseram o uso do vermelho diodo emissor de luz (LED) como uma fonte de luz alternativa para o AM como FS em PDT. Sua eficácia foi testada contra o Staphylococcus aureus (ATCC 26923), Escherichia coli (ATCC 26922), Candida albicans (ATCC 90028) e Artemia salina. O máximo de absorção das luzes LED era no comprimento de onda de 663 nm a intensidades de 2,4,6 e 12 J/cm 2 para 10, 20, 30 e 60 minutos de exposição, respectivamente. Concluíram que LED vermelho é um dispositivo de luz promissora para PDT que podem efetivamente inibir bactérias, leveduras e crescimento de microcrustáceos. Cormick, et al. (2009) avaliaram a ação fotodinâmica in vitro da porfirina sobre a Candida albicans. A inativação através de fotossensibilizadores de suspensão celular de C. albican aumenta com a concentração do fotossensibilizador, causando uma redução de aproximadamente 5 log de sobrevivência celular, quando as culturas são tratadas com 5 µm de porfirina catiônica e irradiada durante 30 min. No entanto, o fototoxidade diminui com um aumento na densidade das células, de acordo com a sua baixa ligação às células. A elevada atividade fotodinâmica de porfirinas catiônicas foi confirmada por experiências de atraso de crescimento. A capacidade de inativação fotodinâmica destes sensibilizadores também foram avaliadas em células de C. albicans que cresceram em colônias em superfícies de ágar. Porfirinas catiônicas produziram um atraso de crescimento de colônias de C. albicans e a viabilidade das células não foi observada depois de 3 horas de irradiação, indicando uma inativação completa de células de levedura. Portanto, os

27 26 resultados indicaram que estas porfirinas catiônicas são sensibilizadores interessantes para inativação fotodinâmica de leveduras em suspensões líquidas, ou localizadas em focos de infecção. Giroldo et al. (2009) pesquisaram sobre quimioterapia fotodinâmica como terapia antimicrobiana (PACT) e definiram que é uma potencial terapia antimicrobiana que combina luz e uma droga fotossensibilizante, promovendo um efeito fototóxico das células tratadas, em geral através de dano oxidativo. Neste trabalho foi estudado o efeito da PACT, usando azul de metileno (AM), sobre a permeabilidade da membrana Candida albicans. Seus resultados demonstraram que a combinação de AM e laser (684 nm) promove uma diminuição no crescimento de Candida. A inibição foi mais pronunciado na presença de 0,05 mg / ml de AM e com uma densidade de energia de 28 J/cm 2. A diminuição no crescimento de Candida foi associada com um aumento na permeabilização da membrana. Assim, sugere-se que um mecanismo PACT usando AM pode estar relacionado a danos nas membranas plasmáticas das células. Dovigo et al. (2010) avaliaram a suscetibilidade in vitro de C. albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis e C. krusei para a terapia fotodinâmica (PDT), induzida por Fotogem e o diodo emissor de luz (LED). Suspensões de cada Cândida estirpe foram tratadas com três concentrações de FS (10, 25 e 50 mg/l) e expostos a 18,0, 25,5 e 37,5 J/cm 2 de luz (LED fluências ~ 455 nm). As suspensões de controle foram tratadas apenas com concentrações de FS, apenas exposto às influências de luz LED ou não expostos à luz LED nem ao FS. Diluições em série foram obtidas e as alíquotas foram plaqueadas em ASD. Depois da incubação das placas (37 C durante 48 horas), as colônias foram contadas (ufc / ml) e os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey (p=0,05). Foi observada morte completa de C. albicans após 18,0 J/cm 2, em associação com 50 mg/l de FS. C. dubliniensis foram inativadas após 18,0 J/cm 2 utilizando 25 mg/l do FS. A inativação de C. tropicalis, foi observada após a fotossensibilização com 25 mg/l e subsequente iluminação de 25,5 J/cm 2. Para C. krusei, nenhuma das associações entre FS e luz resultou na completa morte desta espécie. A PDT se mostrou eficaz para a inativação de C. albicans, C. dubliniensis e C. tropicalis. Além disso, a redução na viabilidade de C. krusei foi alcançada com alguns FS e associações de luz.

28 27 Mang, Mikulski, Sala (2010) avaliaram a capacidade de eliminar eficientemente isolados resistentes aos antifúngicos de Candida usando Photofrin induzida pelo PDT. Estirpes de Candida a partir de ATCC, assim como isolados resistentes e sensíveis fluconazol e anfotericina B a partir de adultos com AIDS foram cultivadas sob condição padrão. Photofrin foi adicionado às culturas apropriadas como dito pelo desenho experimental. Foi empregada luz às culturas utilizando uma fonte de laser de 630 nm, a uma densidade de potência 150 mw/cm 2 de energia, pois o tempo apropriado para proporcionar J/cm 2. Ensaios de formação de colônias foram usados para determinar a sobrevivência. Depois de culturas tratadas com PDT, observaram uma significativa redução na capacidade de formação de colônias em todas as doses de luz examinadas. Isolados de pacientes com AIDS que tinham demonstrado resistência antifúngica mostraram sensibilidade à terapia fotodinâmica assim como controle de culturas ATCC da mesma estirpe. Os autores concluíram que Photofrin induzido por PDT pode eliminar espécies de Candida com eficiência significativa, revelada pela capacidade de formação de colônia. Outras Candidas isoladas de pacientes com AIDS demonstraram-se suscetíveis à morte através da terapia fotodinâmica. Mima et al. (2010) estudaram a eficácia da terapia fotodinâmica (PDT) na inativação de Candida albicans in vivo. Selecionaram setenta e um ratos Swiss fêmeas de 6 semanas de idade, sendo estes imunossuprimidos, com tetraciclina na água, por via oral, isentos de microorganismos. Foi aplicada suspensão de C. albicans (10 7 UFC/mL) e quatro dias após a inoculação oral, a PDT foi realizado no dorso da língua após a administração tópica de Fotogem a 400, 500 ou 1000 mg/l e 30 minutos mais tarde, seguido pela iluminação com a luz do LED (305 J/cm 2 ) em 455 ou 630 nm (n = 5 cada). Os animais foram sacrificados, as línguas cirurgicamente removidas e processadas para avaliação histológica da presença de leveduras e reação inflamatória. A PDT resultou numa redução significativa na C. albicans quando comparados com os ratos do grupo de controle positivo. Não houve diferença entre as concentrações de Photogem e comprimentos de onda de luz utilizada. A avaliação histológica da língua revelou que a PDT não causa efeitos adversos significativos da mucosa local. Pereira et al. (2010) estudaram o biofilme e verificaram que o mesmo é constituído por uma comunidade diversificada de microrganismos aderida sobre

29 28 superfícies sólidas. Onde sua presença constitui o primeiro passo para o desenvolvimento de cárie dentária e doença periodontal, o que torna necessário a avaliação da eficácia de novas alternativas, como a terapia fotodinâmica (PDT), para promover a sua eliminação. Avaliaram a ação da PDT no desenvolvimento de biofilmes formados in vitro por C. albicans. Os biofilmes foram formados em discos de resina acrílica esterilizados, colocados em placas de 24 poços, com 2 ml de caldo BHI sacarosado, incubadas a 37 o C por cinco dias. Após este período foi avaliada a ação do fotossensibilizador azul de metileno (AM) e aplicação do laser AsGaAl, isoladamente e em conjunto, seguido da semeadura de alíquotas em diluição a base de 10 em Ágar Sabouraud Dextrose, e incubação a 37 o C/48h. As UFC/mL foram transformadas em Log, e os resultados analisados estatisticamente. O AM juntamente com o laser AsGaAl promoveu redução de 1,04 Log em relação ao grupo controle, com estatística significante (p< 0,05), demonstrando a ação antifúngica da PDT em biofilmes de C albicans. Quiroga, Alvarez e Durantini (2010) avaliaram a atividade fotodinâmica de porfirina tetracatiônica in vitro em células de Cândida albicans, em diferentes condições experimentais. Esta apresenta como característica ligar-se rapidamente para as células de C. albicans, atingindo um valor de 1.7 nmol 10-6 células quando as suspensões celulares (10 6 UFC/mL -1 ) foram incubadas com 5 µm de sensibilizador. A Inativação fotossensibilizada de Candida albicans aumenta com a concentração de ambos, sensibilizador e tempo de irradiação, causando uma diminuição no registro de sobrevivência das células quando as culturas são tratadas com o FS e irradiada durante 30 min. No entanto, a fototoxicidade diminui após um passo de lavagem, com a diminuição do sensibilizador ligado às células. O crescimento de células de C. albicans foi detido quando as culturas foram expostas ao FS e luz visível. Em superfícies de ágar, o efeito fototóxico deste sensibilizador, o que causou uma inativação das células de C. albicans, manteve-se elevada. Estes estudos indicaram que a porfirina catiônica é um sensibilizador eficaz na inativação de leveduras em ambas as suspensões líquidas ou localizadas sobre uma superfície para terapia fotodinâmica. Souza et al. (2010) estudaram os efeitos específicos da terapia fotodinâmica (densidade de energia 15,8 J/cm 2, 26,3 J/cm 2 e 39,5 J/cm 2 ), utilizando o azul de metileno, azul de toluidina e verde de malaquita como fotossensibilizantes e baixa

30 29 potência de irradiação a laser na viabilidade de Candida albican. Suspensões de C. albicans com 10 6 células/ml foram padronizadas num espectrofotômetro. Para cada tipo de corante, 120 ensaios, divididos em quatro grupos de acordo com as seguintes condições experimentais, foram realizadas: irradiação a laser na presença do fotossensibilizador, irradiação com laser, o tratamento apenas com apenas o fotossensibilizador; sem exposição à luz laser ou fotossensibilizador. Em seguida, foram preparadas diluições em série e semeadas em ASD para a determinação do número de unidades formadoras de colónias por mililitro (UFC/mL). Os resultados foram submetidos a análise de variância e o teste de Tukey (P <0,05). A terapêutica fotodinâmica usando os fotossensibilizadores testados foi eficaz na redução do número de C. albicans. O número de UFC/ml foi reduzido entre 0,54 log 10 e 3,07 log 10 e dependeu da densidade de energia do laser utilizado. O AT, AM e verde de malaquita foram fotossensibilizantes eficazes na terapia fotodinâmica antimicrobiana contra C. albicans. Tessarolli (2010) pesquisou sobre efeito da terapia fotodinâmica em seres humanos, onde verificou que nas últimas décadas o emprego da luz associada a corantes surgiu como um tratamento alternativo ao uso de agentes antimicrobianos tradicionais. O objetivo desta pesquisa foi analisar comparativamente o efeito da clorexidina e da PDT (com dois tipos de fotossensibilizadores: Azul de Toluidina e Clorofila Líquida (CL)) sobre biofilmes dentários humanos formados in situ. Após 48 horas, diferentes terapias foram aplicadas sobre o biofilme: (1) água destilada: controle negativo; (2) clorexidina; (3) irradiação por laser; (4) AT; (5) AT + laser; (6) CL; (7) CL + laser. O biofilme então foi coletado e solubilizado. Em seguida, amostras foram semeadas em placas de Petri com diferentes meios de cultura, para contagem do número de microrganismos totais, estreptococos totais, Streptococcos mutans, Lactobacilos e Candida albicans. Amostras também foram coradas com Laranja de Acridina e visualizadas em microscopia de fluorescência, para análise da viabilidade das células presentes. Os resultados dos plaqueamentos apenas nos deram informações sobre os microrganismos totais e estreptococos totais, mostrando que a única redução significante dos microorganismos em relação ao grupo (1) ocorreu no grupo tratado por CLX (2). As outras terapias mostraram uma sensível redução. A viabilidade por microscopia por fluorescência se mostrou semelhante em todos os grupos. A pesquisadora concluiu que a clorexidina

31 30 comprovou seu efeito antimicrobiano, porém mais estudos precisam ser realizados para verificar o real papel da PDT sobre biofilme dentário humano. Costa et al. (2011) estudaram culturas de suspensões planctônicas padronizadas (10 6 células/ml) de C. albicans e C. dubliniensis tratadas com concentrações de eritrosina de 0, µm e LEDs. Os biofilmes formados por C. albicans e C. dubliniensis, no fundo de uma placa de microtitulação de 96 poços foram tratados com 400 µm de eritrosina e LEDs. O efeito antimicrobiano da PDT contra culturas planctônicas e biofilmes foram verificadas através da contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/ ml), e os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey (P<0,05). C. albicans e C. dubliniensis não foram detectáveis após PDT de culturas planctônicas com concentrações de 3,12 µm eritrosina ou superior. Concluíram que C. albicans e C. dubliniensis foram sensíveis à eritrosina e LED mediada por PDT, mas os biofilmes de ambas as espécies de Candida foram mais resistentes do que os seus homólogos planctônicos. Costa et al. (2011) avaliaram os efeitos da terapia fotodinâmica (PDT) com rosa bengala ou eritrosina com diodo emissor de luz (LED) em Candida albicans culturas planctônicas e biofilme. Culturas planctônicas e biofilme de cada cepa C. albicans foram submetidos às seguintes condições experimentais: (a) tratamento com rosa bengala e LED (L+RB+); (b) o tratamento com eritrosina e LED (E+L+); e (c) grupo controle, sem irradiação LED ou tratamento fotossensibilizador (P-L-). Após a irradiação das culturas planctônicas e biofilmes, as culturas foram semeadas em ASD (37 C a 48h) para contagem de unidades formadoras de colônias (UFC ml -1 ) seguido por posterior teste ANOVA e teste de Tukey (P<0,05 ). Os biofilmes foram analisados por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados revelaram uma redução significativa das culturas planctônicas para culturas que foram submetidos à PDT usando eritrosina ou Rosa Bengala. Os resultados mostraram que eritrosina e rosa bengala mediada pela PDT com irradiação LED é efetiva no tratamento de C. albicans. Dai et al. (2011) investigaram a terapia fotodinâmica (PDT) utilizando corante azul e luz vermelha, para a profilaxia e tratamento de infecções cutâneas por Candida albicans em camundongos. Um modelo de rato de abrasão da pele infectada com C. albicans foi desenvolvido em feridas medindo 1,2 centímetros por