Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 1

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1 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 1

2 Colaboraram nesta edição: BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento KL3 Publicações Fundador Henrique da Silva Castro Direção Geral e Edição Ana Lúcia de Almeida Diretor de Arte Henrique Castro Fº Projeto Gráfico Agência de Comunicação IRIS Portal Departamento Comercial, Redação e Edição: SHIN CA 01 - Lote A - Bloco A - Sala 223 Shopping Deck Norte Lago Norte Brasília - DF CEP: Os artigos assinados são de inteira responsabilidade de seus autores. ISSN Aline Oliboni de Azambuja Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Andresa Patrícia Regert Lucho Engenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Diouneia Lisiane Berlitz Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Emerson Luís Nunes Costa Engenheiro Agrônomo (UFRGS) e Mestre e Doutor em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS) Gabriela Cristina Alles Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Jaime Vargas de Oliveira Engenheiro Agrônomo (UFSM), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade/Entomologia (UFPEL), Laura Massochin Nunes Pinto Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Leila Lucia Fritz Bióloga (UNISINOS) e Mestranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Lidia Mariana Fiúza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). Marcus Hübner Biólogo (FURG) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Maria Helena Ribeiro Reche Bióloga (UPF) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Neiva Knaak Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Raquel Castilhos-Fortes Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente (UFRGS) Rogério Schünemann Biólogo (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Vilmar Machado Biólogo (UNISINOS) e Mestre e Doutor em Genética e Biologia Molecular (UFRGS) Nota: A Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, é indexada na AGROBASE ( base de dados da Agricultura Brasileira) BINAGRI- Biblioteca Nacional de Agricultura- MAPA- Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. no Agris ( International Information System for the Agricultural Sciences and Technology) da FAO e atende a obrigatoriedade do Depósito Legal na Biblioteca Nacional do Rio de Janeiro - Fundação Biblioteca Nacional. 2 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

3 Conselho Científico Dr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento Vegetal Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia; Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal; Dra. Lidia Mariana Fiuza - Microbiologia e Entomologia Agrícola; Dr. Maçao Tadano - Agricultura; Dr. Naftale Katz - Saúde; Dr. Pedro Jurberg - Ciências; Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas; Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos; Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental. Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi Dr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia Fundação Dalmo Catauli Giacometti Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética; Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico; Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN Dr. José Roberto Rogero Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec Dr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPA Dr. Diógenes Santiago Santos - UFRGS Dr. José Luiz Lima Filho - UFPE Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ Carta ao Leitor EDIÇÃO /2010 bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) tem o carisma mundial dos microbiologistas e entomologistas. Esse entomopatógeno ubíquo é ímpar no potencial biotecnológico aplicado no controle biológico nas áreas agrícolas, florestais, de saúde animal e humana. Nessas áreas, o microrganismo pode ser utilizado como biopesticida formulado, registrado e comercializado ou seus genes podem ser adaptados e incorporados no genoma das plantas por meio da engenharia genética, atualmente denominadas plantas-bt. Nos estudos dessa bactéria há cooperações multidisciplinares que permitem as análises da biologia, toxicologia e ecologia microbiana, as quais são tratadas nessa edição. O objetivo dessa publicação é apresentar o estado da arte sobre o entomopatógeno B. thuringiensis, com dados bibliográficos e resultados de pesquisa obtidos pelo grupo de pesquisa CNPq/UNISINOS: Manejo e Toxicologia em Agroecossistemas, onde atuam estudantes de Graduação e Pós-Graduação da Biologia da UNISINOS, além de professores e pesquisadores colaboradores do IRGA, UFR- GS, UFPEL, UFSM, UCS, FIOCRUZ, EMBRAPA, CIRAD- Montpellier, Universidade de Otawa e Universidade de Nebraska. Dra. Lidia Mariana Fiuza Edição Especial - Ecotoxicologia de Bacillus thuringiensis, organizada e coordenada pela Dra. Lídia Mariana Fiuza, Professora Titular e Coordenadora Executiva do Programa de Pós-Graduação em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre da Universidade do Vale do Rio dos Sinos; Bolsista de Produtividade em Pesquisa do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Consultora Técnica do Instituto Rio Grandense do Arroz. PESQUISA ARTRÓPODES E BACTÉRIAS ENTOMOPATOGÊNICOS 04 ECOLOGIA DE BACILLUS ENTOMOPATOGÊNICOS 14 TOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS 24 MECANISMO DE AÇÃO DE BACILLUS THURINGIENSIS 32 TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS ÀS PRAGAS AGRÍCOLAS 36 TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS AOS INSETOS SOCIAIS 40 TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS ÀS PRAGAS URBANAS E VETORES 44 INTERAÇÕES DE BACILLUS THURINGIENSIS E O CONTROLE DE FITOPATÓGENOS 48 TOXICIDADE DE BACILLUS THURINGIENSIS EM ORGANISMOS NÃO-ALVO 54 PRODUTOS DE BACILLUS THURINGIENSIS: REGISTRO E COMERCIALIZAÇÃO 58 PLANTAS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAM TOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS E OUTRAS 62 EVOLUÇÃO E MANEJO DA RESISTÊNCIA DE INSETOS 68 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 3

4 Pesquisa Pesquisa ARTRÓPODES E BACTÉRIAS ENTOMOPATOGÊNICOS Emerson Luís Nunes Costa Engenheiro Agrônomo (UFRGS) e Mestre e Doutor em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS) ntre os artrópodes, os insetos são a maioria das espécies animais e têm importância nas mais diversas áreas. Na agricultura, podem ser úteis ou nocivos, atuando na manutenção do equilíbrio das populações como inimigos naturais, na polinização, na decomposição da matéria orgânica do solo e como pragas das culturas. Nesse trabalho são apresentadas algumas informações sobre a classe Insecta, destacando-se os insetos de importância agrícola, com a caracterização de ordens e subordens e exemplos de famílias e espécies de insetos-praga, vetores de fitopatógenos, predadores e parasitóides. Também constam dados sobre as bactérias que atuam como agentes microbianos aplicados no controle biológico de insetos. 1.1 A Classe Insecta 4 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 Andresa Patrícia Regert Lucho Engenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). A classe Insecta, com 29 ordens, pertence à superclasse Hexapoda e ao filo Arthropoda. Entre os aspectos que caracterizam a maioria dos representantes da classe Insecta estão: corpo dividido em três porções (cabeça, tórax e abdome), cabeça com um par de antenas, olhos compostos, peças bucais expostas (ectognatos), tórax com três segmentos, três pares de pernas, nenhum, um ou dois pares de asas, e abdome com 6 a 11 segmentos. Durante o desenvolvimento, os insetos sofrem metamorfose, por meio de muda do tegumento (ecdise). Insetos hemimetábolos são aqueles que sofrem metamorfose chamada incompleta, passando pelas fases de ovo, ninfa e adulto. Nesse caso os indivíduos jovens são muito semelhantes aos adultos, mas apresentam o sistema reprodutivo imaturo e, no caso de insetos alados, nota-se o desenvolvimento das asas, observandose a presença de tecas alares. Insetos holometábolos têm metamorfose completa, passando pelas fases de ovo, larva, pupa e adulto. Nesse caso, os indivíduos jovens são bem diferentes dos adultos, como ocorre com as borboletas e moscas, onde inclusive há mudança no aparelho bucal. Os besouros também têm metamorfose completa, com larvas morfologicamente diferentes dos adultos, mas normalmente o tipo de aparelho bucal se mantém. A classe Insecta representa 70% das espécies animais, e encontra-se distribuída nos mais diferentes ambientes, onde os insetos, com aspectos positivos ou negativos, destacam-se como organismos de importância, como na indústria têxtil (o bicho da seda), na alimentação (o mel produzido pela abelha), na saúde humana (moscas, mosquitos, percevejos e outros insetos transmissores de agentes patogênicos), na veterinária (insetos transmissores de moléstias em animais) e na agricultura. 1.2 Importância dos insetos na agricultura Leila Lucia Fritz Bióloga (UNISINOS) e Mestranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Na agricultura, a ocorrência de insetos também tem seus aspectos positivos e negativos. Sob o aspecto negativo estão os insetos que se alimentam de plantas e causam danos econômicos a diversas culturas agrícolas. Os insetospraga, pelo hábito de alimentarem-se de vegetais, são chamados de fitófagos. Dependendo da estrutura vegetal da qual se alimentam, também recebem denominações específicas. Assim, os que se alimentam de frutos são os carpófagos; de raízes, rizófagos; de folhas, filófagos; de madeira, xilófagos; sugadores de seiva são fitossucsívoros. Além dos danos causados de forma direta, pela alimentação, alguns insetos causam danos indiretos às culturas, atuando como vetores de fitopatógenos (Tabela 1). Também há insetos que estão associados à ocorrência de moléstias, devido a injúrias que causam nos tecidos vegetais pelos hábitos alimentares ou de postura, favorecendo a penetração de patógenos. Como exemplos podem ser citados o minador-dos-citros (Phyllocnistis citrela), que favorece a ocorrência do cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, o tripes Thrips tabaci associado à ocorrência do fungo Alternaria porri, causador da mancha púrpura em alho e cebola, e as moscas-das-frutas, cujos hábitos de postura, alimentação e desenvolvimento facilitam a ocorrência de patógenos causadores de podridões em frutos, como o fungo Monilinia fructicola, causador da podridão parda em frutos de pêssego. Insetos sugadores que excretam substâncias açucaradas estão associados à ocorrência de fumagina, caracterizada pelas estruturas fuliginosas do fungo Capnodium sp. Sob o aspecto positivo estão os insetos polinizadores, muitos deles essenciais para a formação de frutos e conseqüentemente de sementes; os insetos subterrâneos que atuam na decomposição da matéria orgânica e em outras características desejáveis nos solos destinados à produção agrícola e, ainda, os inimigos naturais, que se alimentam de outros insetos, muitas vezes mantendo as populações de pragas em níveis que não causam dano econômico e sem necessidade de adoção de outros métodos de controle. Entre os inimigos naturais, na classe Insecta, Lidia Mariana Fiuza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD- Montpellier). espécies predadoras ocorrem em 22 ordens, enquanto cinco ordens têm representantes parasíticos (Berti Filho & Ciociola, 2002). Os predadores, durante seu ciclo evolutivo, podem consumir diversas presas. Normalmente são mais generalistas, pois atacam diferentes espécies, que podem pertencer a diferentes famílias ou ordens, incluindo insetos-praga ou não. Na Tabela 2 são apresentados alguns insetos predadores e suas presas. Os parasitóides são em geral mais específicos, ou seja, especializados a determinados hospedeiros. Assim, normalmente são mais restritos à espécie, família ou ordem. Tais inimigos naturais dependem de apenas um hospedeiro para completar seu ciclo de desenvolvimento, e diferenciam-se dos parasitas porque causam a morte do hospedeiro e os adultos têm vida livre. Atacam em geral as formas jovens dos insetospraga, inclusive ovos. Quando ocorrem em posturas, controlam a praga antes dessa causar danos às culturas. Na Tabela 3 são apresentados alguns insetos parasitóides e seus hospedeiros. De acordo com Berti Filho & Ciociola (2002), o impacto de predadores é mais difícil de avaliar do que o de parasitóides, pois estes podem ser observados em seus hospedeiros, enquanto os predadores dificilmente deixam sinais de ataque, principalmente quando consomem toda a presa. Ao contrário dos predadores, os parasitóides têm alta capacidade de encontrar seus hospedeiros, inclusive quando a densidade populacional de fitófagos é baixa (Shepard et al., 1987 e 1995). 1.3 Ordens, subordens e famílias de insetos de importância agrícola Dentre as 29 ordens da classe Insecta, nove destacam-se pela importância agrícola de seus representantes: Coleoptera, Diptera, Hemiptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Neuroptera, Orthoptera e Thysanoptera. O Quadro 1 apresenta informações sobre características gerais, famílias e espécies das principais ordens e subordens de insetos de importância agrícola. Nesse contexto, as plantas de arroz (Orysa sativa L.) são hospedeiros para um grande número de insetos-praga e a ação desses artrópodes é um dos principais fatores que afetam a orizicultura, pois as perdas variam entre 10 e 35% da produção. No entanto, são poucos os insetos que podem ser considerados pragas, pois muitos deles são inimigos naturais que estão associados ao controle biológico dos insetos-pra-

5 Figura 1. Abundância de insetos e inimigos naturais em lavouras de arroz irrigado, RS ga. Fritz et al. (2008) analisaram a abundância de insetos-praga e inimigos naturais presentes em áreas de arroz irrigado em Cachoeirinha (RS). Foram quantificados 1015 indivíduos subdivididos em 10 ordens de insetos e 2 ordens de aracnídeos (Figura 1). Os dípteros apresentaram maior abundância dentre os insetos (51,92%), seguido de Hemiptera (14%), Hymenoptera (8,87%), Collembola (8,18%), Coleoptera (3,05%), Orthoptera (2,56%), Odonata (1,28%), Psocoptera (0,98%), Lepidoptera (0,69%) e Dermaptera (0,1%). Acredita-se que as larvas de mosquitos vêm desenvolvendo resistência aos inseticidas que são utilizados frequentemente em lavouras orizícolas, tornando-se conseqüentemente abundantes nesses agroecossistemas (Victor & Reuben, 2000). Entre os insetos, Coleoptera é a ordem dos besouros ou cascudos. Há inúmeras espécies de coleópteros fitófagos, sendo que em muitos casos, tanto as larvas quanto os adultos alimentam-se de plantas. Nessa ordem, há insetos-praga de diferentes hábitos: filófagos, rizófagos, xilófagos, carpófagos, entre outros. Há também várias espécies que atacam produtos armazenados. Entre as famílias, destaca-se Curculionidae, dos gorgulhos ou bicudos, que é a maior família do mundo, com cerca de espécies descritas, sendo a maioria das espécies fitófagas, e as larvas geralmente desenvolvem-se no interior de partes vegetais, como brocas. Na ordem Coleoptera também há insetos que são inimigos naturais, pois atuam no controle biológico como predadores de outros insetos. Nesse caso destacam-se as famílias Carabidae e Coccinellidae (joaninhas), onde a maioria das espécies, tanto na fase de larva como de adulto, são predadoras de insetos-praga. Em Diptera, a ordem das moscas e mosquitos, também há insetos-praga e inimigos naturais. Entre os insetos fitófagos destaca-se a família Tephritidae, das moscas-das-frutas. Entre os inimigos naturais destacam-se as famílias Syrphidae, com espécies cujas larvas são predadoras, e Tachinidae, com espécies que desenvolvem-se como parasitóides. A ordem Hemiptera é composta por insetos de hábito sugador. Anteriormente, Hemiptera era a ordem apenas dos percevejos. Atualmente, inclui também cigarras, cigarrinhas, pulgões, cochonilhas, psilídeos e moscas-brancas, que pertenciam à ordem Homoptera, atualmente não mais considerada como ordem em Insecta. Além dos danos diretos causados pelos insetos fitófagos da ordem Hemiptera, que sugam líquidos de diferentes partes vegetais, também há os danos indiretos, principalmente relacionados à transmissão de fitopatógenos. Em Hemiptera, inimigos naturais ocorrem apenas na subordem dos percevejos (Heteroptera), onde em algumas famílias há espécies predadoras de insetos (sugam hemolinfa). No entanto, tais famílias não são exclusivas de espécies entomófagas. Em Reduviidae há também espécies hematófagas (os barbeiros) e em outras, como Pentatomidae, há um grande número de espécies fitófagas. Em Hymenoptera estão as abelhas, vespas, vespinhas e formigas. Nessa ordem há diversas espécies que atuam como polinizadores. Entre os fitófagos destaca-se a família Formicidae, que inclui as formigas-cortadeiras. Mas é no controle biológico que a ordem Hymenoptera destacase, pela grande quantidade de famílias e espécies de parasitóides. Entre os predadores, destaca-se a família Vespidae. Na ordem Isoptera estão os cupins, com espécies consideradas pragas de diversas culturas, como pastagens, cana-de-açúcar e florestais. Em Lepidoptera, a ordem das mariposas e borboletas, estão espécies de insetos-praga com diferentes hábitos alimentares, como filófagos, xilófagos, carpófagos, rizófagos, minadores de folhas, espécies que atacam produtos armazenados, entre outras. No entanto, os danos dos lepidópteros às culturas são causados quase que exclusivamente pelas formas jovens, conhecidas como lagartas. Entre as famílias de Lepidoptera destaca-se Noctuidae, que inclui diversas espécies que causam danos a culturas de grande importância econômica. Em Noctuidae estão a lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis) e Spodoptera frugiperda, uma praga polífaga conhecida como lagarta-militar, lagarta-do-cartucho-do-milho ou lagarta-da-folhado-arroz. A ordem Neuroptera é composta por insetos predadores, com destaque para a família Chrysopidae, cujas larvas são conhecidas como bicholixeiro, pois carregam os restos mortais das presas aderidos ao corpo. Em Orthoptera, ordem dos gafanhotos, grilos, esperanças e grilotalpas, as espécies de insetos-praga são normalmente polífagas, com destaque para as famílias Acrididae, do gafanhoto-crioulo e Gryllotalpidae, dos grilotalpas ou cachorrinhos-da-terra. Na ordem Thysanoptera estão os insetos conhecidos como tripes ou trips, sendo a maioria das espécies fitófagas e algumas associadas à transmissão de viroses de plantas. A ordem Araneae conta com mais de espécies, incluídas em gêneros e 109 famílias no mundo (Platnick, 2008). Elas estão distribuídas em agroecossistemas terrestres e são consideradas um dos mais abundantes grupos de invertebrados predadores, além de possuírem a vantagem de não danificar as plantas e controlarem eventuais explosões populacionais de insetos, limitando o canibalismo e territoriedade. No entanto, os pesticidas não seletivos têm sido considerados um risco para as espécies de aranhas benéficas. Fritz et al. (2008) analisaram as populações de aranhas em lavouras orízicolas orgânicas e convencionais (com aplicação de inseticida), coletadas de 3 regiões produtoras de arroz irrigado do RS. Nesses agroecossistemas foram coletadas 1148 aranhas, entre jovens e adultos, havendo maior abundância em lavouras orgânicas (765) que diferiram significativamente das lavouras com aplicações de inseticidas (383). Das 12 famílias registradas predominaram Araneidae e Tetragnathidae que foram fortemente afetadas pelos inseticidas, reduzindo em até 80% da população (Figura 2). 1.4 Bactérias Entomopatogênicas As toxinas bacterianas com atividade inseticida potencialmente aplicadas no controle de insetos-praga das plantas cultivadas e vetores de doenças animais e humanas foram casualmente descobertas no final do século XIX, através das investigações das doenças que ocorriam nas criações de abelhas melíferas (Apis mellifera) e do bichoda-seda (Bombyx mori). A documentação da taxonomia geral bacteriana efetuada por Breed et al. (1957) e o levantamento de espécies de bactérias relacionadas com insetos hospedeiros descrito por Steinhaus (1947), podem ser considerados trabalhos pioneiros e fundamentais à taxonomia de bactérias que causam doenças em insetos. A taxonomia bacteriana moderna baseia-se em critérios morfológicos, fisiológicos, sorológicos e genéticos. Atualmente são conhecidas inúmeras espécies de bactérias associadas a insetos, porém poucas apresentam as características desejáveis à aplicação no controle biológico de pragas, sendo na classificação das bactérias entomopatogênicas, os critérios de Falcon (1971) os mais viáveis por agruparem as bactérias em apenas duas categorias: esporulantes e não-esporulantes. Entre essas categorias destacam-se com maior importância à patologia de insetos as espécies das famílias Bacillaceae e Enterobacteriaceae. As bactérias esporulantes apresentam uma característica de persistência, as quais podem se manter em condições ambientais adversas através de estruturas de resistência denominadas endósporos. Esta característica dessa categoria de bactérias vem sendo considerada um pré-requisito à produção de agentes microbianos em escala comercial. Como característica de bactérias entomopatogênicas potencialmente aplicadas no controle microbiano de insetos, destacam-se as espécies que apresentam alta virulência, elevada capacidade invasora e produção de toxinas, causando toxemias nos insetos alvo. Com essas características, na categoria de bactérias esporulantes destacam-se como gêneros de maior importância: Bacillus e Clostridium Gênero Bacillus Bacillus spp., em geral aeróbicas ou facultativamente anaeróbicas, encontram-se em substratos variáveis devido ao complexo enzimático produzido pelas células em forma de bastonetes, podendo essas se apresentarem individuais ou em cadeias. Esse gênero apresenta uma grande variação entre as espécies, porém as características entomopatogênicas associadas à formação de endós- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 5

6 poros e a produção de toxinas e enzimas determinam as seguintes espécies como promissoras ao controle de insetos prejudiciais: A. Bacillus thuringiensis Este microrganismo foi descoberto em 1902 por Ishiwata no Japão, através da criação massal de Bombix mori. Em 1911, B. thuringiensis foi novamente isolado por Berliner a partir de larvas de Ephestia kuehniella, na cidade de Thüringe, na Alemanha, de onde é originário seu atual nome. Os primeiros ensaios utilizando B. thuringiensis foram realizados na Europa entre os anos de 1920 e 1930, no controle de Ostrinia nubilalis, lepidóptero da família Pyralidae. Nos Estados Unidos e na Europa, entre os anos de 1930 e 1940, numerosos testes foram realizados contra outras espécies de lepidópteros. Atualmente, no caso do controle biológico, B. thuringiensis é o microrganismo mais utilizado em nível mundial. Para os microbiologistas, B. thuringiensis (Figura 3) é uma bactéria gram-positiva, esporulante, aeróbica ou facultativamente anaeróbica, naturalmente encontrado no solo. As espécies thuringiensis, cereus e anthracis do gênero Bacillus apresentam um grau de parentesco tão elevado, que muitas vezes dificulta, se não impossibilita, diferenciá-las através de provas bioquímicas e bacteriológicas mais simples. Durante muito tempo, as duas primeiras espécies foram consideradas como sendo uma única. O principal critério utilizado para a distinção entre essas bactérias é a produção de corpos de inclusões paraesporais durante o processo de esporulação do B. thuringiensis. No controle microbiano dos insetos, o entomopatógeno Bacillus thuringiensis (Bt) oferece as melhores alternativas como bioinseticida, mostrando-se também um bom candidato à obtenção de formulações comerciais, bem como à engenharia genética de plantas. B. Bacillus cereus B. cereus pode ser considerado como patógeno facultativo, devido ao seu hábito saprofítico e à adaptação à vida parasítica das linhagens entomopatogênicas, sendo atualmente ainda utilizado como opcional no controle de alguns lepidópteros, coleópteros e himenópteros quando o B. thuringiensis mostra-se ineficaz. O ingrediente ativo responsável pela virulência dessa bactéria corresponde a ação enzimática da lecitinase, descrita por Heimpel (1954, 1955). Em 1989, Rahmet-Alla & Rowley descreveram que a fosfolipase C de B. cereus estaria relacionada a sua atividade entomopatogênica. Essa bactéria caracteriza-se por apresentar células em forma de bastonetes com esporos centrais, não-cristalíferas e ausência de esporângio estendido. Alguns autores mencionam que além da lecitinase que levou certas linhagens a vida parasítica, o endósporo dessa bactéria contém proteína tóxica de baixa atividade específica, estruturalmente semelhante ao cristal de B. thuringiensis. Diversos estudos do modo de ação B. cereus mencionam que essa espécie não tolera meio alcalino e a enzima para ser ativa exige um ph entre 6,6 e 7,4, tornando essa bactéria específica a insetos cujo conteúdo intestinal encontra-se na faixa neutra, quando então são provocadas alterações no epitélio do intestino médio das larvas sensíveis, sendo os sintomas patológicos variáveis em função do modo de infecção por esse patógeno. C. Bacillus larvae Figura 2. Araneofauna em sistema de cultivo orgânico e convencional de arroz irrigado, RS Essa bactéria apresenta esporos centrais ou terminais que variam de elípticos a cilíndricos num esporângio distinto, sem corpo de inclusão paraesporal (cristal). Quando os esporos de B. larvae são ingeridos pelas larvas e pupas das abelhas, causam a doença americana das abelhas ou pútrida dos berçários. D. Bacillus alvei Essa espécie caracteriza-se por apresentar esporos centrais ou sub-terminais que variam de elípticos a cilíndricos. Essa espécie causa doença européia das crias das abelhas. E. Bacillus popilliae e Bacillus lentimorbus Essas espécies são patógenos obrigatórios, crescem pouco em meio de cultura, e têm como características esporos elípticos a cilíndricos, em esporângio nítido num bastonete. B. popilliae causa a doença leitosa do tipo A e B. lentimorbus causa a doença leitosa tipo B, ambas em larvas de escarabeídeos. As características de resistência dos esporos ao calor, à dessecação e à radiação, além da sua longevidade em larvas mortas e partículas de solo, tornam essas bactérias agentes promissores no controle de larvas de Popillia japonica e Amphimallon mojalis (na Europa e Austrália), além de Eutheola humilis, Stenocrates spp. e Migdolus morretesi (no Brasil). O mecanismo de ação é semelhante em ambas às espécies, cujas bactérias atuam por ingestão, passando do trato digestivo à hemolinfa, multiplicando-se, esporulando, causando a septicemia e morte dos insetos. F. Bacillus sphaericus Trata-se de uma espécie que apresenta esporos esféricos em posição terminal num esporângio distendido. Certas cepas dessa espécie produzem inclusões cristalinas (ou cristais), compostas por dois peptídeos de 42 e 51 kda que representam a toxina binária, com ação inseticida. Há cepas que sintetizam proteínas inseticidas de 100kDa. Essa bactéria é cosmopolita, tendo sido isolada de solo, água e do seu hospedeiro natural (pernilongos mortos). As cepas foram classificadas por sorotipos conforme o antígeno flagelar, totalizando atualmente cerca de 50 sorotipos, entre os quais 7 contêm cepas ativas contra larvas de dípteros e as cepas mais tóxicas apresentam como particularidade inclusões paraesporais cristalinas. Existem mais de 300 cepas de B. sphaericus catalogadas pelo Instituto Pasteur (Paris, França), sendo 50% dessas tóxicas às larvas de dípteros Gênero Clostridium O gênero Clostridium compreende cerca de 100 espécies distribuídas em 19 grupos de acordo com a homologia de ARN16s. As células são em forma de bastonetes, geralmente Gram-positivas, com endósporos ovais ou esféricos que as deformam. As espécies desse gênero são estritamente anaeróbias, havendo algumas que toleram a presença de oxigênio livre, porém não formam esporos. Essas bactérias são encontradas naturalmente no solo, sedimentos marinhos, restos animais e vegetais, assim como na flora intestinal de vertebrados e invertebrados, como os insetos. Os efeitos entomopatogênicos de C. brevifasciens e C. malacosomae foram observados em larvas de Malacosoma pluviale, havendo a germinação dos esporos na luz intestinal e o rápido crescimento vegetativo, o qual causa a morte em poucos dias, sem haver invasão na cavidade do corpo do inseto. Alguns autores citam que C. bifermentans malaysia sintetiza uma proteína tóxica às larvas de Aedes aegypti, Culex pipiens e Anopheles stephensi, a qual apresenta elevada similaridade as delta-endotoxinas sintetizadas pelo entomopatógeno B. thuringiensis. Figura 3. Bacillus thuringiensis em microscopia eletrônica de transmissão 6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

7 Quadro 1. Caracterização das principais ordens e subordens de insetos de importância agrícola, com exemplos de famílias e espécies ORDEM COLEOPTERA besouros Características gerais Asas anteriores do tipo élitros (consistência coriácea ou córnea) e posteriores membranosas; Aparelho bucal mastigador; Metamorfose completa : Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto); Mais de espécies descritas. Subordem Adephaga Características gerais Porção ventral do segmento abdominal (urosternito) basal divido pelas cavidades coxais do terceiro par de pernas; Em geral, predadores. Principal família de importância agrícola Carabidae: adultos e larvas predadores (Ver Tabela 2) Subordem Polyphaga Características gerais Porção ventral do segmento abdominal (urosternito) basal não divido pelas cavidades coxais do terceiro par de pernas; Maioria das famílias de Coleoptera. Principais famílias de importância agrícola Anobiidae: Lasioderma serricorne besouro-do-fumo Bostrichidae: Rhyzopertha dominica - besourinho-do-trigo Buprestidae: Colobogaster cyanitarsis broca-da-figueira Bruchidae: Acanthoscelides obtectus caruncho-do-feijão Cerambycidae: Oncideres impluviata - serrador-da-acácia-negra Chrysomelidae: Diabrotica speciosa vaquinha ou brasileirinho Coccinellidae: joaninhas larvas e adultos predadores (Ver Tabela 2) Epilachna cacica joaninha-das-cucurbitáceas (fitófaga) Curculionidae: Anthonomus grandis bicudo-do-algodoeiro Oryzophagus oryzae gorgulho-aquático (adulto), bicheira-da-raiz-do-arroz (larva) Sitophilus zeamais gorgulho-do-milho Elateridae: Conoderus scalaris - larva-arame Meloidae: Epicauta atomaria burrinho Scarabaeidae: Euetheola humilis cascudo-preto-do-arroz Scolytidae: Hypothenemus hampei broca-do-café Tenebrionidae: Tribolium castaneum - besouro-do-milho Observação: As outras duas subordens (Archostemata e Myxophaga) têm pouco mais de 50 espécies descritas. ORDEM DIPTERA moscas e mosquitos Características gerais Asas anteriores membranosas; Asas posteriores modificadas em halteres ou balancins; Aparelho bucal sugador labial; Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto). Subordem Nematocera mosquitos, pernilongos e borrachudos Característica geral Antenas mais longas que o tórax. Principal família de importância agrícola Cecidomyiidae: Jatrophobia brasiliensis mosca-das-galhas-da-folha-da-mandioca Stenodiplosis sorghicola mosca-do-sorgo Subordem Brachycera moscas Característica geral Antenas curtas, com arista ou estilo no último segmento. Principais famílias de importância agrícola Agromyzidae: Liriomyza trifolii - mosca-minadora Syrphidae: larvas predadoras (Ver Tabela 2) Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 7

8 Tachinidae: parasitóides (Ver Tabela 3) Tephritidae: moscas-das-frutas - Ceratitis capitata mosca-do-mediterrâneo Anastrepha fraterculus mosca-sul-americana Anastrepha grandis - mosca-das-cucurbitáceas ORDEM HEMIPTERA - percevejos, cigarras, cigarrinhas, pulgões, cochonilhas, psilídeos e moscas-brancas Características gerais aparelho bucal sugador labial (rostro); ápteros ou com dois pares de asas, membranosas ou com o anterior total ou parcialmente mais resistente que o posterior; metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo, ninfa, adulto ou ovo, ninfa, pupário, adulto) Subordem Sternorrhyncha - cochonilhas, pulgões, moscas brancas e psilídeos Características gerais rostro emergindo entre as pernas anteriores; antenas longas ou curtas; ápteros ou alados (membranosas ou anteriores tégminas); ninfas e/ou adultos podem viver aderidos às plantas. Principais famílias de importância agrícola Aleyrodidae: moscas-brancas - Aleurothrixus floccosus Bemisia tabaci Aphididae: Aphis gossypii pulgão-do-algodoeiro Myzus persicae - pulgão-verde Toxoptera citricida - pulgão-preto-dos-citros Phylloxeridae: Daktulosphaira vitifoliae - filoxera-da-videira Psyllidae: Diaphorina citri - psilídeo-dos-citros Coccidae: Coccus viridis - cochonilha-verde Saissetia coffeae - cochonilha-parda Diaspididae: Chrysomphalus ficus cabeça-de-prego Lepidosaphis beckii - escama-vírgula Pinnaspis aspidistrae - escama-farinha Margarodidae: Eurhizococcus brasiliensis pérola-da-terra Icerya purchasi cochonilha-australiana Pseudococcidae: Planococcus citri cochonilha-branca Pseudococcus maritimus - cochonilha-branca Subordem Auchenorrhyncha cigarras e cigarrinhas Características gerais rostro emergindo da parte inferior da cabeça; antenas setáceas curtas; asas membranosas ou anteriores tégminas; ninfas e adultos de vida livre. Principais famílias de importância agrícola Cicadidae: Quesada gigas cigarra-do-cafeeiro Cercopidae: Deois flavopicta - cigarrinha-das-pastagens Mahanarva fimbriolata cigarrinha-da-raiz-da-cana-de-açúcar Mahanarva posticata cigarrinha-da-folha-da-cana-de-açúcar Notozulia entreriana - cigarrinha-das-pastagens Cicadellidae: Dalbulus maidis cigarrinha-do-milho Empoasca kraemeri - cigarrinha-verde-do-feijoeiro Subordem Heteroptera percevejos Características gerais rostro articulado; asas anteriores do tipo hemiélitro. Principais famílias de importância agrícola Cydnidae: Scaptocoris castanea - percevejo-castanho Coreidae: Diactor bilineatus - percevejo-do-maracujá Phthia picta percevejo-do-tomate Pentatomidae: Nezara viridula percevejo-verde-da-soja Oebalus poecilus - percevejo-do-grão-do-arroz Tibraca limbativentris percevejo-do-colmo-do-arroz Reduviidae : predadores (Ver Tabela 2) 8 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

9 ORDEM HYMENOPTERA abelhas, formigas, vespas, vespinhas Características gerais Asas membranosas; Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto) Subordem Apocrita abelhas, formigas, marimbondos, vespinhas Característica geral Abdome livre ou pedunculado Principais famílias de importância agrícola Apidae: abelhas - Trigona spinipes - abelha-irapuá (fitófaga) Formicidae: Atta spp. - saúvas Acromyrmex spp. - quenquéns Vespidae: predadores (ver Tabela 2) Observação: Famílias de hymenópteros parasitóides (ver Tabela 3) Subordem Symphita Característica geral Abdome séssil Família de importância agrícola Siricidae: Sirex noctilio - vespa-da-madeira ORDEM ISOPTERA cupins Características gerais Aparelho bucal mastigador; Antenas moniliformes; Asas presentes nas formas reprodutivas, membranosas, ambos os pares iguais; Asas com sutura basal, que se rompe após a revoada, destacando as asas do corpo; Metamorfose completa: holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto); Espécies sociais, formando castas: sexuados alados (formam novos cupinzeiros), sexuados ápteros (rei e rainha) e estéreis (operários e soldados); Fontanela: onde localiza-se glândula com função de defesa dos cupins superiores. Principal família de importância agrícola Termitidae: Cornitermes cumulans Nasutitermes globiceps ORDEM LEPIDOPTERA borboletas e mariposas Características gerais Asas membranosas cobertas por escamas Aparelho bucal sugador maxilar (espiritromba ou probóscida) Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva (=lagarta), pupa (=crisálida), adulto) Subordem Glossata Característica geral Espiritromba formada pelas gáleas maxilares Principais famílias de importância agrícola Crambidae: Azochis gripusalis broca-da-figueira Diatraea saccharalis - broca-da-cana-de-açúcar Gelechiidae: Phthorimaea operculella traça-da-batata Sitotroga cerealella - traça-dos-cereais Noctuidae: Agrotis ipsilon lagarta-rosca Alabama argillacea - curuquerê-do-algodoeiro Anticarsia gemmatalis lagarta-da-soja Helicoverpa zea - lagarta-da-espiga-do-milho Mocis latipes lagarta-dos-capinzais Spodoptera frugiperda lagarta-do-cartucho-do-milho, lagarta-da-folha-do-arroz Pseudaletia sequax lagarta-do-trigo Pieridae: Ascia monuste orseis - curuquerê-da-couve Pyralidae: Elasmopalpus lignosellus lagarta-elasmo Plodia interpunctella traça-indiana Sphingidae: Erinnyis ello mandarová-da-mandioca Manduca sexta - mandarová-do-fumo Tortricidae: Cydia pomonella traça-da-maçã Grapholita molesta mariposa-oriental Observação: Cada uma das outras três subordens (Aglossata, Heterobathmiina e Zeugloptera) tem apenas uma família. Como característica geral dessas subordens, as gáleas maxilares não formam espiritromba (probóscida). Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 9

10 ORDEM NEUROPTERA Características gerais Asas membranosas com sistema variado de nervuras ; Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto); Larvas predadoras. Principal família de importância agrícola Chrysopidae predadores (ver Tabela 2) ORDEM ORTHOPTERA gafanhotos, grilos, esperanças e grilotalpas Características gerais Terceiro par de pernas saltatorial; Antenas filiformes ou setáceas; Aparelho bucal mastigador; Asas com par anterior do tipo tégmina e posterior membranosa; Metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo, ninfa, adulto). Subordem Caelifera - gafanhotos Características gerais Antenas curtas; Tímpanos, quando presentes, localizados no primeiro segmento do abdome. Principal família de importância agrícola Acrididae: Rhammatocerus schistocercoides gafanhoto-crioulo Subordem Ensifera - esperanças, grilos e grilotalpas Características gerais Antenas longas; Tímpanos, quando presentes, localizados nas tíbias anteriores. Principal família de importância agrícola Gryllotalpidae Neocurtilla hexadactyla grilotalpa ou cachorrinho-da-terra ORDEM THYSANOPTERA - tripes ou trips Características gerais Aparelho bucal sugador labial triqueta (raspador-sugador); Antenas filiformes ou moniliformes; Asas franjadas; Metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo-ninfa-ninfa imóvel-adulto). Subordem Tubulifera Característica geral Último segmento abdominal em forma de tubo. Subordem Terebrantia Característica geral Último segmento abdominal arredondado ou cônico. Principal família de importância agrícola Thripidae: Frankliniella schultzei Thrips palmi Thrips tabaci Croft, 1990; Heinrichs, 1994; Gallo et al., 2002; Heinrichs & Barrion, 2004; Lucho, Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

11 Tabela 1: Alguns insetos vetores de fitopatógenos INSETOS VETORES PATÓGENOS DOENÇAS CULTURAS Acrogonia citrina (Hem.: Cicadellidae) Aphis gossypii (Hem.: Aphididae) Bactéria - Xylella fastidiosa Cucumber mosaic virus (CMV) Papaya ringspot virus type P (PRSV-P) Passion fruit woodiness virus (PWV) Clorose variegada dos citros (CVC) Mosaico da bananeira Mosaico do mamoeiro Endurecimento dos frutos Citros Bananeira Mamoeiro Maracujazeiro Bemisia tabaci (Hem.: Aleyrodidae) Cerotoma arcuata(col.: Chrysomelidae) Dalbulus maidis(hem.: Cicadellidae) Diabrotica speciosa (Col.: Chrysomelidae) Diaphorina citri (Hem.: Psyllidae) Dilobopterus costalimai(hem.: Cicadellidae) Frankliniella occidentalis(thy.: Thripidae) Frankliniella schultzei(thy.: Thripidae) Hypocryphalus mangiferae (Col.: Scolytidae) Myzus persicae (Hem.: Aphididae) Myndus crudus(hem.: Cixiidae) Oncometopia facialis (Hem.: Cicadellidae) Planococcus ficus (Hem.: Pseudococcidae) Pseudococcus longispinus(hem.: Pseudococcidae) Rhopalosiphum maidis(hem.: Aphididae) Bean golden mosaic virus (BGMV) Bean rugose mosaic virus (BRMV) Fitoplasma Maize rayado fino virus (MRFV) Spiroplasma kunkelii Bean rugose mosaic virus (BRMV) Bactéria - Candidatus liberibacter spp. Bactéria - Xylella fastidiosa Tospovírus Tospovírus Fungo: Ceratocystis fimbriata Papaya ringspot virus type P (PRSV-P) Passion fruit woodiness virus (PWV) Potato leafroll virus (PLRV) Potato virus Y (PVY) Soybean mosaic virus (SMV) Phytoplasma palmae Bactéria - Xylella fastidiosa Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV) Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV) Soybean mosaic virus (SMV) Sugarcane mosaic virus (SCMV) Mosaico dourado do feijoeiro Mosaico rugoso da soja Enfezamento vermelho do milho Risca do milho Enfezamento pálido Mosaico rugoso da soja Greening ou Huanglongbing (HLB) Clorose variegada dos citros (CVC) Vira-cabeça Vira-cabeça Seca da mangueira Mosaico do mamoeiro Endurecimento dos frutos Enrolamento da folha da batateira Mosaico do pimentão Mosaico comum da soja Amarelecimento letal Clorose variegada dos citros (CVC) Enrolamento da folha Enrolamento da folha Mosaico comum da soja Mosaico comum Feijoeiro Feijoeiro e soja Milho Milho Milho Feijoeiro e soja Citros Citros Fumo, tomate e outras solanáceas Fumo, tomate e outras solanáceas Mangueira Mamoeiro Maracujazeiro Batata Solanáceas Soja Coqueiro Citros Videira Videira Soja Milho, sorgo, cana-de-açúcar Thrips palmi(thy.: Thripidae) Tospovírus Toxoptera citricidus(hem.: Citrus tristeza virus (CTV) Aphididae) Papaya ringspot virus type P (PRSV-P) Passion fruit woodiness virus (PWV) Kimati et al., 1997; Gallo et al., 2002; Oliveira et al., Vira-cabeça Tristeza dos citros Mosaico do mamoeiro Endurecimento dos frutos Tabela 2: Alguns insetos predadores e suas presas ORDENS E FAMÍLIAS PREDADORES PRESAS Coleoptera Carabidae Callida scutellaris lagartas Calosoma granulatum lagartas Lebia concina lagartas Coccinellidae (joaninhas) Azya luteipes cochonilhas Eriopis connexa pulgões Cycloneda sanguinea pulgões Pentilia egena cochonilhas Rodolia cardinalis cochonilhas Dermaptera Forficulidae (tesourinhas) Doru luteipes lagartas e ovos Diptera Syrphidae Pseudodoros clavatus pulgões Salpingogaster nigra ninfas de cigarrinhas Hemiptera Anthocoridae Orius insidiosus lagartas, ovos, tripes, pulgões Lygaeidae Geocoris sp. lagartas e ovos Nabidae Nabis sp. lagartas e ovos Pentatomidae Podisus nigrispinus lagartas e ovos Reduviidae Zelus sp. lagartas, coleópteros Hymenoptera Vespidae Polistes sp. lagartas Polybia sp. lagartas Neuroptera Fumo, tomate e outras solanáceas Citros Mamoeiro Maracujazeiro Chrysopidae Chrysopa sp. pulgões, cochonilhas, moscas-brancas Chrysoperla sp. pulgões, cochonilhas, moscas-brancas Gallo et al., 2002; Silva et al., 2002; De Bortoli et al., Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 11

12 Tabela 3: Alguns insetos parasitóides e seus respectivos hospedeiros ORDENS E FAMÍLIAS PARASITÓIDES HOSPEDEIROS CULTURAS Hymenoptera Aphelinidae Bethylidae Braconidae Chalcididae Encyrtidae Eulophidae Ibaliidae Ichneumonidae Scelionidae Trichogrammatidae Diptera Tachinidae Aphelinus mali Encarsia (Prospaltella) berlesei Vespa-de-uganda Prorops nasuta Apanteles sp. Aphidius sp. Apanteles subandinus Chelonus insularis Colastes letifer Cotesia flavipes Diachasmimorpha longicaudata Hypomicrogaster hypsipylae Brachymeria pseudoovata Ageniaspis citricola Proacrias coffeae Tetrastichus giffardianus Ibalia leucospoides Campoletis flavicincta Coccygomimus tomyris Microcharops bimaculata Telenomus podisi Trissolcus basalis Trissolcus urichi Trichogramma galloi Trichogramma pretiosum Archytas incertus Archytas lopesi Archytas pseudodaemon Hemisturmia sp. Lespesia affinis Trichopoda nitens Xanthozona melanopyga 12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 Pulgão-lanígero Eriosoma lanigerum(hem.: Aphididae) Cochonilha-branca Pseudaulacaspis pentagona (Hem.: Diaspididae) Broca-do-café Hypothenemus hampei (Col.: Scolytidae) Mandarová-do-fumo Manduca sexta (Lep.: Sphingidae) Pulgão-verdeMyzus persicae (Hem.: Aphididae) Pulgão-do-algodoeiroAphis gossypii(hem.: Aphididae) Pulgão-da-espigaSitobion avenae(hem.: Aphididae) Traça-da-batataPhthorimaea operculella(lep.: Gelechiidae) Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodoptera frugiperda(lep.: Noctuidae) Bicho-mineiro Leucoptera coffeella(lep.: Lyonetiidae) Broca-da-cana Diatraea saccharalis(lep.: Crambidae) Mosca-do-mediterrâneo Ceratitis capitata (Dip.: Tephritidae) Broca-do-cedroHypsipyla grandella(lep.: Pyralidae) Traça-dos-cachos Cryptoblabes gnidiella(lep.: Pyralidae) Minador-dos-citros Phyllocnistis citrella(lep.: Gracillariidae) Bicho-mineiro Leucoptera coffeella(lep.: Lyonetiidae) Mosca-do-mediterrâneo Ceratitis capitata(dip.: Tephritidae) Vespa-da-madeira Sirex noctilio(hym.: Siricidae) Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodoptera frugiperda(lep.: Noctuidae) Lagarta-cachorrinho Eupseudosoma aberrans (Lep.: Arctiidae) Lagarta-mede-palmo Sabulodes caberata caberata (Lep.: Geometridae) Lagarta-da-soja Anticarsia gemmatalis(lep.: Noctuidae) Percevejo-marrom Euschistus heros(hem.: Pentatomidae) Percevejo-do-colmoTibraca limbativentris(hem.: Pentatomidae) Percevejo-verde-da-soja Nezara viridula (Hem.: Pentatomidae) Percevejo-do-colmoTibraca limbativentris(hem.: Pentatomidae) Broca-da-cana Diatraea saccharalis(lep.: Crambidae) Broca-pequena-do-fruto Neoleucinodes elegantalis(lep.: Crambidae) Lagarta-da-espiga-do-milho Helicoverpa zea(lep.: Noctuidae) Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodoptera frugiperda(lep.: Noctuidae) Lagarta-das-folhas Rolepa unimoda(lep.: Lymantriidae) Lagarta-cachorrinho Eupseudosoma aberrans (Lep.: Arctiidae Mariposa-violácea Sarsina violascens(lep.: Lymantriidae) Lagarta urticante Lonomia circumstans(lep.: Saturniidae) Lagarta-cachorrinho Eupseudosoma aberrans (Lep.: Arctiidae) Percevejo-verde-da-soja Nezara viridula (Hem.: Pentatomidae) Lagarta-das-palmeiras Brassolis sophorae(lep.: Nymphalidae) Macieira e outras rosáceas Pessegueiro, amoreira e outras frutíferas Cafeeiro Fumo Diversas culturas, como as solanáceas Diversas culturas, como algodão, solanáceas e cucurbitáceas Diversas culturas, como trigo, aveia, cevada Batata Diversas culturas, como milho, arroz, algodoeiro Cafeeiro Cana-de-açúcar, milho e outras Poaceae (gramíneas) Frutíferas diversas Cedro, mogno e outras espécies florestais Videira Citros Cafeeiro Frutíferas diversas Pinus Diversas culturas, como milho, arroz, algodoeiro Eucalipto Eucalipto Soja e outras Fabaceae (leguminosas) Soja Arroz Diversas culturas, como soja e mamoeiro Arroz Cana-de-açúcar, milho e outras Poaceae (gramíneas) Tomateiro e outras solanáceas Milho, sorgo e outras Poaceae (gramíneas) Diversas culturas, como milho, arroz, algodoeiro Ipê Eucalipto Eucalipto Cafeeiro Eucalipto Diversas culturas, como soja e mamoeiro Coqueiro, dendezeiro e outras palmeiras Sampaio et al., 2001; Gallo et al., 2002; Rodrigues et al., 2004; Pratissoli et al., 2005; Carvalho, 2005; Maciel et al., 2007.

13 1.5 Referências Berti Filho, E.; Ciociola, A.I. Parasitóides ou predadores? Vantagens e desvantagens. In: Parra, J.R.P. (ed.); Botelho, P.S.M.; Corrêa-Ferreira, B.S.; Bento, J.M.S. Controle biológico no Brasil: parasitóides e predadores. São Paulo: Manole, Cap. 3: 29-41, Breed, R. S.; Murray, E. G. D.; Smith, N. R. (ed.) Berguey s manual of Determinative Bacteriology, 7 ed. Baltimore, Willians & Willians (ed.), 1246p. Carvalho, R. da S. Assincronia de emergência como método para a separação de adultos de Ceratitis capitata e do parasitóide exótico Diachasmimorpha longicaudata em criações artificiais de baixo custo. Cruz das Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Circular Técnica 78, 4p., Croft, B.A. Arthropod biological control agents and pesticides. 2nd, New York: John Wiley e Sons, 826 p., De Bortoli, S.A.; Oliveira, J.E.M.; Santos, R.F. dos; Silveira, L.C.P. 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14 Pesquisa Pesquisa ECOLOGIA DE BACILLUS ENTOMOPATOGÊNICOS studos ecológicos visando à conservação de Bacillus spp. em ecossistemas aquáticos e terrestres justificam-se pela aplicação de algumas espécies no controle biológico de insetos. Apesar desses microrganismos apresentarem semelhanças quanto à biologia e modo de ação, eles diferem entre si por características particulares de cada espécie. Os aspectos relacionados à distribuição geográfica, habitat preferencial, interações com a microbiota local, fatores que afetam crescimento, esporulação e atividade inseticida dos entomopatógenos servem como parâmetros às análises de impacto ambiental, especialmente em agroecossistemas orizícolas. Esse conjunto de elementos fornece subsídios que auxiliam na seleção de isolados com potencial inseticida e ampliam a escassa literatura sobre o papel ecológico desses microrganismos no ambiente. Aline Oliboni de Azambuja Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Gabriela Cristina Alles Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Leila Lucia Fritz Bióloga (UNISINOS) e Mestranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Maria Helena Ribeiro Reche Bióloga (UPF) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Lidia Mariana Fiuza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM- Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). 1.1 Biologia e ecologia de Bacillus spp. Atualmente são conhecidas inúmeras espécies de bactérias associadas a insetos. Porém poucas apresentam as características desejáveis à aplicação do controle biológico de insetos-praga das plantas cultivadas (Fiuza, 2001). No entanto, o crescente interesse pela utilização de bioinseticidas para o controle de populações de insetos prejudiciais, levou o homem a pesquisar mais profundamente as bactérias (Habib & Andrade, 1998). Entre as bactérias entomopatogênicas, o gênero Bacillus apresenta especial importância no controle biológico de pragas, destacando-se o Bacillus sphaericus e o Bacillus thuringiensis (Priest, 1992, 2000; Rabinovitch, 2000; Brighenti et al., 2005; Capalbo et al., 2005; Crickmore et al., 2008; De Melo, 2008). Embora seja reconhecido que B. thuringiensis é um patógeno de insetos, a ecologia dessa bactéria ainda é pouco conhecida (Jensen et al., 2003). Ele é um microrganismo ubíquo do solo, mas é também encontrado nos demais ambientes terrestres, aquáticos e também em insetos mortos, produtos armazenados, plantas e detritos (Meadows et al., 1992; Meadows, 1993; Bernhard et al., 1997, Hossain et al., 1997; Forsyth & Logan, 2000; Hongyu et al., 2000; Maeda et al., 2000; Sneath, 2001; Martinez & Caballero, 2002; Silva et al., 2002; Uribe et al., 2003; Wang et al., 2003). De toda forma, ele habita mais comumente o solo e a superfície das folhas (Forsyth & Logan, 2000). No solo, o número de células varia de 102 a 104 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por grama de solo, enquanto em plantas, esse número varia de 0 a 100 UFC cm -2 (Damgaard, 2000). De acordo com Meadows (1993) existem quatro possíveis explicações para a presença de B. thuringiensis no solo: a primeira considera que B. thuringiensis raramente desenvolve-se no solo, mas é depositado nesse substrato por folhas, insetos, entre outros. A segunda hipótese assume que esse microrganismo pode ser patógeno de insetos do solo que apresentem reduzida importância econômica, com os quais poucos estudos foram realizados. A terceira hipótese pressupõe que B. thuringiensis pode desenvolver-se no solo quando existem nutrientes suficientes, obtidos de resíduos orgânicos em decomposição. Enquanto a última teoria afirma a existência de afinidade de B. thuringiensis e Bacillus cereus, com o qual B. thuringiensis pode trocar material genético, possibilitando sua permanência no ambiente. Além de B. thuringiensis e B. cereus, existem as espécies: B. mycoides, B. pseudomycoides, B. anthracis e B. weihenstephanensis (Hansen, et al., 2003; 14 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

15 Figura 1. Bactérias esporulantes provenientes de amostras de solo em regiões produtoras de arroz irrigado do RS Hu et al., 2004). As espécies, B. cereus e B. thuringiensis são fenotipicamente e geneticamente muito similares entre si, havendo dificuldade na distinção entre as duas espécies (Lecadet et al., 1999; Shisa et al., 2002). No entanto, B. cereus é considerado patógeno facultativo devido ao seu hábito saprofítico no solo e parasita de linhagens de insetos, possuindo uma proteína tóxica de baixa atividade específica (Habib & Andrade, 1998). Esta espécie não produz inclusões paraesporais inseticidas atuando através de ação enzimática (Guttmann & Ellar, 2000; Shisa et al., 2002). Muitas cepas de B. cereus são consideradas patógenas oportunistas de mamíferos, causando intoxicações alimentares seguidas de vômitos e diarréias, dificultando o seu emprego no controle de insetos-praga (Hansen & Hendriksen, 2001). As informações sobre o destino das toxinas de B. thuringiensis no solo são limitadas, embora alguns trabalhos mostrem que elas unem-se a ácidos húmicos e suplementos orgânicos ou partículas do solo, que as protegem da degradação sem perder sua atividade inseticida (Polanczyk & Alves, 2003). De modo geral, as bactérias entomopatogênicas permanecem no solo por meses ou anos após a sua liberação. B. thuringiensis é capaz de permanecer viável por mais de três anos após liberado (Fuxa, 1992). A sensibilidade dos esporos desse entomopatógeno à radiação solar e à dessecação está associada com os plasmídeos, ocorrendo trocas na composição química da cobertura dos esporos, reduzindo sua tolerância aos fatores físicos do ambiente. Nas folhas, a limitação dos esporos pode ocorrer pelo tipo de folha e seus exudados, os quais contém inibidores da germinação de esporos (Yánez & Cabriales, 2000). Considerando a hipótese de que os esporos do B. thuringiensis encontram-se no ambiente como resultado da morte do inseto alvo, espera-se que a distribuição dessa bactéria ocorra aleatoriamente, e que os isolados de um mesmo lugar sejam similares (Fiuza, 2001). No entanto, os isolados de B. thuringiensis têm sido encontrados em todos os tipos de solos e regiões do mundo, incluindo tundra ártica, estepe, regiões temperadas e tropicais, savanas e desertos quentes. Sua abrangência foi relatada em áreas da Escandinávia a Nova Zelândia e da Islândia a Cadeias Montanhosas. No entanto, ele é raramente encontrado em areias de praias e camadas de solo abaixo de 10 cm de profundidade (Landén et al., 1994; Chilcott & Ellar, 1998). B. thuringiensis tem sido freqüentemente isolado de florestas, áreas urbanas, campos e principalmente de lavouras agrícolas (Martin, 1994; Fiuza, 2001). Em um levantamento do Banco de Bactérias Entomopotagonênicas da Microbiologia da UNISINOS (BBE- MU), foram analisadas 278 amostras de solo, oriundas de 29 municípios, de cinco regiões produtoras de arroz irrigado do RS. Foram isoladas 674 amostras de bactérias esporulantes, a maioria pertencente ao Litoral Norte (41%), seguido do Litoral Sul (21%), da Campanha (14,4%), da Depressão Central (14%) e da Fronteira Oeste (10%) (Figura 1). Dessas, 31,1% correspondem a B. thuringiensis; 6% a B. cereus; 4% a B. sphaericus e 58,9% equivalem a outras espécies de Bacillus (Fritz et al., 2007). Outras pesquisas em solos de áreas de arroz irrigado revelam a ampla ocorrência de Bacillus no RS. Em 2006, Azambuja estudou a freqüência de isolados de Bacillus spp. durante o período que compreende o ciclo do cultivo do arroz irrigado no sistema convencional e obteve 245 colônias de bactérias esporulantes, onde 143 pertenciam ao gênero Ba- Figura 2. Freqüência de Bacillus spp. nos diferentes sistemas de cultivo e fases da cultura do arroz irrigado no RS; (C) pousio, (SCC) sistema de cultivo convencional, (SCG) sistema de cultivo pré-germinado, (SCD) sistema de cultivo direto Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 15

16 Figura 3. Abundância de Bacillus thuringiensis em relação aos distintos tratamentos fitossanitários e período de irrigação do arroz no RS; (C) área controle, (H) área somente com herbicidas, (H+I) área com herbicidas e inseticida, (H+F) área com herbicidas e fungicida cillus, entre as quais foram identificadas 26,6% como B. thuringiensis; 4,2% como B. sphaericus e 69,2% foram agrupadas como outras espécies de Bacillus. Silva et al. (2002) reforçam a predominância de B. thuringiensis (9,1%) em solos de todas as regiões brasileiras se comparado a B. sphaericus (5,1%), com exceção da região Sul do país que B. sphaericus (10,1%) foi mais freqüente que B. thuringiensis (4,6%). No entanto, em solos agrícolas de diferentes áreas da Argentina a freqüência de B. sphaericus foi maior (2,1%) em relação à de B. thuringiensis (1,6%) conforme os dados de Dias et al. (1999). Como foi verificada nas diversas pesquisas, a freqüência de B. thuringiensis em vários locais e as diferenças encontradas podem ser atribuídas a inúmeros fatores, incluindo variações geográficas, climáticas, atividade agrícola, tipo de solo e método de isolamento. Contudo, Martin (1984) discute que B. thuringiensis não possui um habitat natural bem definido, pois esse entomopatógeno é caracterizado como um microrganismo saprofítico, sem exigências nutricionais restritas, podendo adaptar-se a diferentes condições ambientais. Diante disso, ainda que os entomopatógenos apresentados possuam semelhanças quanto à biologia e modo de ação, eles diferem entre si por características particulares de cada espécie. Estudos ecológicos facilitam a compreensão dessas bactérias no ambiente, suas relações patógeno/ hospedeiro e a estrutura de populações, permitindo conhecer o comportamento de microrganismos naturais e novos isolados, sejam eles modificados geneticamente ou introduzidos através de programa de controle microbiano (Sosa-Gómez et al., 1998). Ainda assim, as bactérias entomopatogênicas do gênero Bacillus são matéria-prima à industrialização de inseticidas bacterianos. Seus efeitos sobre as larvas são tão pronunciados que as indústrias de inseticidas convencionais buscam ampliar suas utilizações com o objetivo de controlar as pragas da agricultura e vetores de agentes etiológicos de doenças humanas e vegetais. 1.2 Bacillus spp. em amostras de solos de agroecossistemas O crescente aumento de áreas agrícolas vem causando diversos efeitos ambientais, como a mudança microbiana do solo que é mediada por diversos processos e funções (Motavalli et al., 2004). Em agroecossistemas, as mudanças significativas e perceptíveis na comunidade microbiana do solo estão relacionadas com as condições ambientais, sendo conseqüência principalmente do uso das práticas de manejo desse ambiente (Atlas et al., 1991). Práticas agrícolas, tais como tipo de manejo do solo, rotação de culturas, aplicação de agrotóxicos e uso de maquinários interferem na microbiota terrestre, afetando a qualidade do solo, modificando as propriedades físicas, químicas e biológicas (Valarini et al., 2002; Andréa & Hollweg, 2004). Dessa forma, ocorrem variações no número de indivíduos ou na dinâmica bioquímica natural da comunidade de microrganismos. Porém, pouco é conhecido sobre a distribuição desses microrganismos terrestres e a maneira com que eles respondem as mudanças de manejo na terra (Buckley & Schmidt, 2003). Diversas populações de bactérias formadoras de endósporos ocorrem em áreas agrícolas e podem contribuir diretamente ou indiretamente na produtividade das culturas (Gardener, 2004). As bactérias gram-positivas formam uma parte importante da microbiota de solo, o qual constitui o principal ambiente natural que abriga bactérias do gênero Bacillus (Ibarra et al., 2003; Mohamed et al., 2007). Muitas espécies desse gênero são consideradas de importância prática (Caccamo et al., 2001), já que espécies de Bacillus são utilizadas para a síntese de uma grande variedade de produtos médicos, agrícolas, farmacêuticos entre outros (Mohamed et al., 2007). No entanto, as transformações microbianas ocorrem devido às diferentes populações que habitam o solo, e as suas distintas reações químicas podem ser alteradas sempre que o ecossistema sofrer algum tipo de interfe- 16 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

17 Figura 4. Freqüencia de Bacillus spp. em amostras de água do Canal de Irrigação das 5 regiões produtoras de arroz do RS: Litoral Norte-LN, Campanha-CA, Fronteira Oeste-FO, Depressão Central- DC e Litoral Sul- LS rência. Assim, na aplicação de diversos tipos de manejo, podem existir diferentes disponibilidades de substratos que determinarão o favorecimento ou a inibição do estabelecimento dos diferentes grupos microbianos (Castro & Prado, 1993). Fritz (2007) analisou a abundância de bactérias entomopatogênicas pertencentes ao gênero Bacillus obtidas de 36 amostras de solo coletadas de diferentes sistemas de cultivo de arroz irrigado: sistema de cultivo convencional (SCC), sistema de cultivo pré-germinado (SCG) e sistema de cultivo direto (SCD) e de uma área de pousio (sem cultivo) por aproximadamente 12 anos (C). Foram selecionadas 336 colônias pertencentes ao gênero Bacillus spp., onde foram identificadas, 35,42% como B. thuringiensis, 16,96% como B. cereus, 9,52% como B. sphaericus e 38,10% como Bacillus sp. Todavia, não houve diferença significativa na freqüência de Bacillus spp. entre os sistemas de plantio (p>0,05), embora as fases da cultura tenham influenciado a abundância das espécies (P<0,01). A irrigação revelou-se capaz de favorecer a variação na abundância de Bacillus spp., principalmente no caso de B. sphaericus, uma vez que representou 71,4% do total de isolados encontrados durante a referida etapa da cultura (Figura 2). O fato dos solos agrícolas sofrerem mudanças nas suas propriedades físicas e químicas pela introdução da cultura contribui para a diversidade de bactérias em função da aeração, profundidade e melhor distribuição ao longo das Figura 5. Freqüencia de Bacillus spp. Isolados em amostras de água das Parcelas de cultivo de arroz, das 5 regiões produtora do RS: Litoral Norte-LN, Campanha-CA, Fronteira Oeste-FO, Depressão Central- DC e Litoral Sul- LS camadas (Kennedy, 1999). Pfüller et al. (2000) analisaram a freqüência de microrganismos utilizando diferentes sistemas de plantio, e em seus estudos a população microbiana não diferiu significativamente, embora tenha ocorrido uma maior variação no SCC. No entanto, Garbeva et al. (2003) compararam a diversidade de Bacillus em solos agrícolas, e observaram maior número de esporos em solos que apresentavam cultivos, em tempo reduzido em comparação aos cultivados em longo prazo. De acordo com Buckley & Thomas (2003), uma possível explicação para que as comunidades microbianas em campos abandonados de cultivo continuem a apresentar freqüências semelhantes com campos atualmente cultivados, se deve ao fato de que as comunidades microbianas do solo respondem às características do ambiente, que requerem longos períodos de tempo para recuperação dos efeitos antrópicos. Em geral, os microrganismos respondem de diversas formas à aplicação de pesticidas em seu hábitat, podendo ocorrer principalmente seleção de populações resistentes. Essa seleção pode ser em função de suas características fisiológicas e morfológicas. Com o passar do tempo, a diversidade microbiana entra em equilíbrio, porém passa a ser composta por um menor número de espécies, mantendo-se por meses ou anos, atingindo o clímax a semelhança da fase original (Borges et al., 2004). Por outro lado, alguns autores relatam que a diminuição das bactérias pode estar relacionada com a sensibilidade aos herbicidas, resultando na eliminação de algumas espécies. (Wardle & Parkinson, 1990). Nesse sentido, Azambuja (2006) avaliou a influencia do cultivo convencional de arroz irrigado sobre a abundância de bacilos entomopatogênicos, em quatro áreas tratadas com distintos produtos fitossanitários e a fase de irrigação da cultura, concluindo que não houve diferença significativa entre os parâmetros avaliados separadamente sobre a abundância de B. thuringiensis e B. sphaericus. No entanto, a interação entre os fatores apresentou signifi- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 17

18 Figura 6. Ocorrência de espécies de Bacillus isoladas de amostras de água durante o ciclo da cultura 2001/02 de arroz irrigado do Rio Grande do Sul cativa diferença para B. thuringiensis. Antes da irrigação, o microrganismo foi mais freqüente na área tratada somente com os herbicidas, contudo quando o arroz foi inundado a abundância foi mais pronunciada nesse período de irrigação e no tratamento com herbicidas/fungicida (Figura 3). Os solos de arroz irrigado são predominantemente ácidos, quando ocorre à inundação, o ph é elevado naturalmente, próximo à neutralidade pelo processo de redução. Em função dessa nova condição, a disponibilidade de nutrientes atinge níveis estáveis durante um período de 4 a 6 semanas após a inundação (IRGA, 2005). As mudanças climáticas interferem de diferentes formas numa série de organismos, que conseqüentemente, afetam outros e o conjunto destas mudanças pode prejudicar o meio ambiente físico. Sendo assim, os microrganismos estão entre os seres mais sensíveis as variações ambientais, pois formam grandes populações, possuem crescimento rápido, facilidade de dispersão e reduzido tempo de gerações, constituindo-se em potenciais indicadores biológicos para o estudo de impactos das mudanças climáticas globais (Ghini, 2008). A influência de fatores climáticos na ocorrência de B. thuringiensis e B. sphaericus, em solos de orizicultura irrigada, foi avaliada por Azambuja (2006) e a autora sugere que a predominância dos entomopatógenos foi mais acentuada no período de verão com valores médios de temperatura do ar de 26 o C, umidade relativa de 66 % e temperatura do solo de 24,7 o C, contudo, essas diferenças não foram submetidas à análise estatística. Todavia, a temperatura é um importante fator de influência alterando a eficiência de bioinseticidas a base de Bacillus entomopatogênicos. Baixas e altas temperaturas reduzem a atividade larvicida, indicando a necessidade de estudos potenciais devido ao grande número de insetos vetores em climas tropicais (Consoli et al., 1995). Em agroecossistemas, a variação da diversidade microbiana ao longo das estações do ano ainda não é bem compreendida, já que em cada estação parece ocorrer uma comunidade microbiana dominante acompanhada de outras pouco abundantes. Essas variações estão diretamente ligadas ao regime hídrico, ao clima da região, a estrutura e manejo do solo e ao teor e a qualidade dos resíduos vegetais aportados (Torsvisk & Ovreas, 2002). Os solos representam um ecossistema complexo e as variações nos níveis de ph, compostos inorgânicos e matéria orgânica podem representar um fator limitante na colonização, estabelecimento e esporulação de microrganismos residentes (Melo & Azevedo, 1998). Diante desse fato, muitas pesquisas procuram elucidar quais os componentes minerais são mais favoráveis ou limitantes do crescimento microbiano no solo. Além disso, determinadas concentrações de um dado elemento podem apresentar efeitos adversos para um mesmo microrganismo. Alguns autores descrevem que a presença de cálcio favorece o crescimento, esporulação e a produção da delta-endotoxina de B. thuringiensis no solo, mas em elevadas concentrações inibe os três processos (Sikdar et al., 1991; Içgen et al., 2002; Polanczyk, 2004). Por outro lado, há divergências quanto à presença de magnésio, sendo importante na biossíntese do cristal protéico ou limitante do crescimento (Içgen et al., 2002; Polanczyk 2004). Também há relatos na literatura de que a adição de fosfato orgânico (3 a 100 mm) não influencia na biossíntese do cristal, apesar de reduzir o crescimento de células e esporos (Içgen et al., 2002), porém Azambuja (2006) observou que B. thuringiensis foi favorecido pelas quantidades de potássio no solo. Em relação ao ph, alguns autores mencionam que a acidez do solo favorece a adsorção da toxina de B. thuringiensis pela fração argilosa do mesmo protegendo da biodegradação por microrganismos competidores que têm sua atividade inibida nessa condição. Os valores acima de 5,2 favorecem o crescimento da bactéria, mas quando o ph não é controlado próximo à neutralidade ocorre à baixa produção da toxina (West et al., 1985; Sikdar et al., 1991; Tapp & Stotzky, 1998). Sabe-se que a disponibilidade de nutrientes minerais, ph neutro e umidade dos solos favorecem a germinação de B. thuringiensis representando importantes fatores nos níveis de crescimento do microrganismo (West et al., 1985). Contudo, os níveis ótimos de metais para o crescimento de B. thuringiensis e produção da delta-endotoxina são variáveis e ainda não foram claramente demonstrados, conforme discutem alguns autores (Sikdar et al., 1991; Içgen et al., 2002). B. sphaericus, tem ação mosquitocida, especialmente para larvas de Culex pipiens, sendo potencializada após crescimento em meio de cultura com os elementos minerais KH 2 PO 4, MgSO 4, MnSO 4, Fe 2 (SO 4 ) 3, ZnSO 4, CaCl 2 e ph 7,2 conforme estudos realizados por Kaflon et al., (1983). Nos estudos de Azambuja (2006), o índice de B. sphaericus não foi afetado pelas propriedades físico-químicas dos solos avaliados de arroz irrigado. Os resultados anteriores dos referidos autores 18 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

19 podem possivelmente ser explicadas por Silva et al. (1999) e Alles (2008) que relacionam às diferentes origens do entomopatógeno, como solos e águas, a utilização de algumas cepas em estudos ecológicos pela resistência a diferentes condições de estresse. Na tentativa de caracterizar cepas com atividade inseticida e verificar a influência do cultivo convencional sobre os Bacillus entomopatogênicos, Azambuja (2006) obteve a distribuição de isolados de B. thuringiensis com genes cry4, (atividade inseticida a dípteros) em cepas provenientes de solos de todos os tratamentos fitossanitários, exceto da área tratada com herbicidas/inseticida, sendo igualmente distribuídas entre os períodos de irrigação. Como justificativa deste dado podese ressaltar que as áreas inundadas de cultivo de arroz são habitats favoráveis à criação de mosquitos, devido à presença de elevada matéria orgânica e resíduos poluentes provenientes das fontes utilizadas (Batista-Filho et al., 1998). 1.3 Bacillus spp. em ecossistemas aquáticos Entre as bactérias melhor adaptadas à vida no solo e na água, estão àquelas pertencentes ao gênero Bacillus. O gênero Bacillus é fenotipicamente heterogêneo, com membros exibindo um amplo conjunto de requerimentos nutricionais, condições de crescimento, diversidade metabólica e na composição base do DNA. O conhecimento da ecologia de espécies de Bacillus no solo e na água ainda não é completo (Vilain et al., 2006). Espécies de Bacillus foram referidas por sua capacidade metabólica distinta (Fernandes et al., 2007; Fu et al., 2007; Fisher & Hollibaugh, 2008), no Mono Lake, um lago hipersalino, alcalino do leste da Califórnia, onde existem processos de oxidação e redução de selênio e arsênio em presença de fontes de carbono dissolvido. Em lavouras de arroz no Rio Grande do Sul, (RS), Mattos et al. (2007), avaliaram o impacto do uso do inseticida carbosulfano sobre os microrganismos do solo, o risco de contaminação do solo, da água e do sedimento, e a degradação microbiana. Os resultados apontaram espécies do gênero Bacillus entre os grupos Gram-positivos dos consórcios de bactérias, com maior capacidade metabólica em degradar o carbosulfano. Relacionando diferentes ambientes aquáticos, com a viabilidade dos esporos de B. sphaericus, Yousten et al. (1995) destacam que na água doce a fração de esporos viáveis é maior do que no mar. Pouco se sabe sobre quais fatores ambientais são mais importantes para a perda de viabilidade dos esporos dessa bactéria. Fatores como a temperatura de crescimento, ph, aeração, presença de minerais e certos compostos carbonados e nitrogenados afetam a formação dos endósporos (Sneath, 2001). Nesse sentido, Alles (2008) avaliou o crescimento de cepas de B. sphaericus, frente a pesticidas químicos, compostos orgânicos e metais pesados, obtendo uma expressiva heterogeneidade entre as estirpes e uma resistência ao metal Cádmio, considerando tais características fenotípicas importantes para o controle e manejo biológico, dependendo do local onde o agente de biocontrole será aplicado. Contudo, sabe-se que as formulações comerciais de B. sphaericus são mais resistentes a habitats poluídos e a sua reciclagem é favorecida em certas condições, mas com estreito número de hospedeiros em relação à B. thuringiensis israelensis (Singh e Gill, 1988; Thanabalu et al., 1991 e 1993; Nielsen-Leroux e Charles, 1992; Nicolas et al., 1993; Consoli et al, 1995; Charles et al., 1996; Silva-Filho e Regis, 2003; Schwartz et al., 2001; Silva-Filho e Peixoto, 1997). Em estudos de diversidade bacteriana em orizicultura no RS, Reche & Fiuza (2005) e Fritz et al. (2007) isolaram e identificaram espécies de Bacillus em águas de irrigação e em amostras de águas de áreas orizícolas do RS. Nessas pesquisas, B. thuringiensis, B. sphaericus, B. cereus e Bacillus sp. foram identificados em amostras de água coletadas nos Canais de Irrigação e nos Canais de Drenagem das lavouras orizícolas do RS. As coletas foram realizadas durante o ciclo da cultura do arroz, 2001/02, em 5 regiões produtoras de arroz do RS: Depressão Central- DC, Fronteira Oeste- FO, Campanha- CA, Litoral Norte- LN e Litoral Sul- LS (Figuras 4 e 5). Os resultados apresentados nas Figuras 4 e 5, referem-se à abundância de Bacillus spp. nas regiões orizícolas estudadas e nos dois tratamentos, Canal de Irrigação e Parcelas de cultivo de Arroz. Características adaptativas a vários ambientes e sob condições adversas de temperatura, ph e salinidade, lhes são conferidas por sua capacidade de permanecer em latência devido a formação de esporos. As variações de temperatura entre as regiões e a disponibilidade de recursos, podem influenciar as diferenças de abundância na distribuição das espécies (Ricackanov, 2003). As parcelas de cultivo apresentaram maior abundância de colônias bacterianas (Figura 5) quando comparadas com as águas de irrigação da lavoura (Figura 4). Águas de lavoura de arroz recebem tratamentos fitossanitários e Bacillus parecem ter afinidade com ambientes que receberam agroquímicos, transformando-os em fontes de carbono para a sua produção de energia. Além disso, o ambiente de lavoura alterna inundação e drenagem, o que favorece o desenvolvimento de bactérias esporulantes (Liesack, 2001). Os resultados de pesquisa quanto aos isolados de Bacillus em águas de lavouras orizícolas durante o ciclo da cultura, expressaram a presença de B. thuringiensis em 39,7% das amostras de água analisadas. Em segundo lugar, Bacillus sp., 35,8%, seguidos de B. cereus, 14,6% e B. sphaericus, 9,9% (Figura 6). B. thuringiensis foi encontrado em maior freqüência nas águas de cultivo de arroz (Figura 6). A presença de Bacillus sp. é mencionada por Martiny et al. (2005), como um dos grupo bacterianos mais comuns em sistemas de distribuição de água potável. Em estudos após desinfecção com cloro, em sistemas de água potável, Szabo et al. (2007), encontraram esporos de bactérias do gênero Bacillus, aderidos nas depres- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 19

20 sões da tubulação de ferro corroído. Os autores concluíram que esses esporos são capazes de persistir por longos períodos de tempo em presença de altos níveis de cloro. Esse microrganismo pode desenvolver-se em águas ricas em nutrientes liberados pela decomposição de resíduos orgânicos, assim como foi citado para o solo, por Polanczyk & Alves (2003). Esses autores também levantaram a hipótese dessa bactéria ter algum tipo de relação simbiótica com plantas, o que explicaria a produção de toxinas tão específicas e eficientes. B. sphaericus é muito comum e de distribuição cosmopolita, sendo principalmente isolada do solo em sistemas aquáticos ou mesmo de larvas de pernilongos mortos, seu hospedeiro natural (Singer, 1981; Priest et al., 1997; Alves, 1998; Wirth et al., 2001; Partridge e Berry, 2002; Wei et al., 2006). B. cereus, de acordo Vilain et al. (2006), é uma bactéria de solo que pode ocorrer na rizosfera das plantas e algumas estirpes produzem antibióticos capazes de inibir o desenvolvimento de doenças fúngicas na rizosfera; Galvão et al. (2006), em análises microbiológicas de água de cultivo de mexilhões, detectaram B. cereus em 6,7% das amostras. Rowan et al. (2003) referem-se a B. cereus, como um grupo heterogêneo de bactérias Gram-positivas, que devido a sua habilidade em formar esporos, tolera melhor ambientes hostis do que outros entomopatógenos bacterianos não esporulantes. B. cereus é um patógeno humano oportunista, que está presente no solo e na água, podendo proliferar em uma gama de ambientes incluindo matérias-primas e alimentos processados (From et al., 2005; Tourasse et al., 2006). 1.4 Referências Alles, G. C Caracterização de estirpes de Bacillus sphaericus com atividade inseticida. Dissertação (Mestrado), Universidade do vale do Rio dos Sinos, São Leopoldo: UNISINOS, 2008, 108p. Alves, S. B. 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24 Pesquisa TOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS Pesquisa Laura Massochin Nunes Pinto Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Diouneia Lisiane Berlitz Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Raquel Castilhos-Fortes Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente (UFRGS) Lidia Mariana Fiuza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). toxicidade de B. thuringiensis está relacionada à síntese das proteínas Cry que atuam especificamente no intestino médio dos insetos, as quais são codificadas por genes cry. Essas proteínas têm atividade inseticida a diferentes ordens de insetospraga, de acordo com a presença dos genes cry, nas cepas bacterianas. Além dessas proteínas, o entomopatógeno produz outros tipos de toxinas, como exotoxinas, proteínas Vip, endotoxinas, entre outras. Sendo assim, esse artigo apresenta a atual classificação dos genes cry, as ordens de insetos-alvo das proteínas Cry e outros fatores de toxicidade da bactéria. 1.1 Proteínas Cry Juntamente com a esporulação, B. thuringiensis libera inclusões cristalinas paraesporais que podem conter uma ou mais proteínas inseticidas, denominadas Cry, as quais são codificadas por genes também denominados cry. Estas proteínas apresentam peso molecular entre 40 e 140kDa e tornam-se tóxicas a insetos, após sua ingestão e solubilização, no intestino médio das larvas (Bravo, 1997). Estudos sobre a seleção de B. thuringiensis têm identificado diferentes cepas desta bactéria, as quais mostram ação sobre diversas ordens de insetos, como Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Homoptera, Hemiptera, Isoptera, Orthoptera, Siphonaptera, Thisanoptera e Mallophaga (Feitelson et al., 1992; Maagd et al., 2001; Cavados et al., 2001; Castilhos- Fortes et al., 2002; Pinto et al., 2003; Maagd et al., 2003), além de nematóides (Marroquim et al., 2000). Assim, sabe-se que diversos grupos de insetos são suscetíveis aos cristais tóxicos de B. thuringiensis e que uma espécie de inseto pode ser afetada por mais de uma cepa da bactéria, pois estas freqüentemente produzem diferentes proteínas inseticidas. Isso significa que um cristal protéico pode ser tóxico a uma grande variedade de insetos, principalmente lepidópteros. Além disso, as proteínas Cry de B. thuringiensis podem ter seu efeito alterado de acordo com a radiação solar, temperatura e ph (Nishiitsutsuji-Uwo et al., 1977; Rosas-García et al., 2008). A busca por novos genes cry, que sintetizem novas proteínas Cry, com diferentes efeitos inseticidas tem sido uma das grandes metas na pesquisa com B. thuringiensis, desde os primeiros trabalhos publicados sobre a manipulação genética de B. thuringiensis (Schnepf & Whiteley, 1981). As toxinas Cry têm sido classificadas de acordo com sua homologia na seqüência de aminoácidos (Figura 1), na qual a denominação Cry apresenta quatro ranques hierárquicos de números e letras (maiúsculas e minúsculas), como por exemplo, Cry3Aa2. As proteínas Cry (Tabela 1) com cerca de 45% de homologia em sua seqüência são colocadas no primeiro ranque e quando apresentam 78 e 95% de identidade, constituem o segundo e terceiro ranque, respectivamente. Cinco blocos de seqüências são comuns a maioria das proteínas Cry. Quando se analisa o tamanho destas proteínas também fica evidente sua diversidade entre as diferentes protoxinas. A extensão C-terminal, encontrada nas proteínas mais longas, não faz parte da toxina ativa, pois é digerida pelas proteases no intestino dos insetos, mas pode ter ação na formação do cristal (Schnepf et al., 1998). A estrutura tridimensional das formas ativas das toxinas Cry1 (Grochulski et al., 1995), Cry2 e Cry3 (Li et al.,1991), quando analisadas em cristalografia de raio X, mostraram-se muito similares, cada uma apresentando três domínios. As inclusões cristalíferas ingeridas por larvas susceptíveis dissolvem-se no intestino dos insetos e as protoxinas inativas são solubilizadas e clivadas na longa região C-terminal, por proteases intestinais, originando fragmentos resistentes a proteases com cerca de 60 kda (Maagd et al., 2003). O domínio I, N-terminal, consiste em sete alfa-hélices e participa na inserção da membrana intestinal e formação do poro. O domínio II, ou beta-prisma, apresenta três folhas dobradas simétricas, formando as beta-folha. O domínio III C-terminal consiste em duas beta-folha antiparalelas. Estes dois domínios estão envolvidos no reconhecimento dos receptores e ligação, além do domínio III também ter sido associado à formação de poros (Maagd et al., 2001). 24 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

25 Figura 1. Dendograma de proteínas Cry de Bacillus thuringiensis (Fonte Neil_Crickmore/Bt. Acesso em 19/11/ 2008). Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 25

26 Tabela 1. Classificação e caracterização das proteínas Cry de Bacillus thuringiensis. 26 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

27 L- Lepidoptera; C- Coleoptera; D- Diptera; H- Hymenoptera; N- Nematoda; Le- leucócitos cancerosos humanos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 27

28 Figura 2. Dendograma das proteínas Vip sintetizadas por Bacillus thuringiensis (Fonte: Atualmente, existem 428 proteínas Cry descritas, que estão classificadas em 55 classes Cry (Tabela 1). O autor Crickmore mantém um site na internet, o qual reúne as informações sobre todas as toxinas Cry já publicadas, além de permitir o acesso às características moleculares de cada uma. Estes dados são atualizados periodicamente e podem ser acessados no endereço: Neil_Crickmore/Bt. Este número tem crescido regularmente, pois a descoberta de novos genes implica na obtenção de novas toxinas que possam ter maior especificidade ou toxicidade. Dentre os grupos de genes cry mais estudados, destacam-se cry1, cry2, e cry9, os quais já foram descritos com amplo espectro inseticida aos lepidópteros. Dentre estes grupos, os genes cry1 são os mais freqüentes na natureza, representando mais de 43% dos genes cry caracterizados e freqüentemente as bactérias que possuem genes deste grupo codificam protoxinas entre 130 e 140kDa, que são armazenados em cristais bipiramidais (Hofte & Whiteley, 1989; Rosas-García et al., 2008; Thammasittirong & Tipvadee, 2008). O dendograma da Figura 1 mostra os grupos de proteínas Cry, que são classificados de acordo com a similaridade entre a seqüência de genes que codificam as referidas toxinas bacterianas. De acordo com Crickmore et al. (1998), o primeiro domínio apresenta em torno de 45% de similaridade entre si, ao passo que o segundo domínio mostra-se entre 45 e 75% similares e o terceiro domínio a partir de 75% de similaridade, quando se trata da seqüência de aminoácidos. Carlson et al. (1994) relatam que B. thuringiensis apresenta em seu genoma de 2,4 a 5,7 milhões de pares de bases, e a maioria dos isolados apresentam elementos extra cromossômicos lineares ou circulares. Os genes cry estão localizados em plasmídios e muitos isolados de B. thuringiensis possuem diversos genes cry responsáveis pela síntese de diferentes proteínas inseticidas (Lereclus et al., 1993). Durante seu desenvolvimento, B. thuringiensis passa por duas fases, a fase vegetativa e a estacionária, semelhantes ao desenvolvimento de Bacillus subtilis. A primeira fase caracteriza-se pelo crescimento exponencial das células de B. thuringiensis, momento em que há grande disponibilidade de nutrientes no meio. A fase estacionária ocorre quando o meio se torna hostil e a bactéria adapta-se à diminuição de nutrientes através de mecanismos genéticos. A expressão dos genes cry de B. thuringiensis geralmente ocorre na fase estacionária da célula, acumulando seu produto na célula mãe, na forma de uma inclusão cristalífera, a qual é liberada no meio ao final da esporulação (Lereclus et al., 2000). Esta inclusão pode representar cerca de 25% do peso seco de células já esporuladas (Agaisse & Lereclus, 1995). Esses autores relatam que apesar da expressão dos genes cry estarem estreitamente relacionada ao evento da esporulação, existem genes cry que são expressos independentemente da esporulação. A quantidade de proteína produzida por uma célula de B. thuringiensis não está diretamente relacionada com o número de cópias de genes cry, pois a capacidade de produção de proteína pela célula, mesmo com apenas uma cópia de um determinado gene cry, pode ser elevada. Por exemplo, a cepa B. thuringiensis kurstaki HD73, possui apenas uma cópia de gene cry1, mas sintetiza cristais bipiramidais em quantidades semelhantes àquelas produzidas por cepas que apresentam três ou quatro diferentes genes cry1. Desta forma, a síntese protéica atinge um limite máximo, com certo número de cópias de genes cry na célula e acima deste não há acréscimo na produção de toxinas (Agaisse & Lereclus, 1995). As toxinas Cry são as mais proeminentes de uma série de fatores que permitem o desenvolvimento de sua virulência à morte ou enfraquecimento dos insetos. Esses dados sugerem que muitas estirpes de B. thuringiensis podem ser consideradas como patógenos oportunistas de insetos. Seria de grande importância uma compreensão mais profunda das verdadeiras funções ecológicas de B. thuringiensis, tanto para melhorar a confiabilidade da avaliação dos riscos e para o desenvolvimento de métodos eficientes de isolamento de estirpes de B. thuringiensis, contendo genes cry ativos. 1.2 Proteínas Vip As proteínas VIP foram descritas por Estru- 28 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

29 Tabela 2. Proteínas Vip com efeito tóxico a diferentes insetos Estruch (1996) e 23% das cepas avaliadas por Rice (1999). As subfamílias Vip1 e Vip2 (Tabela 2) são componentes de uma proteína binária com atividade inseticida contra Diabrotica virgifera e D. longicornis (Han et al., 1999; Warren, 1997). As proteínas Vip 3 são ativas contra lepidópteros (Tabela 2), como Spodoptera frugiperda e Helicoverpa zea. Seu modo de ação está relacionado à formação de poros na membrana do epitélio do intestino médio (Yu et al., 1997; Loguercio et al., 2002; Lee et al., 2003). Ao mesmo tempo que a Vip 3 apresentou toxicidade sobre lepidópteros e não mostrou efeitos sobre insetos nãoalvo (Whitehouse, 2007). Devido a sua atividade inseticida relacionada a Heliothis zea, as proteínas Vip 3A estão sendo expressas em plantas de algodão, conferindo resistência ao inseto. Nesse sentido, Bommireddy et al. (2007), avaliaram plantas de algodão modificadas somente com a proteína Vip 3A, ou com a combinação de Vip 3A e Cry 1Ab (Vip Cot) nos lepidópteros H. zea e H. virescens. Considerando o comportamento das lagartas, os resultados desses autores mostram que houve maior índice de infestação em plantas não modificadas em relação às demais (Vip 3A e Vip Cot). O conjunto desses dados demonstra que às proteínas Vip são promissoras no controle de insetos-praga, uma vez que possuem diferenças estruturais em relação às demais proteínas de B. thuringiensis, o que pode retardar o processo de resistência nas populações de insetos. ch et al. (1996) e recebem essa denominação por serem produzidas na fase vegetativa de crescimento de B. thuringiensis. Sua concentração também permanece alta antes e depois da fase de esporulação. Vários estudos foram realizados após sua descoberta visando a caracterização, identificação de novos tipos, ação inseticida e também produção de plantas com capacidade de expressá-las. Estes estudos, porém, são incipientes quando comparados com as endotoxinas. A localização dos genes responsáveis por sua produção ainda não foi determinada, embora existam vários conjuntos de primers que podem ser utilizados para identificá-las como vip1 e vip2 (Rice, 1999; Fang et al., 2007; Selvapandiyan et al., 2001 ) vip3a (Rice, 1999), vip3aa (Seifinejad et al., 2008), vip5 e vip6 (Loguercio et al., 2002). A Figura 2 apresenta um dendograma com as proteínas Vip, já identificadas e catalogadas, no site: Neil_Crickmore/Bt. Esse dendograma mostra primeiramente dois grandes agrupamentos de proteínas onde são encontradas seqüências genéticas semelhantes entre si, subdivididos em cinco grupos menores, de acordo com essa seqüência genética. Percebe-se, claramente que esses cinco grupos similares são formados por proteínas da mesma classe, ou seja, Vip1, Vip2 e Vip 3. A diferença entre a seqüência de genes que codificam essas proteínas é que define sua classificação, como Vip1Aa, Vip1Ab, entre outras. De acordo com Rang et al. (2005), as proteínas Vip2 exibem entre 21 e 22% de similaridade com a proteína Vip3Ba1, enquanto as proteínas da classe Vip1 são entre 8 e 22% similares à Vip3Ba1. Segundo Fang (2007) estas proteínas representam uma das maiores descobertas de toxinas com capacidade inseticida, sendo extremamente relevante a ausência de similaridade nas seqüências de aminoácidos destas proteínas com as seqüências de aminoácidos das endotoxinas, especialmente, em termos de manejo e evolução da resistência. De acordo com o dendograma da Figura 2, estas proteínas são classificadas em três subfamílias diferentes (Crickmore et al., 2005), sendo que ocorrem em torno de 15% das cepas de B. thuringiensis avaliadas por 1.3 Demais fatores de virulência de B. thuringiensis Além das proteínas Cry e Vip, os isolados de B. thuringiensis podem sintetizar proteínas denominadas Cyt, que possuem atividade citolítica in vitro e especificidade in vivo aos dípteros (Höfte & Whitheley, 1989; De Maagd et al., 2003). De acordo com esses autores fazem parte desse grupo as proteínas Cyt1Ca e Cyt2Aa e seu modo de ação também pode estar relacionado a um sinergismo com outras toxinas produzidas pelos isolados. O entomopatógeno também produz outros fatores de virulência, como as β- exotoxinas, α-exotoxinas, hemolisinas, enterotoxinas, quitinases e fosfolipases (Höfte & Whiteley, 1989; De Maagd et al., 2001). Esses autores declaram desconhecida a exata contribuição de cada fator na virulência da bactéria, sendo uma dificuldade determinar o espectro tóxico de um isolado que sintetiza mais de uma proteína. Isso porque, quando os fragmentos tóxicos vão se ligar aos receptores da membrana do intestino médio do inseto, ocorre uma competição pelos sítios de ligação, que pode interferir na toxicidade do isolado. Guttmann & Ellar (2000) identificaram isolados de B. thuringiensis com a presença de hemolisinas, quitinases e lecitinases, Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 29

30 Tabela 3. Subespécies de Bacillus thuringiensis produtores da β-exotoxina de Barreto et al. (1999) utilizando S. frugiperda em seus ensaios de toxicidade. Porém, devido as suas propriedades não específicas aos insetos, ou seja, pode também afetar organismos não-alvo, os isolados bacterianos que são produtores dessa toxina não podem ser comercializados para serem utilizados na agricultura visando o controle de insetos-praga. sendo eles: Bt kurstaki, Bt israelensis, Bt fukuokaensis Bt kyushuensis, Bt darmastadiensis, Bt thompsoni, Bt tolworthii e Bt ostrinae. Já as subespécies Bt galleriae, Bt aizawai e Bt wuhanensis apresentaram somente hemolisina e quitinase. Os mesmos autores também relatam a presença do gene que codifica a enterotoxina, uma toxina produzida por diferentes cepas de B. thuringiensis, com peso molecular em torno de 45kDa, e que pode ser tóxica a vertebrados, uma vez que é análoga à toxina produzida por B. cereus. Considerando a análise de 13 isolados de B. thuringiensis avaliados, 9 foram positivos para o gene ents que codifica a enterotoxina. No mesmo sentido, Rivera et al. (2000) avaliaram 74 isolados do entomopatógeno, em relação a presença dos genes bce, hbl e nhe para a enterotoxina. Os seus resultados mostram que o gene nhe foi o mais freqüente, seguido de hbl e bce mostrando assim, uma pequena diferença na distribuição desses genes entre B. thuringiensis e B.cereus. Outros dados de pesquisa sobre enterotoxina (Ngamwongsatit et al., 2008), revelaram a presença dos genes hbl, nhe, cytk e entfm em 205 isolados de B. thuringiensis e 411 isolados de B. cereus. Os dados desses autores mostram que, em 149 isolados de B. thuringiensis todos os genes ocorreram simultaneamente, sendo os genes nhe e entfm aqueles de menor freqüência. Esses autores relatam a importância desse conhecimento uma vez que a enterotoxina pode causar intoxicação alimentar, quando relacionada ao patógeno B. cereus. Em relação à β-exotoxina, também chamada thuringiensina, é uma proteína com peso molecular de 0,7 kda (Gohar & Perchat 2001), insespecífica, termoestável, identificada por inibir a síntese de rrna (Mackedonski & Hadjilov, 1972) e prejudicar a formação do fuso mitótico, dentre outros efeitos observados em ensaios in vitro com Alium cepa (Sharma & Sahu, 1977). Por ser inespecífica e tóxica a vertebrados, a thuringiensina é avaliada em testes laboratoriais, utilizando roedores como cobaias. Os dados de Ohba et al. (1981) mostram que, de 740 isolados de B. thuringiensis avaliados quanto a presença da β-exotoxina, 28 produziram essa toxina. Além desses, dois isolados da espécie B. subtilis, um isolado de B. natto e dois isolados da espécie B. megaterium também foram produtores da thuringiensina. Nesse sentido, Hernandéz et al. (2003) revelam que 79% dos isolados de B. thuringiensis thuringiensis são produtores dessa toxina, seguidos de 20% para B. thuringiensis kenyae, 13% para B. thuringiensis kurstaki, contrastando com 0% de produção para B. thuringiensis aizawai. Na Tabela 3 constam dados sobre a produção da β-exotoxina pelas diferentes subespécies de B. thuringiensis. A thuringiensina também apresenta atividade inseticida a diferentes espécies de insetos-praga, como demonstra o trabalho 1.1 Referências Agaisse, H. & Lereclus, D How does Bacillus thuringiensis produce so much inseticidal crystal protein? Journal of Bacteriol., 177: Bhalla, R., Dalal, M., Panguluri, S.K., Jagadish, B., Mandaokar, A.D., Singh, A.K., Kumar, P.A., Isolation, characterization and expression of a novel vegetative insecticidal protein gene of Bacillus thuringiensis. 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31 Estruch, J. J., G. W. Warren, M. A. Mullins, G. J. Nye, J. A. Craig, and M. G. Koziel Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects. Proc. Natl. Academic Science, 93: Fang,J.; Xu, X.; Wang,P.; Zhao, J.Z.; Shelton, A.M.; Cheng,J.; Feng,M.G.; Shen,Z Characterization of Chimeric Bacillus thuringiensis Vip3 Toxins. Applied and Environmental Microbiology, 73(3): Feitelson, J.S.; Payne, J. & Kim, L Bacillus thuringiensis: insects and beyond. BioTechnology, 10: Gohar M., Perchat S Sample preparation for beta-exotoxin determination in Bacillus thuringiensis cultures by reversedphase high-performance liquid chromatography. Analitical Biochemistry 298: Grochulski, P. et al Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin crystal structure and channel formation. 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Estruch The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium cells of susceptible insects. Applied Environmental Microbiology 63: Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 31

32 Pesquisa Pesquisa MECANISMO DE AÇÃO DE BACILLUS THURINGIENSIS Lidia Mariana Fiuza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). estudo do modo de ação das proteínas Cry de B. thuringiensis será abordado revelando a especificidade dessas toxinas através da detecção de receptores presentes no sistema digestivo dos insetos-alvo. O tema trata do modo de ação completo de B. thuringiensis, desde a ingestão do entomopatógeno até a morte do inseto. O processo de análise de receptores nos tecidos dos insetos é descrito detalhadamente, envolvendo diferentes abordagens metodológicas de detecção de sítios de ligação das proteínas inseticidas e uma discussão com dados de diversos autores que desenvolvem pesquisas nessa área. 1.1 Modo de ação das proteínas Cry de B. thuringiensis As análises do modo de ação das proteínas Cry de B. thuringiensis visam esclarecer os mecanismos pelos quais estas proteínas exercem seu efeito entomopatogênico e elucidar a especificidade das diferentes toxinas (Endo e Nishiitsutsuji-Uwo, 1980; Höfte e Whiteley, 1989; Gill et at., 1992; Schnepf et al., 1998; Fiuza, 2004). Considerando o conjunto de informações atualmente disponíveis sobre as fases entre a ingestão dos cristais e a morte das larvas dos insetos suscetíveis às proteínas Cry de B. thuringiensis, descreve-se como fases do mecanismo de ação: (i) (ii) (iii) Inicia pela solubilização dos cristais em ph alcalino no intestino médio dos insetos, liberando as protoxinas de kda para Cry1 e 70 kda para Cry2. Essa etapa é determinante à especificidade do isolado de B. thuringiensis à espécie alvo, tanto pela alcalinidade do sistema digestivo quanto pela composição dos cristais de B. thuringiensis. Protoxinas são ativadas pelas enzimas digestivas, formando fragmentos tóxicos de kda. Nessa etapa tanto a composição proteolítica quanto a estrutura protéica do cristal são importantes. Toxinas reconhecem receptores específicos às microvilosidades das células epiteliais do intestino médio das larvas suscetíveis às quais elas se ligam. Os estudos realizados com BBMV (Brush Border Membrane Vesicles) isoladas de larvas de lepidópteros mostram que a ligação de forte afinidade entre a toxina e o receptor é reconhecido como um fator importante na determinação do espectro inseticida das proteínas Cry (Fiuza et al., 1996). Dados de pesquisa mostram que há uma correlação positiva entre a ligação, in vitro, da toxina no receptor intestinal e a toxicidade, in vivo. Por outro lado, outros estudos descrevem que o reconhecimento do receptor é necessário, mas não é suficiente para provocar a toxicidade, sugerindo a existência de outros fatores relacionados ao modo de ação das proteínas Cry. Em 1994, Knight et al., isolaram de BBMV de larvas de Manduca sexta 32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

33 (iv) (Lep., Sphingidae) uma aminopeptidase N implicada na interação da toxina Cry1Ac. Os modelos de receptores atualmente descritos mostram que um inseto pode apresentar, em quantidade variável, diversas classes de receptores que podem ser reconhecidos por diferentes toxinas. Dados de pesquisa revelam que estes modelos podem explicar a especificidade das toxinas de B. thuringiensis. Após o reconhecimento do receptor, a toxina induz a formação de poros na membrana celular do epitélio intestinal. A formação dos poros na membrana celular provoca o desequilíbrio iônico entre o citoplasma e a o meio externo à célula. As análises histopatológicas realizadas após a intoxicação dos insetos mostram a destruição das microvilosidades, hipertrofia das células epiteliais, vacuolização do citoplasma e lyse celular, levando o inseto a paralisia e morte. Na seleção das proteínas inseticidas, sintetizadas por essa bactéria, as análises in vitro dos receptores membranares podem viabilizar uma rápida determinação do espectro de ação das proteínas Cry contra as espécies alvo, sendo em seguida efetuada a avaliação da toxicidade in vivo, apenas para os isolados pré-selecionados como ativos in vitro. Sendo assim, o presente trabalho trata de diferentes métodos de análise de receptores de proteínas de B. thuringiensis em formas imaturas de lepidópteros. 1.2 Análise de receptores em cortes histológicos de insetos Tecidos dos insetos As larvas de insetos podem ser obtidas de coletas a campo, as quais devem passar por um período de quarenta em condições controladas, ou oriundas de criação massal de insetos mantida em laboratório, em condições controladas de temperatura, umidade relativa e fotofase, as quais podem variar de acordo com a espécie do inseto. Os tubos digestivos dos insetos são dissecados e fixados 24 h, em Bouin Hollande Sublimé a 10%, lavados por 12 h em água destilada e desidratados em séries crescentes de etanol, 70 a 100% (Brandtzaeg, 1982). Em seguida os tecidos são impregnados em Figura 1. Receptores de proteínas Cry biotiniladas, revelados nos tecidos de larvas de lepidópteros, com fosfatase alcalina e peroxidase (Fiuza, 1995) banhos mistos (etanol/tolueno/paraplasto) e incluídos em paraplasto 100% a 58 o C. Os cortes longitudinais ou transversais, de 7 a 10 µm de espessura, preparados com micrótomo LKB, são montados em lâminas de vidro, tanadas com polyl-lysina a 10%, e conservadas a 4 o C para posterior análise de receptores em cortes histológicos Proteínas Cry As cepas de B. thuringiensis podem ser cultivadas em meio usual glicosado por aproximadamente 5 dias, conforme o método de Mahillon & Delcour (1984). Após a lise bacteriana devem ser centrifugadas e lavadas com tampão fosfato, ph 6. Os cristais são separados dos esporos e das células bacterianas em gradiente de renografina ou sacarose por ultra centrifugação, conforme metodologia descrita por Sharpe et al. (1975). As bandas, contendo os cristais puros, são lavadas e diluídas em água milli-q esterilizada, contendo phenylmethylsulfonyl (PMSF). As proteínas Cry são solubilizadas em tampão fosfato, ph 10. Esse ph deve ser ajustado a 8,6 por diálise contra o tampão 20 mm Tris e as proteínas Cry são ativadas por bovine pancreatic trypsin (Type I), sendo a reação inativada com trypsin inhibitor (Type II). A pureza e a integridade das proteínas pode ser avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%, SDS-PAGE (Laemmli, 1970). A concentração pode ser determinada pelo método Bradford (1976), usando a bovine serum albumin (BSA) como proteína padrão Proteínas biotiniladas As proteínas Cry podem ser biotiniladas, conforme o método descrito por Bayer & Wilcheck (1990), onde a incorporação da biotina na parte N-terminal da proteína é feita usando o BNHS (biotinyl-n-hydroxysuccinimide) em tampão de bicarbonato de sódio, ph 9. O produto da reação deve ser purificado em sephadex G-25 (Sigma) e as frações biotiniladas identificadas por dot-blot, onde se utiliza membrana de nitrocelulose, o conjugado de estreptavidina-fosfatase-alcalina diluída no tampão TST (Tris-Saline-Triton, ph 7;6) e o substrato de revelação (BCIP e NBT em tampão Tris; ph 9,5). A concentração das proteínas Cry biotiniladas pode ser determinada pelo método Bradford (1976), usando a BSA como proteína padrão. A pureza e a integridade das proteínas marcadas pode ser avaliada em westernblot, usando membrana de nitrocelulose (Sigma) e o tampão Towbin, ph 8,3 com 10% etanol. As membranas podem ser reveladas usando a mesma técnica descrita no dot-blot Anticorpos As proteínas Cry são preparadas, conforme descrito anteriormente na purificação, e depois são utilizadas na obtenção de anticorpos em pequenos animais como: coelhos, ratos e camundongos, entre outros. O soro coletado dos animais é utilizado na obtenção das imunoglobulinas (IgGs), as quais podem Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 33

34 Figura 2. Receptores de proteínas Cry biotiniladas, detectados nos tecidos de larvas de lepidópteros com fluoresceína e observados em microscopia de varredura laser (Fiúza, 1995) ser separadas em colunas de sepharose protein-a e as frações purificadas por afinidade incubando os IgGs e as membranas de nitrocelulose, contendo os antígenos previamente transferidos por western-blot conforme descrito por Burke et al. (1982). A especificidade e sensibilidade dos anticorpos policlonais é determinada pelo método de dot-blot e ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay Detecção in vitro de receptores As análises in vitro dos receptores de proteínas Cry de B. thuringiensis são realizada com cortes histológicos do sistema digestivo das larvas dos insetos em estudo. A detecção propriamente dita corresponde a incubação dos tecidos com as proteínas, previamente desparafinados e reidratados. Nas análises com proteínas Cry biotiniladas, os cortes histológicos são incubados à temperatura ambiente, durante 1h, com as proteínas biotiniladas. As proteínas não ligadas aos sítios receptores são removidas com TST, ph 7,6. Na etapa posterior, os tecidos são tratados com estreptavidina conjugada a uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina) ou fluorocromo (fluoresceína ou ficoeritrina), diluídos em tampão TST. O complexo da reação proteína-receptor, usando o conjugado com enzimas pode ser revelado com substrato DAB para peroxidase e BCIP/NBT para fosfatase alcalina (Figura 1), sendo as secções montadas com Pertex, entre lâmina e lamínula de vidro. Nas revelações com fluorocromos, com a fluoresceína (Figura 2), os cortes histológicos são montados com Mowiol e conservados a 4 C para análise em microscopia óptica - MO ou microscopia de varredura Laser MVL. Nas análises imunohistoquímicas, com proteínas não marcadas (proteínas nativas), os receptores são revelados com o complexo anticorpo primário (AC 1, específico contra a proteína Cry) e anticorpo secundário (AC 2, dirigido contra o AC 1 ) conjugado a uma enzima ou fluorocromo, os quais são revelados e montados de acordo com o método descrito anteriormente. As testemunhas são preparadas pela omissão alternada de cada etapa da reação, a fim de eliminar a hipótese de reações falso-positivas. As amostras reveladas com enzimas, tipo peroxidase e fosfatase alcalina, podem ser avaliadas em microscopia óptica. Para as análises onde são utilizados os fluorocromos pode ser utilizada a microscopia de fluorescência convencional ou de varredura laser. 1.3 Considerações As marcagens detectadas na região das microvilosidades das células do epitélio intestinal revelam a presença de receptores membranares às proteínas Cry, nas microvilosidades das células epiteliais do intestino médio das larvas dos insetos (Figuras 1 e 2). No caso dos tecidos tratados como controle, representantes da omissão alternada dos diferentes componentes da reação, pode-se observar a ausência de coloração nas microvilosidades das células do epitélio intestinal dos insetos em estudo. As imunodetecções e as detecções de proteínas Cry biotiniladas foram utilizadas por diversos autores, para revelação de receptores membranares intestinais, em larvas de diferentes espécies de lepidópteros (Bravo et al., 1992a; Denolf et al., 1993a; Estada e Ferre, 1994; Fiuza, 1995), de dípteros (Ravoahangimalala et al., 1993) e de coleópteros (Bravo et al. 1992b; Denolf et al., 1993b; Boets et al., 1994). Esses autores comprovaram que as ligações das proteínas Cry nas microvilosidades do intestino médio das larvas de insetos correspondem à existência de um receptor específico à referida proteína no inseto-alvo. Considerando, os estudos dos receptores in vitro e as análises da toxicidade in vivo, pode-se inferir que os métodos de detecção de receptores membranares podem ser aplicados na seleção das proteínas ativas contra insetos, havendo uma correlação positiva entre as análises in vitro e in vivo. Porém, para determinar a Concentração Letal Média (CL 50 ) de uma proteína Cry faz-se necessário o bioensaio uma vez que as ligações das proteínas aos receptores podem variar em concentração e afinidade, como já descrito por diversos autores, para diferentes espécies de insetos (Denolf et al., 1993a; Van Rie et al., 1990; Fiuza et al., 1996; Lee et al., 1996; Hua et al., 2001). Também há estudos demonstrando que as proteínas Cry tóxicas aos insetos correspondem àquelas que se ligam de forma irreversível aos receptores das células epiteliais dos insetos alvo (Liang et al., 1995). No controle biológico de insetos, a espécie Bacillus thuringiensis oferece as melhores alternativas à produção de biopesticidas e à engenharia genética de plantas. Sendo assim, é fundamental avaliar o espectro de ação e a especificidade das proteínas potencialmente inseticidas e, nesse contexto, Fiuza (2004) menciona que a análise in vitro dos receptores membranas pode ser considerada uma ferramenta indispensável face ao grande número de isolados, cepas e proteínas de B. thuringiensis já identificados, que representam um potencial no manejo de insetos-praga. 1.4 Referências Bayer, E.; Wilcheck, M Protein biotinylation. Methods in Enzymo- 34 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

35 logy, 184: Boets, A.; Jansens, S.; Denolf, P.; Peferoen, M.; Degheele, D.; Van Rie, J Sequential observations of toxin distribution and histopathological effects of CryIIIA in the gut of intoxicated Leptinotarsa decemlineata larvae. XXVIIth Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, p Bradford, M A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72: Brandtzaeg, P Tissue preparation methods for imunocytochemistry. In: Bullock G. & Petruz P., Techniques in imunocytochemistry. Academic Press, London. pp Bravo, A.; Jansens, s.; Peferoen, M. 1992a. lmmunocytochemical localization of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins in intoxicated insects. Journal of Invertebrate Pathology, 60: Bravo, A.; Hendrickx, K.; Jansens, S.; Peferoen, M. 1992b. Immunocytochemical analysis of specific binding of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins to lepidopteran and coleopteran midgut membranes. Journal of Invertebrate Pathology, 60: Burke, B.; Griffihs, G.; Reggio, H.; Louvard, D. & Warren, G A monoclonal antibody against a 135-K Golgi membrane protein. European Molecular Biology Organization Journal, 1: Denolf, P.; Jansens, S.; Peferoen, M.; Degheele, D.; Van Rie, J. 1993a. Two different Bacillus thuringiensis delta-endotoxin receptors in the midgut brush border membrane of the European corn borer, Ostrinia nubilalis. Applied Environmental Microbiollogy, 59(6): Denolf, P.; Jansens, S.; Van Houdt, S.; Peferoen, M.; Degheele, D.; Van Rie, J. 1993b. Biotinylation of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins. Applied Environmental Microbiollogy, 59(6): Endo, Y. & Nishiitsutsuji-Uwo, J Mode of Action of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin: Histopathological Changes in the Silkworm Midgut. Journal of Invertebrate Pathology, 36: Estada, U.; Ferre, J Binding of insecticidal crystals proteins of Bacillus thuringiensis to the midgut brush border of the Cabbage Looper, Trichoplusia ni and selection for resistance to one of the crystal proteins Applied Environmental Microbiollogy, 60(10): Fiuza, L. M Etude des sites récepteurs et de la toxicité des delta-endotoxines de Bacillus thuringiensis Berliner chez les larves de la Pyrale du riz, Chilo suppressalis Walker. Thèse de doctorat en Sciences Agronomiques, ENSA-M, Montpellier, France. 180p. Fiuza, L. M.; Nielsen-Leroux, C.; Goze, E.; Frutos, R.; Charles, J- F Binding of Bacillus thuringiensis Cry1 toxins to the midgut brush border membrane vesicles of Chilo suppressalis (Lepidoptera, Pyralidae): evidence of shared binding sites. Applied Environmental Microbiollogy, 62: Fiuza, L. M Receptores de Bacillus thuringiensis em insetos: análises in vitro de receptores membranares de proteínas Cry em larvas de lepidópteros. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 32: Gill, S.; Cowles, E. & Pietrantonio, P The mode of action of Bacillus thuringiensis endotoxins. Annual Reviews Entomology, 37: Höfte, H. & Whiteley, H.R Insecticidal crystal proteins of Bt. Microbiological Reviews, 53: Hua, G.; Masson, L.; Jurat-Fuentes, J. L.; Schwab, G.; Adang, M. J Binding Analyses of Bacillus thuringiensis Cry deltaendotoxins using brush border membrane vesicles of Ostrinia nubilalis Applied Environmental Microbiollogy, 67(2): Knight, P.; Crickmore, N. & Ellar, D The receptor for Bacillus thuringiensis CryIAc delta-endotoxin in the brush border membrane of the lepidopteran Manduca sexta is aminopeptidase N. Molecular Microbiology, 11: Knowles, B.H. & Bow, J.T The delta-endotoxins of Bacillus thuringiensis: models for their mechanism of action on the insect gut. BioEssays, 15: Laemmli, U Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: Lee, M. K.; You, T. H.; Young, B. A.; Cotrill, J. A.; Valatis, A. P.; Dean, D. H Aminopeptidase N purified from Gypsy moth brush border membrane vesicles is a specific receptor for Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin. Applied Environmental Microbiollogy, 62: Liang, Y., Patel, S. S.; Dean, D. H Irreversible binding kinetics of Bacillus thuringiensis Cry1A delta-endotoxins to Gypsy moth brush border membrane vesicles is directly correlated to toxicity. Journal of Biology Cheml. 270: Mahillon, J. & Delcour, J. A A convenient procedure for the preparation of highly purified parasporal crystal of Bacillus thuringiensis. Journal. of Microbiology Methods, 3: Ravoahangimalala, O.; Charles, J-F.; Schoeller-Raccaud, J Immunological localization of Bacillus thuringiensis serovar israelensis toxins in midgut cells of intoxicated Anopheles gambie larvae (Diptera: Culicidae). Research of Microbiology 144: Sharpe, E.; Nickerson, K.; Bulla, L. & Aronson, J Separation of spores and parasporal crystals of Bacillus thuringiensis in gradients of certain x-ray contrasting agents. Applied Microbiology, 30(6): Schnepf, E., Crickmore, N., Vanrie, J., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D.R., Dean, D.H., Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiology Molecular Biology Review 62: Van Rie, J.; Jansens, S.; Höfte, H.; Degheele, D. & Van Mellaert, H Receptors on the brush border membrane insect midgut as determinants of the specificity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins. Applied Environmental Microbiology, 56: Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 35

36 Pesquisa TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS ÀS PRAGAS AGRÍCOLAS Pesquisa Diouneia Lisiane Berlitz Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Aline Oliboni de Azambuja Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Andresa Patrícia Regert Lucho Engenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Neiva Knaak Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Rogério Schünemann Biólogo (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Jaime Vargas de Oliveira Engenheiro Agrônomo (UFSM), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade/Entomologia (UFPEL), Lidia Mariana Fiuza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM- Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). controle microbiano de insetos tem sido considerado um método de controle seguro aos humanos e ao meio ambiente, sendo assim nesse trabalho são apresentados dados de toxicidade de B. thuringiensis a insetospraga, especialmente aos lepidópteros e coleópteros pragas de importância agrícola. Os trabalhos de pesquisa enfatizam os métodos de ensaios toxicológicos em laboratório e campo, utilizando o entomopatógeno B. thuringiensis e as formas imaturas das espécies-alvo. 1.1 Os insetos-praga Entre os insetos-praga para os quais têm sido desenvolvidos estudos e aplicações de controle com B. thuringiensis estão os lepidópteros, Spodoptera frugiperda e Anticarsia gemmatalis, e o coleóptero Oryzophagus oryzae, os quais serão apresentados como modelo de estudos de toxicidade com B. thuringiensis. A lagarta militar, S. frugiperda, ataca e causa danos a várias culturas de importância econômica, como: sorgo, milho, arroz, alfafa, cana-de-açúcar e algodoeiro (Cruz et al., 1999; Gallo et al., 2002), ao passo que, a lagarta da soja A. gemmatalis é praga-chave para essa cultura e também tem importância para culturas como amendoim, feijão e alfafa (Gallo et al., 2002). Já o gorgulho aquático, O. oryzae, cujas larvas são conhecidas como bicheira-da-raiz-do-arroz, é o principal inseto-praga da cultura do arroz irrigado no sul do Brasil (Martins et al., 2004) e, por isso, é também um dos mais estudados pelas instituições de pesquisa dessa região (Costa, 2003). As lagartas de S. frugiperda e A. gemmatalis podem ser criadas em laboratório, desde que respeitados determinados padrões de temperatura, umidade relativa e fotoperíodo (28ºC, 70%U.R., 12h de fotoperíodo). O ciclo evolutivo desses insetos, em laboratório, ocorre em torno de 30 dias, desde a fase de ovo até a emergência do adulto. Os adultos são mantidos em gaiolas de acrílico com alimentação a base de glicose aquosa (10%), onde acasalam e realizam a postura. Os ovos são retirados diariamente e acondicionados junto à dieta artificial, sendo dieta de Poitout para S. frugiperda e dieta de Greene para A. gemmatalis. As lagartas desenvolvemse nessa dieta até a formação da pupa, que então são separadas em macho ou fêmea até emergir o adulto, finalizando o ciclo. No caso de O. oryzae, por se tratar de uma larva aquática, que se alimenta das raízes das plantas de arroz, não é descrito nenhum método de criação eficiente desse inseto, em laboratório. Portanto, quando realizados os bioensaios, esses insetos são coletados diretamente de áreas de plantio de arroz infestadas, trazidos ao laboratório para então se- 36 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

37 Figura 1. Bioensaios com lagartas de Spodoptera frugiperda (A) ou Anticarsia gemmatalis e larvas de Oryzophagus oryzae (B) rem utilizados nos ensaios biológicos. 1.2 Bioensaios de B. thuringiensis com os insetos-praga Para determinar a atividade inseticida de isolados bacterianos, os bioensaios podem ser classificados como preliminares ou seletivos. A utilização de suspensão de células e esporos bacterianos é uma forma de identificar isolados ativos cujas propriedades mostram eficiência no controle de insetos-praga. Bioensaios também são utilizados para determinar a Concentração Letal Média (CL 50 ), ou seja, a quantidade de entomopatógeno que deve ser utilizada para controlar a metade da população do inseto. Para esses, são usados os isolados que causaram um eficiente índice de mortalidade nos testes preliminares. Nesta análise são utilizadas suspensões contendo células e esporos ou a proteína purificada, dosados em diferentes concentrações. Os ensaios de toxicidade são importantes também, pois revelam injurias e detrimento morfológico, além de determinar em quanto tempo ocorre a morte do inseto, Tempo Letal Médio (TL 50 ). Esses dados são então analisados para que, quando aplicado em lavouras, o bioinseticida seja eficiente no controle dos insetos-alvo. Os ensaios utilizando as lagartas de S. frugiperda e A. gemmatalis podem ser realizados em mini-placas de acrílico, contendo dieta artificial, onde é aplicada a quantidade de inóculo pré-determinada para uma lagarta por placa (Figura 1A). A quantidade de insetos pode variar entre 20 e 50 e o número de repetições entre três e cinco. No caso do coleóptero O. oryzae, os testes podem ser realizados em tubos de ensaio contendo uma planta de arroz, água e a suspensão bacteriana, com 5 larvas do inseto por tubo (Figura 1B). Todos os bioensaios utilizam placas ou tubos controle, contendo os insetos e sem adição dos tratamentos. Os ensaios são acondicionados em câmaras climatizadas nas mesmas condições de criação ou manutenção dos insetos em laboratório, descritas anteriormente. Os experimentos são avaliados até o 7º dia após a aplicação dos tratamentos e os dados são utilizados para o cálculo da mortalidade corrigida pela fórmula de Abbott (1970). 1.3 Controle de S. frugiperda com B. thuringiensis Apesar de inúmeras pesquisas envolvendo esse lepidóptero e seu controle, há dificuldade em encontrar um isolado bacteriano patogênico a essa espécie. Essa afirmação é comprovada no trabalho de Polanczyky et al. (2003) que, utilizando 58 subespécies de B. thuringiensis em S. frugiperda demonstraram que apenas B. thuringiensis morrisoni apresentou 80% de mortalidade das lagartas. Também Silva et al. (2004), testaram 77 isolados sendo que somente 4 foram ativos a espéciealvo. Recentemente, Berlitz & Fiúza (dados não publicados) testaram 132 isolados onde apenas um apresentou alta toxicidade ao inseto, com 100% de mortalidade, quando utilizada a suspensão de células e esporos bacterianos. Em outro trabalho, Berlitz et al. (2003) testaram 24 isolados de B. thuringiensis provenientes de diversas regiões orizícolas do RS e obteve as maiores mortalidades entre 31,6 e 100% com apenas cinco isolados, sendo que a cepa com maior potencial inseticida foi analisada quanto ao perfil protéico confirmando a presença de proteínas ativas contra lepidópteros. As reduzidas taxas de mortalidade podem estar relacionadas a diferentes fatores, como por exemplo, o modo de ação das proteínas bacterianas no intestino do inseto, ou modificações no sítio de ligação dessas toxinas na membrana intestinal. Além disso, cada isolado tem uma característica genética particular, ou seja, essas toxinas são codificadas por genes e esses têm uma determinada especificidade. Em outro trabalho, Berlitz & Fiuza (2004) testaram B. thuringiensis aizawai proveniente do produto formulado Xentari mostrando que a suspensão celular apresentou CL 50 de 1,9x10 8 UFC/mL (Unidade Formadora de Colônia/mL) reduzindo em 56,7% o consumo alimentar das lagartas. Isso indica que a bactéria inibe a alimentação do inseto-praga, o que também está relacionado com a mortalidade das lagartas. Entretanto o fato de um isolado causar mortalidade às lagartas não implica que, quando purificadas as proteínas tóxicas, essas serão ativas ao inseto. É o que ocorreu na pesquisa de Berlitz (2006), que, quando utilizada a suspensão de células e esporos bacterianos obtiveram 100% de mortalidade, entretanto quando purificadas as proteínas do isolado, essas causaram baixa mortalidade às lagartas apresentando CL 10 de 268µg/mL. Esse fato pode estar relacionado ao conjunto de fatores de virulência presentes na bactéria, ou então a presença de outras toxinas como, por exemplo, proteína Vip, exotoxinas, hemolisinas, quitinases, entre outras, que estão presentes na suspensão bacteriana. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 37

38 A CL 50 de proteínas Cry de B. thuringiensis aizawai para lagartas de 3º ínstar de S. frugiperda foi determinada por Lucho (2004). As proteínas Cry foram obtidas a partir de bioinseticida comercial (Xentari ), purificadas em gradiente de sacarose, solubilizadas em tampão fosfato (ph 10) e avaliadas em SDS-PAGE. Nos bioensaios foram avaliadas seis concentrações de proteínas Cry (0,27 a 8,80 µg/ml) e testemunha (água destilada e esterilizada), sendo aplicados 10 µl sobre a superfície de folhas de milho acondicionadas em mini-placas de acrílico, contendo um inseto. Cada tratamento foi constituído de 30 lagartas e 3 repetições, totalizando 630 insetos. Os resultados obtidos por Lucho (2004) apontaram CL 50 de 2,22; 0,41 e 0,18 µg/ml para 2, 3 e 4 dias após a aplicação dos tratamentos, respectivamente, e revelaram que as proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C e Cry1D sintetizadas por B. thuringiensis aizawai são altamente tóxicas à S. frugiperda. Para a mesma espécie, S. frugiperda, os dados de Knaak et al. (2006) mostram que a toxicidade das proteínas Cry1Ab e Cry1Ac, sintetizadas por B.thuringiensis thuringiensis 407 (ph 408) e B.thuringiensis kurstaki HD- 73, respectivamente, revelaram uma CL 50 de 9,29 e 1,79 µg/cm 2 às lagartas de 1º instar. Nesse sentido, os dados de Lambert et al. (1996) revelam que a proteína Cry1Ac é muito tóxica para Heliothis virescens, mas não mostra nenhuma atividade contra Helicoverpa armigera. Os mesmos autores relatam que Cry1Ca exibe uma atividade forte contra S. exigua e S. littoralis, mas não contra S. frugiperda. Peyronnet et al. (1997) utilizaram Cry1Aa em Lymantria dispar causando uma despolarização rápida e irreversível da membrana intestinal, mas Cry1Ab e Cry1Ac eram inativas. Estes resultados estão de acordo com Van Frankenhyzen et al. (1991) que demonstraram um nível alto de toxicidade para Cry1Aa, mas nenhuma atividade às outras duas toxinas, confirmando assim a especificidade das proteínas Cry de B. thuringiensis aos lepidópteros. Considerando os isolados brasileiros, Praça et al. (2004) selecionando cepas de B. thuringiensis efetivas contra lagartas de 2º ínstar de S. frugiperda, compararam novas cepas ao B. thuringiensis kurstaki HD-1 (CL 50 de 0,285 µg/cm 2 ), obtendo CL 50 de 0,09 e 0,52 µg /cm 2, para S234 e S997, respectivamente, que revelou a nova cepa S234 como a mais tóxica à S. frugiperda. Já nos estudos com proteínas Cry, Aranda et al. (1996) determinaram que a CL 50 para S. frugiperda das proteínas Cry1Ab e Cry1Ac foram superiores a 2 µg/cm Controle de A. gemmatalis com B. thuringiensis As análises de mortalidade de isolados de B. thuringiensis às lagartas de A. gemmatalis, realizados por Schünemann (2006), mostraram que entre os 158 isolados testados, 138 foram ativos e 20 inativos. Entre os isolados patogênicos, 39 deles causaram até 29% de mortalidade, 93 entre 30 e 69% e 6 entre 70 e 100%. Análises similares foram encontrados por Bobrowski et al. (2001) com o mesmo banco de bactérias. Azambuja & Fiuza (2003) obtiveram 37 e 50% de mortalidade corrigida contra a lagarta-da-soja utilizando dois isolados naturais de B. thuringiensis provenientes de regiões orizícolas do RS. Nas avaliações de patogenicidade realizados com isolados primitivos, Souza et al. (1999) e Silva et al. (2004), revelam grandes índices de isolados patogênicos a mesma ordem de inseto. Por outro lado, a ocorrência de isolados inativos a lepidópteros é bastante freqüente. As variações entre as concentrações de proteínas inseticidas presentes em cada suspensão bacteriana pode ser a causa dessas diferenças entre a atividade inseticida dos isolados. A ausência de patogenicidade de isolados de B. thuringiensis pode estar relacionada à classe de proteínas sintetizadas pelo mesmo, a qual não apresenta especificidade ao inseto praga-alvo. Porém, Fiuza (2003) e Praça et al. (2004) destacam que o mesmo isolado bacteriano pode ter atividade inseticida sobre espécies da mesma ordem, ou até mesmo a outras ordens de insetos. Em muitos casos a diferença de toxicidade das cepas de B. thuringiensis pode estar relaciona ao próprio inseto, onde, por exemplo, a extensão da variação genética de A. gemmatalis pode estar relacionada a transferência de genes entre populações geográficas e o tempo em que essas populações encontram-se separadas, onde o mecanismo de isolamento reprodutivo se torna uma barreira efetiva (Sosa-Gómez, 2004). Sendo assim, os dados da suscetibilidade de A. gemmatalis aos diferentes isolados de B. thuringiensis são importantes para um manejo local ou regional desse inseto-praga, pois em m trabalhos envolvendo cepas de B. thuringiensis kurstaki, por exemplo, Mascarenhas et al. (1998) e Dias et al. (1999) encontraram diferentes índices de mortalidade da mesma espécie. 1.5 Controle de O. oryzae com B. thuringiensis Para O. oryzae são relacionados poucos dados na literatura a respeito da ação de proteínas de B. thuringiensis. Por se tratar de uma larva que se alimenta das raízes da planta de arroz, portanto fica submersa, é difícil o acesso de bioinseticidas ao local. Os atuais métodos de controle dessa praga restringem-se aos inseticidas químicos que são utilizados basicamente no tratamento de semente ou distribuídos em cobertura na água de irrigação. Na busca de métodos alternativos de controle desse inseto, o entomopatógeno B. thuringiensis mostra-se promissor na obtenção de plantas transgênicas resistentes à praga-alvo. Nesse sentido, Pinto et al. (2003), selecionaram 6 isolados de B. thuringiensis com a presença de genes da classe cry 3 ou cry 7, que sintetizam as proteínas inseticidas à ordem dos coleópteros, e avaliaram sua atividade inseticida à O. oryzae. Dentre os isolados testados pelos autores, dois causaram mortalidade corrigida de 100%, três entre 59 e 67% e um em torno de 50%. Esses dados foram utilizados por Berlitz (2006) que selecionou um isolado com a presença do gene cry3 que causou 53% de mortalidade com a suspensão de células e esporos bacterianos, onde as proteínas inseticidas foram purificadas, dosadas e aplicadas nos bioensaios com os insetos (Figura 1B). Os resultados dessa pesquisa podem ser aplicados na utilização de genes cry, uma vez que causou a mortalidade das larvas do coleóptero, quando utilizadas às proteínas purificadas, obtendo uma CL 50 de 5,4µg/mL. Em estudos preliminares com essa espécie-alvo, Steffens et al. (2000) obtiveram 53,41% de mortalidade às larvas do gorgulho aquático com um isolado de B. thuringiensis contendo genes cry 3, específicos a coleópteros. Considerando os dados mencionados, os resultados obtidos pelos diferentes autores confirmaram a predição da atividade inseticida de B. thuringiensis possivelmente devido à presença dos genes cry3 e cry7, os quais codificam toxinas específicas a coleópteros (Ben-Dov et al., 1997). 1.6 Referências Abbott, W. S., 1925, A method of computing the effectiveness of insecticide. J. Econ. Ent. v.18, p Aranda E.; Sanchez, J.; Peferon, M.; Guereca, L.; Bravo, A Interactions of Bacillus thuringiensis Crystal Proteins with the Midgut Epithelial Cells 38 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

39 of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) Journal Invertebrate Pathology, 68: Azambuja, A.O.; Fiuza, L.M. Isolamento de Bacillus thuringiensis e patogenicidade à Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera, Noctuidae). In: Mostra de Iniciação Científica da Unisinos. Junho, São Leopoldo, RS Ben-Dov, E.; Zaritski, A.; Dahan, E.; Barak, Z.; Sinai, R.; Manasherob, R.; Khamraev, A.; Troitskaya, E.; Dubitsky, A.; Berezina, N. & Margalith, Y. Extended screening by PCR for seven cry-group genes from field-collected strains of Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol., 63: , Berlitz, D.L.; Azambuja, A.O.; Antonio, A.C.; Oliveira, J.V.; Fiuza, L.M. Novos Isolados e Proteínas Cry de Bacillus thuringiensis Aplicados no Controle de Lagartas de Spodoptera frugiperda. In: III Congresso Brasileiro de Arroz Irrigado e XXV Reunião da Cultura do Arroz Irrigado. Agosto, Camboriú, SC Berlitz, D.L.; Fiuza, L.M Avaliação toxicológica de Bacillus thuringiensis aizawai para Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), em laboratório. Biociências 12(2): Berlitz, D.L Toxicologia de Bacillus thuringiensis e Melia azedarach em organismos associados a orizicultura. Dissertação (Mestrado), Universidade do Vale do Rio dos Sinos, São Leopoldo: UNISINOS, 2006, 83p. Bobrowski, V. L.; Pasquali, G.; Zanettini, M. H. B.; Fiuza, L. M., 2001: Detection of cry1 genes in Bacillus thuringiensis isolates from south of Brazil and activity against Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae). Brazilian Journal of Microbiology. 32: Costa, E.L.N. Controle de Oryzophagus oryzae (Lima, 1936) com formulações comerciais de fungos entomopatogênicos. Porto Alegre: UFRGS, Dissertação (Mestrado Fitossanidade) Programa de Pós Graduação em Fitotecnia, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, p. Cruz, I.; Figueiredo, M.L.C.; Matoso, M.J. Controle biológico de Spodoptera frugiperda utilizando o parasitóide de ovos Trichogramma. Circular Técnica nº 30. Sete Lagoas: EMBRAPA/ CNPMS, p. Dias, S. C.; Sagardoy, M. A.; Silva, S. F.; Dias, J. M. C. S Characterization and pathogenic evaluation of Bacillus thuringiensis and Bacillus sphaericus isolates from Argentinean soils. Biological Control. 44 (1): Fiuza, L.M. Bacillus thuringiensis no controle de insetos: diversidade, especificidade e impacto ambiental. In: SIM- PÓSIO DE CONTROLE BIOLÓGICO, 8. São Pedro, Resumos... Piracicaba: Sociedade Entomológica do Brasil, p. 47. Gallo, D.; Nakano, O.; Silveira Neto, S.; Carvalho, R.P.L.; Baptista, G.C.; Berti Filho, E.; Parra, J.R.P.; Zucchi, R.A.; Alves, S.B.; Vendramim, J.D.; Marchini, L.C.; Lopes, J.R.S.; Omoto, C. Entomologia agrícola. Piracicaba: FE- ALQ, p. Knaak, N.; Franz, A.R.; Santos, G.F,; Fiuza, L.M Efeito in vitro de cepas e proteínas cry de Bacillus thuringiensis em fungos fitopatogênicos da cultura do arroz irrigado.. Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Rio dos Sinos. 57p. Lucho, A.P.R. Manejo de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) em arroz irrigado. Dissertação (Mestrado em Diversidade e Manejo da Vida Silvestre), Universidade do Vale do Rio dos Sinos, São Leopoldo: UNISINOS, 2004, 73p. Lambert, B.; Buysse, L.; Decock, C.; Jansens, S.; Piens, C.; Saey, B.; Seurinck, J.; Audenhove, K.V.; VanRie, J.; Vliet, A.V.; Peferoen, M A Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein with a high activity against members of the family Noctuidae. Applied Environmental Microbiology 62: Martins, J.F.S.; Grützmacher, A.D.; Cunha, U.S. Descrição e manejo integrado de insetos-praga em arroz irrigado. In: Gomes, A. da S.; Magalhães JR., A.M. (Editores). Arroz irrigado no Sul do Brasil. Brasília: Embrapa Informação Tecnológica, 2004a. p Mascarenhas, R. N., D. J.; Boethel, B. R.; Leonard, M. L.; Boyd, Andc. G. Clemens Resistance monitoring to Bacillus thuringiensis insecticides for Soybean Loopers (Lepidoptera: Noctuidae) collected from soybean and transgenic Bt cotton. Journal Economic Entomology. 91: Peyronnet, O.; Vachon, V.; Brousseau, R.; Baines, D.; Schwartz, J.L.; Laprade, R Effect of Bacillus thuringiensis Toxins on the Membrane Potential of Lepidopteran Insect Midgut Cells. Applied Environmental Microbiology 63: Pinto, L.M.N.; Azambuja, A.O.; Oliveira, J.V.; Menezes, V.G.; Fiuza L.M. Toxicidade de isolados de Bacillus thuringiensis pré-selecionados por PCR, contra Oryzophagus oryzae (Coleoptera, Curculionidae). In: III Congresso Brasileiro de Arroz Irrigado e XXV Reunião da Cultura do Arroz Irrigado. 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Agosto, Porto Alegre, RS Van Frankenhyzen, K.; Gringorten, J.L.; Milne, R.E.; Gauthier, D.; Pusztai, M.; Brousseau, R.; Masson, L Specificity of activated CryIA proteins from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 for defoliating forest Lepidoptera. Applied Environmental Microbiology 57: Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 39

40 TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS Pesquisa AOS INSETOS SOCIAIS Pesquisa as interações com as plantas, as formigas e os cupins podem se tornar pragas e nesse caso faz-se necessário o controle, onde os entomopatógenos assumem um papel importante no controle biológico. Nesse contexto, alguns dados de pesquisa sobre os ensaios de toxicidade de B. thuringiensis às formigas cortadeiras e aos cupins de montículo são apresentados nesse artigo. 1.1 Os insetos sociais Nas sociedades de insetos, o sistema de castas possibilita uma divisão do trabalho, permitindo a execução de múltiplas tarefas, nas quais indivíduos estéreis são responsáveis pela manutenção da colônia (obtenção de alimento, defesa e cuidados com a prole), e os reprodutores limitam-se a reprodução. O Brasil está entre os países que contemplam a maior diversidade de insetos sociais do mundo. As formigas estão entre os organismos mais abundantes do planeta, somando, em conjunto, mais de 10% da massa de todos os organismos terrestres, incluindo mamíferos de grande porte (Hölldobler e Wilson, 1990). De acordo com estes autores, em um hectare da Floresta Amazônica vivem mais de oito milhões de formigas. As formigas cortadeiras são os principais herbívoros dos Neotrópicos. Abundantes nas suas numerosas colônias desfolham a vegetação, sendo consideradas importantes pragas agrícolas no Brasil, com prejuízos estimados em milhões de reais. O gênero Acromyrmex representa uma ameaça às plantas cultivadas. Esses insetos também se destacam por atacarem uma ampla variedade de vegetais, incluindo plantas ornamentais, reflorestamento e pastagens. As diferentes espécies deste gênero apresentam ampla distribuição geo- Raquel de Castilhos-Fortes Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente (UFRGS) Aline Oliboni de Azambuja Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Laura Massochin Nunes Pinto Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Lidia Mariana Fiuza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD- Montpellier). Figura 1. Bioensaios com cepas de Bacillus thuringiensis e Nasutitermes ehrhardti, em laboratório 40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

41 Figura 2. Representação esquemática dos bioensaios com Acromyrmex lundi e Bacillus thuringiensis gráfica no Rio Grande do Sul, evidenciando hábitos de forrageamento bastante diversos (Gusmão e Loeck, 1999). Os cupins estão presentes praticamente em todos os ambientes terrestres ou que sofreram alguma perturbação antrópica, alimentando-se basicamente de celulose, obtida através desta capacidade de ajustar-se a diversos ecossistemas. Muitas espécies desempenham um papel ecológico significativo, reciclando nutrientes minerais no solo e participando na regeneração de ambientes devastados. Porém, várias outras espécies se destacam como os organismos mais daninhos à cultura agrícola e florestal (Berti-Filho, 1993). No Brasil, além de dificultarem seriamente os tratos culturais, os cupins de montículo são considerados importantes pragas de pastagens e culturas de arroz, milho, canade-açúcar, amendoim e eucalipto. As principais espécies responsáveis por estes danos pertencem aos gêneros Cornitermes, Syntermes, Heterotermes, Nasutitermes, entre outros. O controle desses insetos vem sendo realizado basicamente com a aplicação de inseticidas químicos, sendo um método alternativo as bactérias entomopatogênicas que podem ser isoladas naturalmente do corpo desses insetos, representando mais uma ferramenta de combate ao inseto-praga, sem prejudicar o meio ambiente. 1.2 B. thuringiensis isolados de insetos-sociais Na análise da patogenicidade de B. thuringiensis sobre um determinado inseto, o primeiro passo a ser adotado é a correlação da atividade das proteínas Cry no inseto-alvo já descrita. Caso este efeito ainda não tenha sido avaliado, uma das alternativas poderá ser por meio do isolamento do microrganismo de indivíduos da espécie de inseto-alvo. Diversos trabalhos são publicados anualmente descrevendo o isolamento de novas cepas de B. thuringiensis de diferentes substratos, inclusive dos próprios insetos (Borm et al., 2002). Nesse sentido, Azambuja et al. (2001) obtiveram, a partir de 80 indivíduos de Acromyrmex sp., 35 isolados do gênero Bacillus, entre os quais 14 foram identificados como B. thuringiesis. Através deste estudo pode-se constatar a elevada ocorrência de B. thuringiensis associado a formigas cortadeiras. Para tanto, os insetos devem ser coletados com pinça e acondicionados em frascos esterilizados a -18ºC até o momento de sua utilização. O isolamento é realizado através da maceração de 10 insetos em solução salina, sendo que 1mL desta suspensão é submetida a pasteurização, em seguida a inoculação em Ágar Nutriente e incubação durante 24h a 30 C. As colônias obtidas devem ser então inoculadas em meio seletivo (Penicilina G) e mantidas a 30 C e 180rpm durante 24 horas. As amostras positivas devem ser avaliadas em microscopia de contraste de fase para identificação das inclusões paraesporais, características de B. thuringiensis. Os isolados de B. thuringiensis, oriundos de A. lundi, que causaram mortalidade ao referido inseto foram avaliados por PCR quanto a sua constituição de genes cry conforme descrito por Pinto et al. (2003). Os autores identificaram que sete dos nove isolados que apresentaram toxicidade a A. lundi amplificaram fragmentos de DNA correspondentes a pelo menos uma das classes de genes cry avaliadas, sendo elas cry1 e/ou cry9. Os genes cry2, cry3, cry7 e cry8, os quais também foram avaliados na pesquisa, não foram detectados nas amostras testadas. Além disso, 22% dos isolados obtidos de A. lundi não amplificaram com nenhum dos primers avaliados, podendo Figura 3. Patogenicidade de Bacillus thuringiensis à Nasutitermes ehrhardti, em ensaios de laboratório; B. thuringiensis sooncheos (Bts); B.thuringiensis roskildiensis (Btr); B. thuringiensis yunnanensis (Bty); B. thuringiensis huazhongensis (Bth); B. thuringiensis braliliensis (Btb); B. thuringiensis colmeri (Btc) e B. thuringiensis kurstaki (Btk) Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 41

42 Figura 4. Isolados de Bacillus thuringiensis a partir da maceração de Nasutitermes ehrhardti infectados; A- Bacillus thuringiensis soocheon; B- Bacillus thuringiensis roskildiensis representar novos genes cry. 1.3 Bioensaios de B. thuringiensis com insetos-sociais Cupins e formigas sofrem ação de diversos tipos de patógenos como: vírus, bactérias, fungos e nematóides, sendo a defesa contra os mesmos pouco conhecida. A complexidade do comportamento e a biologia dificultam o controle destes insetos (Leonardo, 1989; Diehl-Fleig, 1993). Portanto, técnicas de bioensaios evidenciando o efeito desses entomopatógenos sobre os insetos sociais, considerados pragas, são escassos. Nessa linha de pesquisa, Castilhos-Fortes et al. (2002) avaliaram a patogenicidade de diferentes cepas de B. thuringiensis, sobre Nasutitermes ehrhardti, onde foram utilizadas suspensões contendo uma mistura de células vegetativas, esporos e cristais. Porções de celulose (1cm 2 ), utilizadas como substrato alimentar, foram mergulhadas nas suspensões de B. thuringiensis, as quais foram colocadas em placas de acrílico com seis compartimentos de 5,5 cm de diâmetro. Em cada compartimento, contendo 1cm 2 de celulose tratada, foram colocados dez insetos (Figura 1). O acondicionamento dos ensaios foi feito em estufa incubadora tipo B.O.D., a 28 O C, 70% de umidade relativa, no escuro. A mortalidade dos insetos foi avaliada diariamente até o 7 dia após a instalação dos bioensaios, observando-se os cupins mortos com sintomas característicos de intoxicação por B. thuringiensis. Em 2003, Pinto et al. testaram o efeito de B. thuringiensis em formigas cortadeiras, cujo método de bioensaio foi desenvolvido objetivando a sobrevivência dos indivíduos por no mínimo sete dias, tempo suficiente para a avaliação de bioensaios. Esse método foi constituído de uma dieta líquida composta de peptona bacteriológica, glicose e extrato de levedura, com substituição periódica de 48 horas, previamente acondicionada em pequenos frascos de polipropileno, acrescida de cinco indivíduos de Acromyrmex lundi (Figura 2). Utilizando o referido método de bioensaio de B. thuringiensis com Acromyrmex lundi, pode-se obter 100% de sobrevivência das formigas por 180 horas (7,5 dias), tempo suficiente para a avaliação dos bioensaios com o entomopatógeno. 1.4 Toxicidade de B. thuringiensis aos cupins e formigas cortadeiras As referências de B. thuringiensis contra isópteros são restritas, havendo poucos dados disponíveis, como os de Cowie et al. (1989), que citam algumas cepas de B. thuringiensis tóxicas a várias espécies de térmitas em condições laboratoriais. Khan et al. (1985), também ressaltam a carência de trabalhos desenvolvidos visando testar B. thuringiensis em térmitas, embora tenham citado os trabalhos de Smythe & Coppel (1965), os quais constataram que a solução com B. thuringiensis mostrou-se tóxica a três espécies de Reticulitermes, bem como a Zootermopsis angusticollis. Khan et al. (1977) isolaram B. thuringiensis a partir de ninfas do isoptero Bifiditermes beesoni infectadas, encontradas em campo. Nos testes de toxicidade contra Microcerotermes champion, a suspensão de bactérias testada causou alta mortalidade em condições laboratoriais. Considerando a patogenicidade de B. thuringiensis para N. ehrhardti, Castilhos-Fortes el al. (2002) testaram 57 cepas desta bactéria, sendo que sete mostraram-se mais efetivas: B. thuringiensis sooncheon (Bts) e B. thuringiensis roskildiensis (Btr) com uma mortalidade de 100%; seguidos dos isolados B. thuringiensis yunnanensis (Bty) com 71,4%; B. thuringiensis huazhongensis (Bth) com 57,1%; B. thuringiensis brasiliensis (Btb) com 52,3%; B. thuringiensis colmeri (Btc) com 42,85% e B. thuringiensis kurstaki (Btk) com 28,57% de mortalidade ao 7 o dia após a aplicação dos tratamentos, conforme resultados apresentados na Figura 3. Para a determinação da CL 50 de B. thuringiensis os referidos autores utilizaram os isolados B. thuringiensis sooncheon e B. thuringiensis roskildiensis os quais causaram 100% de mortalidade nos ensaios pré-seletivos. As CL 50 de B. thuringiensis sooncheon observadas foram 46,98x10 8, 66,19x10 6 e 5,14x10 5 esporos/ ml, aos três, cinco e sete dias após os tratamentos, respectivamente. Para B. thuringiensis roskildiensis foram 30,78x10 5, 48,40x10 6 e 16,80x10 4 esporos/ml aos três, cinco e sete dias, respectivamente. A toxicidade de B. thuringiensis para N. ehrhardti foi confirmada pelos autores através de observações microscópicas de cupins macerados aos três, cinco e sete dias após a aplicação dos tratamentos. As estruturas de B. thuringiensis formadas por células em forma de bastonete, cadeias, esporos e inclusões paraesporais podem ser observadas na Figura 4A para B. thuringiensis sooncheon e na Figura 4B para B. thuringiensis roskildiensis. A patogenicidade e o desenvolvimento de B. thuringiensis foram estudados por Khan et al. (1985) nos isópteros Microtermes championi e Bifiditermes beesoni, que se mostraram suscetíveis à infecção causada pela bactéria após a aplicação do formulado Thuricide-HP. De acordo com a análise histopatológica, foi constatado que a ação de B. thu- 42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

43 ringiensis é mais rápida em M. championi quando comparado a B. beesoni, sendo o intestino médio do inseto invadido pela bactéria seis horas após a ingestão, a qual penetra a cavidade corporal, o tecido adiposo e células hipodérmicas 20 a 24 horas após a infecção. Em B. beesoni, a bactéria instalou-se próximo à membrana peritrófica depois de 24 horas, atacou o epitélio e células regenerativas após 48 horas e alcançou a membrana basal do intestino médio 72 horas após a infecção. Nos estudos do efeito patogênico de B. thuringiensis contra A. lundi foram identificados isolados ativos contra esta formiga cortadeira, sendo que o isolado Bt HA48 atingiu 100% de mortalidade (Pinto et al., 2003). 1.5 Perspectivas Em insetos sociais, aspectos como hábitos comportamentais devem ser considerados, uma vez que a eliminação de uma porção da colônia não é suficiente para a extinção. Os fragmentos restantes têm capacidade de recuperação e nova infestação, portanto há necessidade de eliminação da rainha das colônias (Martins, 1998). O uso de organoclorados é o método mais utilizado para controlar populações de cupins e formigas e embora, com menos freqüência, outros métodos podem ser citados como o controle cultural, ação de predadores e aplicação de extratos vegetais (Wilcken e Raetano, 1995). O controle biológico é uma alternativa ao controle químico e vem ganhando destaque em pesquisas de manejo de populações de pragas. Os principais organismos utilizados para o controle de formigas e cupins são microrganismos patogênicos, em especial fungos e nematóides, e até o momento poucas pesquisas foram realizadas em laboratório com B. thuringiensis. As pesquisas têm publicado resultados satisfatórios no controle de formigas utilizando os fungos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Paecilomyces farinosus (Loureiro e Monteiro, 2005), além do microsporídeo Thelohania solenopsae (Williams e Deshazo, 2004). O mesmo ocorre com cupins avaliados frente a fungos entomopatogênicos, como B. bassiana (Bao & Yendol, 1971) e M. anisopliae (Kramm & West 1981; Hänel 1981 e 1982). Diferentes estudos visam determinar quais os organismos patogênicos como fungos ou nematóides, que poderiam ser utilizados contra os térmitas. Os resultados, geralmente, têm sido discrepantes. Outras linhagens ou espécies de patógenos deveriam ser testadas contra os térmitas subterrâneos, mas os testes de campo devem ser precedidos de estudos de laboratório para determinação da patogenicidade dos diferentes patógenos e linhagens. Isto pode ajudar a avaliar o potencial do agente patogênico e fornecer a base para estimar as concentrações requeridas em campo. Fernandes (1994) relatou que os principais problemas enfrentados na pesquisa sobre controle biológico de cupins são a carência de conhecimentos biológicos, o pequeno número de taxonomistas que trabalha com isópteros e a falta de outros grupos trabalhando em conjunto neste assunto. Contudo, bactérias entomopatogênicas podem ser consideradas agentes de controle biológico com potencial de patogenicidade e surgem como uma alternativa eficiente, ecológica e econômica para a solução dos danos causados por cupins e formigas. 1.6 Referências Azambuja, A.O. De; Pinto, L.M.N. & Fiuza, L.M Bacillus thuringiensis obtido de insetos sociais (Acromyrmex sp.) coletados em áreas orizícolas. In: VII Simpósio de Controle Biológico. Junho, Poços de Caldas, MG Bao, L.L.; Yendol, W. G Infection of the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar) with the fungus Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. Entomophaga, 16(3): Berti Filho, E. Cupins ou térmitas. Manual de pragas em florestas. 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Gusmão, L.G.; Loeck, A.E Distribuição geográfica de formigas cortadeiras do gênero acromyrmex (hymenoptera:formicidae) na zona sul do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Revista Brasileira de Agrociência, 5(1): Hänel, H A biossay for mesuring the virulence of the insect pathogenic fungi Metarhizium anisopliae against the termite Nasutitermes exitiosus (Hill). Zeitschrift fuer Angewandte Entomologie, 94: Hänel, H Selection of a fungus species, suitable for the biological control of the termite Nasutitermes exitiosus. Zeitschrift fuer Angewandte Entomologie, 92: Khan, K.; Jafri, R. H.; Ahmad, M The pathogenicity and development of Bacillus thuringiensis in termites. Pakistan Journal of Zoology, 17(3): Khan, K.; Qaisra, F.; Jafri, R. H Pathogenecity of locally discovered Bacillus thuringiensis strain to the termites Heterotermes indicola (Wasmann) and Microcerotermes championi (Snyder). Pakistan Journal of Scientific Research, 29: Kramm, K. R.; West, D.F Termite pathogens effects of ingested Metarhizium, Beauveria and Glioocadium conidia on workers termites (Reticulitermes sp.). Journal of Invertebrate Pathology, 40: 1-6. Leonardo, A. M. C A guerra química dos cupins. Ciência Hoje, 10(56): Loureiro, E.S.; Monteiro, A.C Patogenicidade de isolados de três fungos entomopatogênicos a soldados de Atta sexdens sexdens (Linnaeus, 1758) (Hymenoptera: Formicidae). Árvore, 29(4): Martins, C Perspectivas do controle biológico de cupins (Insecta, Isoptera). Revista Brasileira de Entomologia, 41(2-4): Pinto, L.M.N.; Azambuja, A.O.; Diehl, E.; Fiuza, L.M Pathogenicity of Bacillus thuringiensis isolates from two species of Acromyrmex (Hymenoptera, Formicidae). Brazilian Journal of Biology. 63: Williams, D.F.; Deshazo, R.D Biological control of fire ants: an update on new techniques. Annual Allergy Asthma Immunology 93: Wilcken, C.F.; Raetano, C.F Controle de cupins em florestas. In.: Alguns aspectos atuais da biologia e controle de cupins. FEALQ: Piracicaba, São Paulo. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 43

44 Pesquisa TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS ÀS PRAGAS URBANAS E VETORES Pesquisa Gabriela Cristina Alles Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Marcus Hübner Biólogo (FURG) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Lidia Mariana Fiuza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). utilização de bactérias entomopatogênicas do gênero Bacillus, como agente de controle populacional de pragas urbanas e vetores de agentes patogênicos, tem relevância nas pesquisas nacionais e internacionais. Sendo assim, esse trabalho trata do controle desses insetos, utilizando as espécies B. thuringiensis e B. sphaericus, onde se destacam as características das espécies do grupo Bacillus, sua ocorrência e alguns dados de autores que realizaram pesquisas na área da saúde pública. 1.1 Bacillus spp. no controle de vetores de doenças Insetos vetores de doenças Algumas espécies dos gêneros Anopheles, Aedes, Culex e Mansonia podem ser importantes vetores de patógenos humanos responsáveis por enfermidades como malária, febre amarela, encefalite, dengue e filariose. Estas doenças atingem um número significativo de pessoas em diversos países da Ásia, África e Américas. O Culex quinquefasciatus é responsável pela transmissão da Wuchereria bancrofti, agente etiológico da filariose bancroftiana no Brasil, além de ser um potencial vetor para o Vírus do Oeste do Nilo (VNO), originado na África, onde as aves são os hospedeiros e reservatórios naturais, podendo acometer o homem, cavalos e outras espécies, causando desde febre, dor de cabeça e mialgias até encefalite severa e meningite. Desde 1999 ocorrem epidemias da doença nos EUA e, até o momento, já foram registrados mais de 19 mil casos de infectados com mais de 750 óbitos (Centers for Disease Control and Prevention, 2006). Recentemente, o vírus passou a circular no Caribe e já foi isolado na Colômbia e em cavalos mortos na Argentina (Berrocal, 2006; Morales, 2006). O Brasil tem um plano de vigilância para detectar a introdução do VNO no país, visto que o Cx. quinquefasciatus, potencial vetor, é abundante, além de um contingente considerável de aves migratórias que ocorre no país por ser originário de rotas das Américas e de países vizinhos, onde ocorre a circulação do vírus (Luna et al., 2003). É importante ressaltar que há uma grande dificuldade do controle populacional destes mosquitos devido a suas características biológicas como curto ciclo de vida, alta capacidade reprodutiva e de adaptação ao ambiente. O controle, através do uso de inseticidas químicos tem apresentado problemas devido ao seu modo de ação não específico, além da possibilidade de rápida seleção de resistência de insetos a estes compostos. Por estas razões, a procura por agentes mais seletivos aumentou e, com isso, a adoção de métodos de controle biológico cresceu (Centers for Disease Control and Prevention, 2006) Bactérias entomopatogênicas A microflora bacteriana dos insetos, confinada no intestino, é rica, diversa e compreende bactérias Gram-positivas e negativas. Entre as bactérias Gram-positivas, algumas auxiliam na digestão dos alimentos, porém outras são patogênicas e recebem grande atenção dos pesquisadores devido ao seu potencial para o controle de pragas (Priest, 2000; Fiuza, 2001). Entre estes patógenos destacam-se as bactérias do gênero Bacillus, com potencial biopesticida que representam cerca de 90% do mercado mundial (Schnepf et al., 1998), sendo amplamente utilizados como uma alternativa aos inseticidas químicos em termos de segurança a organismos não-alvo e quando ocorre o desenvolvimento de resistência a inseticidas químicos (Rodrigo- Simón et al., 2006). Duas espécies de bactérias entomopatogênicas se destacam no controle biológico dos insetos vetores: B. sphaericus e B. thuringiensis israelensis. Estes microrganismos estão sendo comercializados há mais de uma década, pois produzem proteínas inseticidas que, ao serem ingeridas, são letais para as larvas dos mosquitos devido a sua ação no trato digestivo. O Bti tem atividade decrescente para os gêneros Aedes, Simulium, Culex e Mansonia, já o B. sphaericus é particularmente eficiente para o controle de larvas de Cx. quinquefasciatus e produtos comerciais à base desta bactéria estão disponíveis no Brasil. O principal fator tóxico do B. sphaericus para larvas de Cx. quinquefasciatus é a toxina binária (Bin) contida em um cristal protéico produzido durante a fase de esporulação da bactéria. Após a ingestão deste cristal pelas larvas, ocorre a sua solubilização em ph intestinal alcalino e a protoxina liberada no lúmen é clivada por serinoproteases para atingir a forma de toxina ativa. A toxina Bin ativa interage com receptores específicos presentes na membrana apical das células do epitélio intestinal das larvas, principalmente nas regiões do ceco gástrico e intestino posterior. O B. sphaericus apresenta uma grande vantagem em relação ao Bti: a ótima persistência em criadouros ricos em matéria orgânica, típicos de larvas de Culex, além de seus esporos sofrerem reciclagem nos cadáveres das larvas, o que pode ampliar seu período de persistência nos criadouros (Nicolas et al., 1987; Skovmand & Bauduin, 1997). Populações de larvas de Culex podem apresentar resistência ao B. sphaericus após 44 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

45 Tabela 1. Mortalidade corrigida de Blatella germanica e Periplaneta americana, submetidas aos tratamentos com sorovares de Bacillus thuringiensis Mortalidade Corrigida (%) Tratamentos B. germanica P. americana B.t. sorovar colmeri 6,65 0,0 B.t. sorovar yunnanensis 14,85 0,0 B.t. sorovar huazhangiensis 15,00 0,0 B.t. sorovar roskildiensis 16,65 0,0 B.t. sorovar sooncheon 30,00 0,0 serem submetidas à forte pressão de seleção, sob condições de laboratório (Amorim, 2007; Georghiou, 1992; Pei, 2002; Rodcharoen & Mulla, 1994) ou de campo (Mulla, 2003). Estes resultados apontam para a necessidade de racionalizar o uso do B. sphaericus, a fim de evitar a seleção de populações resistentes. A primeira população resistente obtida sob condições de laboratório, foi submetida à forte pressão de seleção e atingiu um nível de resistência da ordem de vezes, em relação à colônia susceptível (Georghiou, 1992). Em outro estudo realizado em laboratório, foram selecionadas duas colônias de Cx. quinquefasciatus, no Brasil e na China, que atingiram um alto nível de resistência (> ) (Pei, 2002). Também foi demonstrado que é possível selecionar a resistência ao B. sphaericus cepa IAB59, sob condições de laboratório, embora, esta seleção tenha ocorrido de forma mais lenta em relação ao B. sphaericus O nível de resistência chegou a mais de vezes (Amorim, 2007). Em campo, já foram detectadas populações com níveis de resistência variáveis na França (Chevillon, 2001), Índia (Rao, 1995), China (Yuan, 2000), Tunísia (Nielsen-Leroux, 2002) e na Tailândia (Mulla, 2003). O processo de seleção da resistência em populações de campo é modulado por diversos fatores que incluem o background genético da população, bem como fatores ecológicos e ambientais Controle integrado de vetores O conceito do Manejo Integrado de Vetores (MIV) surgiu como resultado de uma mudança de paradigma após o uso intensivo de inseticidas químicos nas décadas de Em outras palavras, o MIV é definido como uma combinação racional de diversos métodos de controle disponíveis, objetivando manter a população de vetores em níveis aceitáveis e da maneira mais efetiva, econômica e segura, incluindo componentes biológicos, químicos, físicos e ambientais, visando interferir o mínimo possível no ecossistema. No MIV, várias ações são empregadas na tentativa de englobar todas as causas do problema. No âmbito do controle de mosquitos, estas ações podem incluir a melhoria da rede de esgoto e distribuição de água, eliminação física de criadouros, uso de barreiras físicas nas habitações, medidas de proteção individual, uso de larvicidas específicos em criadouros que não podem ser eliminados, além da conscientização e participação da comunidade. Dentre estas ações, o uso de biolarvicidas apresenta vantagens, como a especificidade para o inseto alvo e segurança para o meio ambiente (Georghiou et al., 1992). O principal objetivo de estratégias de controle integrado de vetores é reduzir a densidade populacional de mosquitos para níveis em que a atividade é minimizada ou a transmissão de doenças reduzidas ou interrompida com o mínimo de efeitos ambientais. Idealmente, programas de controle integrado devem incluir intervenções mais eficazes e ambientalmente compatíveis. Devido à sua eficácia e aparente especificidade, tanto Bt israelensis quanto B. sphaericus podem ser ideais para o programa integrado de controle de pragas. (Lacey & Orr, 1994). A combinação de Bt israelensis com outros agentes de controle biológico resultou em um excelente controle e, em alguns casos, a supressão prolongada de larvas de mosquitos. Mulligan & Schaefer (1982) relataram um controle inicial de larvas de Cx. tarsalis em uma das zonas úmidas em que o tratamento com Bt israelensis foi seguido por abatimento em longo prazo com larvas de insetos predadores. Do mesmo modo, Mulla et al. (1993) observaram que as populações de Cx. quinquefasciatus, Cx. stigmatosoma e Cx. tarsalis não se recuperaram após o tratamento com Bt israelensis devido a subsequentes predações de larvas por macroinvertebrados aquáticos e uma redução na oviposição atrativa da pecuária local. Regis & Nielsen-Leroux (2000) revisando estratégias de manejo de resistência B. sphaericus recomendaram o acompanhamento da susceptibilidade das espécies-alvo de B. sphaericus antes e durante o tratamento, alternando o uso de B. sphaericus com Bt israelensis. Zahiri et al. (2004) demonstraram que utilizando suspensões de misturas contendo formulações comerciais de Bt israelensis e B. sphaericus, não resultou em resistência em colônias de Cx. quinquefasciatus, enquanto que somente suspensões de B. sphaericus gerou resistência. 1.2 B. thuringiensis no controle de baratas Segundo Wilson (1972), estudos comparativos realizados entre famílias primitivas de térmitas e baratas revelaram a existência de múltiplas características em comum que, segundo o autor, poderiam considerar os térmitas como baratas sociais, cujos diagramas de filogenia, não só reforçam este parentesco, como também, relacionam a evolução da flora microbiana intestinal entre as ordens Isoptera e Blattodea. Nesse contexto, a partir do trabalho de Castilhos-Fortes et al. (2002), Hübner (2004) testou cinco isolados de B. thuringiensis em Blatella germanica e Periplaneta americana: B. thuringiensis yunnanensis, B. thuringiensis colmeri, B. thuringiensis huazhangiensis, B. thuringiensis sooncheon e B. thuringiensis roskildiensis, oriundos do Instituto Pasteur, Paris. Para o estudo, adultos e ootecas de B. germanica e P. americana foram coletados em estabelecimentos comerciais e residenciais, no município de Gramado, Rio Grande do Sul. Ambas as espécies permaneceram em caixas de plástico (564 x 385 x 371 mm e 400 x 270 x 362 mm), com as bordas superiores preenchidas com uma mistura de água e talco neutro, para evitar a fuga dos insetos. A umidade foi mantida através de algodão umedecido, trocado a cada 48 horas. Substratos de papelão corrugado foram utilizados para mimetizar seu hábitat natural. Na alimentação foi utilizada 0,5 g de ração animal moída Whiskas, sendo os insetos mantidos em condições controladas (30ºC, 70% de U.R., 12h fotofase). Nos bioensaios, baratas adultas de ambas as espécies foram agrupadas em caixas plásticas (262 x 177 x 85 mm), contendo placas de Petri com algodão umedecido em água destilada e outra contendo 0,5g de ração animal moída e 1000µL das suspensões bacterianas a células/ml. Nas testemunhas, os isolados foram substituídos por água destilada esterilizada. Para cada isolado bacteriano e cada espécie foram utilizados 30 insetos. A mortalidade foi analisada durante 7 dias após a aplicação dos tratamentos e corrigida pela fórmula de Abbott (Alves, 1998). Os dados de patogenicidade, utilizando os cinco isolados de Bacillus thuringiensis, demonstraram uma baixa ação tóxica sobre B. germanica (6,65% a 30% de mortalidade), e uma inatividade (0% de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 45

46 mortalidade) à P. americana, levando-se em consideração que os índices de mortalidade corrigida apresentados na Tabela 1. Apesar de Wilson (1972) ter descrito um parentesco evolutivo entre as famílias primitivas de térmitas e baratas, inclusive quanto a sua flora bacteriana, o presente estudo demonstra que não há uma correlação da ação de B. thuringiensis sobre B. germanica e P. americana, pertencentes às famílias mais evoluídas. Cavados (2003) cita que o controle biológico com bactérias entomopatogênicas tem como principal vantagem a especificidade. Dependendo da composição de proteínas Cry no cristal bacteriano, os isolados podem apresentar um espectro de ação limitado às ordens de insetos (Fiuza, 2001). Assim, os dados obtidos sugerem que as delta-endotoxinas produzidas pelos cinco isolados de B. thuringiensis testados não apresentam proteínas Cry com ação tóxica para a ordem Blattodea, uma vez que causaram uma menor ação sobre os insetos-alvo do trabalho de Hübner (2004). Lambiase et al. (1996) mencionam uma diferenciação na localização dos sítios bacterianos em B. germanica e P. americana, o que poderia justificar o fato de ter-se obtido uma ação inseticida para a primeira espécie e uma ausência de efeito para a segunda. Também forma realizados ensaios de toxicidade in vivo para verificar a ação de B. thuringiensis oswaldocruzi (H-38) e B. thuringiensis brasiliensis (H-39) contra Periplaneta americana e Blatella germanica. Porém, nesses ensaios não houve ação patogênica das cepas avaliadas às duas espécies de baratas utilizadas nos bioensaios (Hübner, 2004). 1.3 Referências Amorim, L. B Development of Culex quinquefasciatus resistance to Bacillus sphaericus strain IAB59 needs long term selection pressure. Biol. Control, 42: Alves, S. B Controle Microbiano de Insetos. 2ed. Piracicaba. FEALQ. p Berrocal, L West Nile virus; ecology and epidemiology of an emerging pathogen in Colombia. Rev. Salud Publica, 8: ,. Castilhos-Fortes, R. De.; Matsumura, A. T. S.; Diehl, E.; Fiuza, L. M Susceptibility of Nasutitermes ehrhardti (Isoptera: Termitidae) to Bacillus thuringiensis subspecies. Braz. J. Microbiol. 33: Cavados, C.F.G Bactérias entomopatogênicas e controle de vetores, sua contribuição para a preservação ambiental. In: 8º Simpósio de Controle Biológico, São Pedro. Livro de Resumos. São Pedro, SP, p 45. Centers for Disease Control and Prevention West Nile Virus. Atlanta, Disponível em: <http://www.cdc.gov/niosh/topics/westnile/>. Acesso em: 8 mar Chevillon, C Resistance to Bacillus sphaericus in Culex pipiens (Diptera: Culicidae): interaction between recessive mutants and evolution in southern France. J.Med. Entomol, 38: Fiuza, L. M Bacillus thuringiensis: características e o potencial no manejo de insetos. Acta Biol. Leopoldensia 23 (2): Georghiou, G. P Characterisation of resistance of Culex quinquefasciatus to the insecticidal toxins of Bacillus sphaericus (strain 2362). In: Mosquito Control Research. Annals. 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48 Pesquisa INTERAÇÕES DE BACILLUS THURINGIENSIS E O CONTROLE DE FITOPATÓGENOS Neiva Knaak Bióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Aline Oliboni de Azambuja Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Andresa Patrícia Regert Lucho Engenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Diouneia Lisiane Berlitz Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Lidia Mariana Fiuza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD- Montpellier). s tratamentos fitossanitários constituem uma rotina nos cultivos agrícolas, os quais visam o controle de plantas daninhas, insetos e fitopatógenos. Como agentes do manejo integrado das culturas, os pesquisadores têm priorizado a aplicação de inimigos naturais (parasitóides e predadores), extratos vegetais e microrganismos. Nesse contexto, dados referentes às interações desses agentes de controle são apresentados, com ênfase nas bactérias entomopatogênicas da espécie B. thuringiensis. Considerando o controle biológico de fitopatógenos, a doença não é só a interação entre patógeno e hospedeiro, mas o resultado da interação entre patógeno, hospedeiro e uma série de microrganismos não patogênicos que também repousam no sítio de infecção. Esses agentes não patogênicos podem limitar ou aumentar a atividade do patógeno, ou a resistência do hospedeiro. O sucesso do biocontrole depende das propriedades antagonistas e dos mecanismos de ação do hiperparasita. Desse modo, nesse trabalho são apresentadas várias pesquisas que relatam o efeito antagônico de B. thuringiensis aos fungos fitopatogênicos. 1.1 Interações de métodos de controle de insetos O interesse por obter produtos agrícolas em sistemas sustentáveis estimula o estudo e o uso de estratégias do Manejo Integrado de Pragas (MIP) e do Manejo Ecológico de Pragas (MEP). Sendo assim, extratos vegetais apropriadamente selecionados e em concentrações adequadas podem ser usados em associação com entomopatógenos obtendo-se efeitos aditivos ou sinergéticos no controle (Saito & Luchini, 1998). Segundo os autores, o efeito estressor desses extratos sobre a praga pode determinar uma ação mais rápida do entomopatógeno e/ou um maior índice de mortalidade. Assim essa associação pode ser positiva ou benéfica quando o inseto-alvo tem mecanismos comportamentais de defesa contra entomopatógenos, quando as condições ambientais não são favoráveis ou as quantidades de inóculo necessárias são elevadas. Nesse sentido, Lucho (2004) estudou a interação entre B. thuringiensis aizawai e extrato de folhas de Melia azedarach (cinamomo) para o controle de lagartas de Spodoptera frugiperda, em laboratório. Na pesquisa foram avaliados quatro tratamentos: extrato de folhas de M. azedarach; B. thuringiensis aizawai; mistura de B. thuringiensis aizawai e extrato de M. azedarach; controle (água destilada) sendo a mortalidade das lagartas observada diariamente, até o sétimo dia após aplicação dos tratamentos (DAT). O uso de B. thuringiensis, isoladamente ou em associação com o extrato de M. azedarach mostrou-se letal no 1º DAT. Nas lagartas submetidas somente ao extrato, a mortalidade iniciou aos 2 DAT e ao final do bioensaio, a mortalidade acumulada foi maior na associação do biopesticida e do inseticida botânico. Os percentuais de mortalidade de S. frugiperda observados aos 7 DAT foram de 55, 70 e 90% para os tratamentos com extrato, B. thuringiensis aizawai e a associação de B. thuringiensis aizawai com extrato de M. aze- 48 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

49 Tabela 1. Aplicações simultâneas de entomopatógenos e extratos vegetias no controle de pragas de grãos armazenados (adaptada de Sabbour, 2003) Redução da CL 50 (%) Plantas Folhas de T. distichum Óleo volátil de T. distichum Óleo volátil de B. carterri Insetos Plodia interpeculata Ephesia cautella Ephesia küehniella Plodia interpeculata Ephesia cautella Ephesia küehniella Plodia interpeculata Ephesia cautella Ephesia küehniella B. thuringiensis B. bassiana darach, respectivamente. Assim, foi observado um efeito sinérgico dos ingredientes ativos de B. thuringiensis aizawai e extrato de M. azedarach contra S. frugiperda, pois o resultado da associação foi superior ao uso dos bioinseticidas isoladamente. Apesar disso, a interação de métodos de controle nem sempre apresenta o efeito desejado sobre o inseto. Isso foi demonstrado por Berlitz (2006) que utilizou B. thuringiensis simultaneamente com o cinamomo, M. azedarach. As concentrações utilizadas nesse trabalho não demonstraram eficiência, pois a mortalidade do lepidóptero S. frugiperda foi de, apenas 6% e para larvas do coleóptero Oryzophagus oryzae foi de 11%. Esse fato pode estar associado a um possível efeito inibitório da bactéria sobre o extrato vegetal ou vice-versa. Em relação ao uso simultâneo de bioinseticidas, Sabbour (2003) realizou ensaios com extrato das folhas e óleo volátil de Taxodium distichum (L. Rich) e Boswella carterri, em combinação com a bactéria B. thuringiensis e o fungo Beauveria bassiana (Vuillemin, 1912), em pragas de produtos armazenados. Em seus resultados a combinação dos entomopatógenos com as plantas, reduziu significativamente o valor da Concentração Letal Média (CL 50 ), conforme mostra a Tabela 1. De acordo com Novan, (1992) a utilização de extratos vegetais reduz a alimentação do inseto através de seus aleloquímicos, o que otimiza a atividade inseticida do microrganismo, resultando em um maior índice de mortalidade. Já os autores Zhang et al. (2000) utilizaram B. thuringiensis kurstaki em diferentes concentrações e suplementado com tripsina de soja mostrando uma inibição no crescimento larval de H. armigera (P<0,05). Em ensaios in vitro e in vivo, os autores comentam que a degradação das toxinas de B. thuringiensis pode ser inibida pela tripsina da soja. Os dados sugerem que o tempo de retenção das toxinas no intestino médio das larvas foi estendido, ocorrendo também um sinergismo entre os cristais inseticidas da bactéria e os inibidores de tripsina da soja. No caso do uso interativo de B. thuringiensis com nematóides entomopatogênicos, Koppenhöfer e Kaya (1997) utilizaram B. thuringiensis japonensis e nematóides em larvas de Cyclocephala hirta e C. pasadenae (Coleoptera: Scarabaeidae) mostrando que essa interação apresentou maior mortalidade que os tratamentos individuais, viabiliando assim o uso integrado desses organismos. B. thuringiensis também pode ser utilizado em combinação com outros microrganismos para o controle de insetos-praga. Nesse sentido, Broderick et al. (2000), identificaram um aumento de 35% da mortalidade do lepidóptero Lymantria dispar (L.) quando usado B. thuringiensis e zitermicina A de B. cereus, sendo que a zitermicina é responsável pelo efeito sinergético dos microrganismos. Primeiramente porque essa substância acumula-se em grandes quantidades nas culturas de B. cereus, segundo porque quando utilizada individualmente não causa efeito sobre o inseto, somente em combinação com B. thuringiensis, aumentando a mortalidade de L. dispar. Os resultados de Wraight & Ramos (2005) também demonstram sinergismo de 35,2; 33,8; e 21,1% quando utilizado simultaneamente um produto comercial a base de B. thuringiensis e do fungo B. bassiana em Leptinotarsa decemlineata. Esses autores revelam que a interação pode ter sido ocasionada pela intoxicação causada pelo entomopatógeno, inibindo a alimentação do inseto, ocasionando uma situação de estresse, e efeitos fisiológicos, o que facilitou a penetração do fungo no inseto. Efeitos semelhantes também foram observados por Ma et al. (2008), quando utilizada a proteína Cry 1Ac de B. thuringiensis com B. bassiana. Esses autores observaram efeitos deletérios na mortalidade das larvas de Ostrinia furnacalis (Lepidoptera: Crambidae), além de diminuição na formação de pupas e na emergência dos insetos adultos. Os autores Brousseau et al., (1998) também encontraram efeitos sinergéticos quando avaliada a combinação de B. thuringiensis kurstaki com destruxinas do fungo M. anisopliae para combater larvas de Choristoneura fumiferana (Clemens, 1865) (Lepidoptera: Tortricidae). Outra forma de controle integrado foi avaliada por Petry et al. (2004) utilizando B. thuringiensis e controle mecânico de espécies de Simulium, revelando 88,83% de índice reducional médio de larvas dos mosquitos. Já Andrade & Modolo (1991) testaram B. thuringiensis israelensis em mistura com o pesticida temephos contra A. aegypti causando 91 e 98% de mortalidade corrigida, diminuindo o tempo letal médio. O modo de ação das proteínas de B. thuringiensis israelensis foi avaliada por Gómez et al. (2007) demonstrando que a presença da proteína Cyt1Aa aumenta a capacidade de ligação, na membrana intestinal do inseto, da proteína Cry11A. Isso porque a proteína Cyt depois de solubilizada expõe regiões específicas na membrana, promovendo a ligação da proteína Cry e aumentando assim, sua atividade inseticida. Essas informações indicam que se torna cada vez mais importante as pesquisas nessa área, uma vez que a aplicação de inseticidas químicos resulta em grandes impactos nos agroecossistemas, pois atingem não somente os inimigos naturais dos insetos, mas também contaminam o solo e os lençóis de água subterrâneos. 1.2 Interações tri-tróficas Para um melhor entendimento dos agroecossistemas, é importante estudar as relações existentes entre as espécies e suas teias alimentares, que constituem um complexo de interações tróficas onde há interesse em interações tri-tróficas visando a utilização de patógenos, parasitóides e predadores, juntamente com a planta hospedeira/inseticida. Essas relações podem ser devidamente utilizadas nas práticas de manejo de insetos-praga, uma vez que se torna importante a preservação de inimigos naturais dos insetos, que são também os controladores das populações da praga. As interações tri-tróficas podem ser resultantes de dois efeitos: efeito direto da planta sobre a biologia e o comportamento do inimigo natural, devido às substâncias químicas ou caracteres morfológicos da planta; ou efeito da planta sobre a praga alterando seu comportamento, desenvolvimento, tamanho, o que afeta também seu inimigo natural. Essas interações são mais complexas quando há mais de uma espécie de inimigo natural envolvida. Nesse tipo de interação, Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 49

50 as plantas são importantes meios de comunicação, pois ao serem atacadas por um herbívoro, liberam substâncias voláteis pelas folhas, as quais orientam as fêmeas dos parasitóides a encontrarem as lagartas e depositar seus ovos. Sendo assim, os odores têm papel fundamental na organização dos indivíduos nos agroecossistemas (Vendramin, 2002; Vilela &Palini, 2002). As interações tri-tróficas podem ser exemplificadas nas culturas da soja e do milho. A cultura é atacada pela largarta-dasoja, A. gemmatalis que é combatida através da aplicação de vírus, o Baculovirus anticarsia, e predada por Geocoris sp. No caso do milho, as lagartas de S. frugiperda podem ser parasitadas por Trichogramma sp. e controladas através do entomopatógeno B. thuringiensis. De acordo com Ferry et al. (2004), os insetos são causadores de perdas mundiais entre 10 e 20% da produção agrícola. Com isso as pesquisas na área biotecnológica estudam diferentes formas de induzir a resistência de uma planta a seu predador. Apesar disso as técnicas convencionais de controle químico ainda são largamente utilizadas, sendo que o controle biológico encontra algumas resistências, principalmente devido aos elevados custos aos produtores agrícolas. Agrawal (2000) relata que as plantas podem ser atrativas ou benéficas a alguns inimigos naturais de herbívoros, mas também podem ser tóxicas ou prejudiciais a esses. Assim, as interações tri-tróficas podem identificar esses mecanismos de modo a poder manipulá-los, o que irá ampliar o controle e reduzir o uso de inseticidas. Os autores Ferry et al. (2004) identificaram diferentes estratégias de defesa das plantas a seus predadores. Dentre essas, pode-se citar mecanismos de defesa endógenos e moleculares, sinalização das plantas e a produção de substâncias voláteis. Em resposta, os insetos também desenvolveram estratégias de defesa a esses compostos, principalmente através da produção de proteinases e de mecanismos especiais de desintoxicação utilizando, por exemplo, citrocomo P450, monoxigenases e glutatione S-transferases. Entretanto, a complexidade química das plantas pode manipular seus fenótipos e, conseqüentemente de seus inimigos naturais (Wittstock e Gerhenzon, 2002). Venzon et al. (2001) relatam que, quando inserido uma quantidade de inimigos naturais ou removendo-se determinadas espécies de um agroecossistema, uma grande quantidade de interações indiretas pode ser esperada. Essas interações podem ser positivas ou negativas ao controle biológico, devendo-se dar importância aos níveis de interações entre as espécies. As interações tri-tróficas também podem ser exemplificadas através do trabalho de Dequech et al. (2005) que avaliaram lagartas de S. frugiperda parasitadas por Campoletis flavicincta e infectadas por B. thuringiensis aizawai. Em seus resultados o uso conjunto dos componentes biológicos citados, aumentou a mortalidade do inseto-praga e diminuiu seu consumo de alimento. Resultados semelhantes foram encontrados por Moraes et al. (2004) que identificaram a influência de silício em plantas de trigo, no pulgão-verde (Schizaphis graminum) e seus inimigos naturais. Os dados desses autores mostram que a aplicação de silício na cultura aumentou a resistência das plantas de trigo diminuindo a preferência alimentar do pulgão-verde, não afetando seus inimigos naturais. Através desses trabalhos nota-se a importância de novas pesquisas visando identificar relações tri-tróficas benéficas e eficientes que podem ser utilizadas junto às práticas de Manejo Integrado de Pragas. 1.3 Compatibilidade de produtos fitossanitários com Bacillus entomopatogênicos O controle biológico ocorre naturalmente no ambiente através da ação de inimigos naturais, mantendo em níveis relativamente baixos as populações de inúmeras pragas (Lacey et al. 2001). As bactérias Bacillus thuringiensis e B. sphaericus são entomopatógenos que desempenham o papel de agentes de controle microbiano de pragas de importância agrícola e vetores de agentes etiológicos de doenças humanas (De Maagd et al., 2003). Diante disso, a utilização e conservação desses microrganismos, dentro de agroecossistemas, é uma das estratégias utilizadas no Manejo integrado de Pragas, já que são encontradas naturalmente nesses ambientes. Assim, torna-se importante conhecer a ação dos produtos fitossanitários, determinando a sua seletividade e compatibilidade sobre os entomopatógenos, com o objetivo de minimizar os impactos tanto no ambiente quanto na microbiota residente (Batista-Filho et al., 2001). A excessiva aplicação de defensivos agrícolas vem ocasionando uma série de desequilíbrios ambientais, especialmente nas populações de entomopatogênos, verificadas atráves da inibição do crescimento, esporulação, mutações genéticas, redução da toxicidade a determinada praga, influenciando diretamente no estabelecimento e sobrevivência (Alves et al., 1998). No entanto, a ação dos agroquímicos sobre os microrganismos pode variar em função da espécie e linhagem do microrganismo, como também da formulação química e dosagens dos produtos (Batista-Filho et al., 2001). Contudo, alguns produtos apresentam seletividade aos entomopatógenos, podendo potencializar o seu efeito e contribuir para o controle do inseto-alvo (Benz, 1971; Chen et al., 1974). Assim, a associação de inseticidas químicos e biológicos contribuem para minimizar os efeitos negativos sobre os agroecossistemas (Chen et al., 1974; Batista-Filho et al., 2001). Grande parte das reações dos pesticidas, atualmente utilizadas no controle de pragas, é desconhecida devido à carência de informações a respeito da compatibilidade desses produtos sobre entomopatógenos (Morris, 1977). Para B. thuringiensis, majoritariamente os trabalhos realizados sobre interação são proveniente da década de 70, como reflexo da demasiada aplicação de inseticidas sintéticos orgânicos como hidrocarbonetos clorinados, oganofosforados, metilcarbamatos e piretróides (Casida e Quistad, 1998). Para B. sphaericus, quase a totalidade dos trabalhos se referem à toxicidade às larvas de dípteros, ressaltando a importância de estudos que visam à proteção desse inimigo natural, através da compatibilidade com os pesticidas químicos. Ainda na década de 70, Doughert et al. (1971) obtiveram respostas variadas na sensibilidade de B. thuringiensis thuringiensis em função dos diversos solventes utilizados para os mesmos pesticidas. A presença de emulsificantes e outros aditivos concentrados, utilizados nas preparações, podem gerar problemas de compatibilidade com entomopatógenos devendo ser considerado na elaboração de novas formulações comerciais (Morris, 1977). O mesmo autor testou a compatibilidade de 27 pesticidas sobre a germinação e replicação de B. thuringiensis kurstaki, concluindo que o grupo dos carbamatos foram os mais compatíveis, as piretrinas altamente bacteriostáticas e os produtos acefato, triclorfon, metomil, carbaril, mexacarbato e PH (derivado da uréia) podem ser utilizados em conjunto com a bactéria. Os trabalhos mais atuais nessa linha de pesquisa avaliaram o efeito de diferentes concentrações de defensivos agrícolas sobre microrganismos entomopatogênicos. Especialmente para B. thuringiensis, os dados mostram que tiametoxam, carbosulfan, diafentiuron, imidacloprid, acefato, utilizados nas concentrações máximas, não apresentaram diferença significativa nas unidades formadoras da colônia - UFC (Batista-Filho et al., 2001; Batista-Filho et al., 2003; Almeida et al., 2003). Por outro lado, essas pesquisas revelam que endosulfan, monocrotofós, deltametrina e ciproconazole + tiametoxam inibiram a formação das colônias. Já, na concentração mínima, o diafentiuron foi sinérgico e o tiametoxam e ciproconazole + tiametoxam não afetaram B. thuringiensis. Utilizando ambas as concentrações, o endosulfan, deltametrina e profenofós + lufenuron inibiram as colônias da bactéria e tiametoxam + cipermetrina foram compatíveis. Há poucas pesquisas que avaliam a compatibilidade de bactérias entomopatogênicas com os pesticidas mais utilizados em diversas culturas, como por exemplo, o arroz irrigado. No caso, Azambuja (2006) testou seis produtos fitossanitários, comumente utilizados na orizicultura irrigada, sobre as bactérias B. thuringiensis e B. sphaericus, em condições laboratoriais e observou que os herbicidas glifosato e propanil foram significativa- 50 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

51 mente antagônicos ao desenvolvimento de B. thuringiensis, e os mesmos produtos, incluindo o fungicida azoxistrobina, reduziram o crescimento de B. sphaericus, afetando esse microrganismo com mais intensidade. Entretanto, relatou uma provável compatibilidade dos herbicidas quincloraque e pirazosulfuronetil e o inseticida fipronil para ambos entomopatógenos naturais do solo, propondo a sua utilização em Programas de MIP. Complementando os dados anteriores, Batista-Filho et al. (2001) verificaram que o inseticida fipronil apresentou um efeito sinérgico aumentando a UFC de B. thuringiensis (Dipel ) quando utilizado na concentração mínima, mas não teve influência quando utilizado na concentração máxima. Entretanto, Rohr (2005) mostrou que azoxistrobina, quincloraque e fipronil não apresentaram interações significativas sobre os bioinseticida de B. thuringiensis kurstaki (Dipel ) e B. thuringiensis aizawai (Xentari ). Os dados dos ensaios realizados in vitro expõem ao máximo os microrganismos a ação dos produtos fitossanitários, podendo diferir das condições de campo, onde outros fatores interferem, diminuindo a intensidade das reações. Nesse sentido, Alves et al. (1998) salientam que a seletividade de um produto testado in vitro pode ser confirmado em campo, mas o antagonismo apresentado em laboratório nem sempre pode ser verificado no campo. Os dados referentes às interações entre entomopatógenos e pesticidas em condições de campo são ainda mais reduzidos (Alves et al., 1998). Nesse enfoque, Azambuja (2006), em laboratório, concluiu que os agroquímicos: fipronil, azoxistrobina, quincloraque, glifosato, propanil e pirazosulfuron-etil não interferiram na abundância de B. thuringiensis nem de B. sphaericus. Ressaltando esse padrão, Batista-Filho et al. (2001) estudaram a compatibilidade do tiametoxam e B. thuringiensis (Dipel ), aplicados em lavouras de feijão, revelando que o inseticida não interferiu no potencial de inóculo do entomopatógeno, assim como in vitro, recomendando a utilização do produto em conjunto com a bactéria. Conforme foi verificado, no ambiente natural, os diversos fatores bióticos e abióticos atuam minimizando os possíveis impactos sobre os Bacillus spp. da ação direta dos produtos fitossanitários (Alves et al., 1998). Em outro trabalho, Das et al. (2003) verificaram a influência de dois inseticidas em diversos microrganismos presentes nos solos de cultivo de arroz. Esses autores mencionam que forato e carborufam estimularam o crescimento das populações de bactérias e as proporções de Bacillus sp. No entanto, o efeito sinérgico de carbofuram foi mais pronunciado. Esse fato está relacionado à capacidade de alguns microrganismos desse gênero utilizarem o inseticida e degradarem seus produtos para o seu próprio desenvolvimento no solo. Como já mencionado, na literatura a respeito de interações de microrganismos entomopatogênicos e agroquímicos, em condições de campo, é muito restrita e quase a totalidade dos trabalhos realizados dessa natureza se referem aos fungos entomopatogênicos avaliados in vitro. A falta de padronização na realização dos testes é um dos problemas desse tipo de estudo que, em muitos casos, não permite uma comparação efetiva entre os produtos (Alves et al., 1998). Diante disso, os microrganismos entomopatogênicos que habitam naturalmente os agroecossistemas devem ser preservados através de técnicas culturais e principalmente na utilização de pesticidas compatíveis não comprometendo o MIP (Almeida et al., 2003). 1.4 Controle microbiano de Fitopatógenos Fungos Fitopatogênicos: Os fungos constituem um grupo de organismos que se caracteriza por nunca apresentarem tecido verdadeiro, por serem eucarióticos e aclorofilados. A maioria das espécies fúngicas é saprofítica, mas algumas desenvolveram a capacidade de parasitar plantas, causando a morte ou um retardamento do desenvolvimento do hospedeiro. Devido aos sistemas intensivos de produção agrícola, o índice e a prevalência de doenças têm aumentado significativamente, podendo, em alguns casos, causar perda total da produção. Esse aumento de doenças em áreas agrícolas se deve principalmente ao desequilíbrio entre as diferentes populações microbianas do solo, do rizoplano, do fitoplano e endofíticas que interagem com plantas, permitindo o estabelecimento e o desenvolvimento dos fungos patogênicos (Esposito & Azevedo, 2004). Os autores relatam que para o fungo patogênico colonizar a planta hospedeira, inicialmente ele precisa quebrar o seu sistema de defesa. Para isso, produz enzimas hidrolíticas (cutinases, celulases, ligninases e outras) que quebram a cutícula e a parede da celular hospedeira; toxinas que reduzem ou inibem completamente a atividade das células da planta a ser parasitada e/ou produzem substâncias específicas de plantas (hormônios) que quebram o equilíbrio fisiológico da célula vegetal, causando distúrbios no crescimento e na diferenciação das células da planta (Esposito e Azevedo, 2004). Em geral, os fungos patogênicos apresentam três estágios de colonização da planta hospedeira. Esses estágios são caracterizados pela germinação do esporo na superfície dos tecidos da planta hospedeira, pelo reconhecimento da superfície, pela formação de apressório e pela penetração nos tecidos vegetais. Estando no interior da planta, o fungo pode colonizar os espaços intercelulares e/ou intracelulares de forma parasítica e, posteriormente, produzir estruturas reprodutivas que permitam a sua disseminação (Esposito e Azevedo, 2004) Efeitos de B. thuringiensis em fitopatógenos: Alguns microrganismos, como bactérias, fungos e actinomicetos, produzem metabólitos capazes de inibir o crescimento de outros microrganismos. Estas substâncias são diferentes na sua estrutura e distribuição, se restringindo aos poucos compostos e estando presentes em apenas alguns microrganismos (Kennedy, 1999). Os produtos do metabolismo secundário microbiano são alvos de pesquisas cada vez mais intensas na busca de substâncias bioativas, para atuação em diversas áreas como a agricultura, veterinária e farmácia (Woodruff, 1980). Grande parte dos microrganismos envolvidos no controle biológico atua através de antibiose, onde ocorre a interação entre organismos, um metabólito produzido por um deles tem um efeito prejudicial sobre o outro. A produção de metabólitos pode resultar na completa lise e dissolução da estrutura celular e independe do contato físico entre os microrganismos (Bettiol & Ghini, 1995), dessa forma, a busca por microrganismos antagônicos a fungos fitopatogênicos tem aumentado (Benitez et al., 2004). Diversas espécies de Bacillus são citadas como produtoras de antibióticos, podendo secretar metabólitos comercialmente importantes, como enzimas aminolíticas e enzimas proteolíticas (Bettiol & Ghini, 1995). Bettiol (1988), em trabalho de seleção de microrganismo antagônico a Pyricularia oryzae, verificou que B. subtilis foi o mais eficiente em inibir o crescimento micelial do patógeno, e constatando também que o antagonista apresenta boas características para uso como agente de controle biológico, pois, além de rápido desenvolvimento, tanto em meio de cultura como na natureza, produzem endósporo e antibióticos, crescem em larga faixa de temperatura e adaptam-se a várias condições ambientais. O processo para que ocorra o antagonismo exige a degradação da parede celular fúngica por hidrolases secretada por microrganismos. Como quitina e beta-1,3-glucana são os principais componentes estruturais da parede celular fúngica, quitinases e glucanases podem ser importantes no controle biológico desses microrganismos (Kulminskaya et al., 2001). Knaak et al. (2007) testaram as cepas e proteínas Cry1Ab e Cry1Ac sintetizadas por Bacillus thuringiensis thuringiensis 407 (ph 408) e B. thuringiensis kurstaki HD- 73, respectivamente, sobre os fungos fitopatogênicos Pyricularia grisea, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum e F. solani. Verificaram que as cepas B. thuringiensis, que sintetizam as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac, reduziram o crescimento micelial dos fungos R. solani, P. grisea, F. oxysporum e F. solani durante o período avaliado, quando comparado aos controles. As duas cepas inibiram o crescimento dos fitopatógenos testados até sete dias após a incubação, onde houve diferença significativa (P<0,05) entre os trata- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 51

52 mentos bacterianos e os grupos controle. Na avaliação da ação das proteínas Cry1Ab e Cry1Ac, sobre R. solani, P. grisea, F. oxysporum e F. solani, não foi observada a formação do halo de inibição de crescimento. Nos resultados obtidos para germinação dos conídios também não houve diferença significativa (P<0,05) entre o controle e os tratamentos com as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac sobre os fungos citados anteriormente. Batista-Junior et al. (2002) testaram duas cepas: B. thuringiensis kurstaki HD1, produtor do cristal com atividade inseticida e B. thuringiensis 407, mutante não produtor do cristal protéico, contra os fitopatógenos F. solani, F. oxysporum e Colletotrichum sp., concluindo que a ausência dos genes produtores do cristal protéico não interferiram no poder de degradação do micélio pelos isolados de B. thuringiensis estudados. O efeito inibitório das cepas de B. thuringiensis nas estirpes dos fungos fitopatogênicos pode estar relacionado com a produção de enzimas que podem ter ação contra a parede celular fúngica, já que algumas bactérias antagonistas de fungos fitopatogênicos produzem quitinases (Asaka e Shoda, 1996; Mavingui e Heulin, 1994). Nesse contexto, Barboza-Corona et al. (1999) selecionaram e caracterizaram enzimas (quitinases) de B. thuringiensis nativos do México, concluindo que a ação sinérgica entre quitinases e proteínas Cry podem ser aplicadas no controle biológico de fitopatógenos. Diferentes tipos de fungos e bactérias produzem uma grande variedade de enzimas degradantes (Mauch et al., 1988). Sendo assim, B. thuringiensis é uma bactéria que secreta quitinases em meios de cultura quando cultivada em meio com sais e quitina (Barboza-Corona et al., 2003). Alguns estudos sugerem que as quitinases de B. thuringiensis possuem potencial biotecnológico contra fungos fitopatogênicos (Escudero-Abarca et al., 2001; Reyes-Ramírez et al., 2004). La Vega et al. (2006) testaram à enzima quitinase, purificada de B. thuringiensis aizawai, a qual produz 66 kda quitinase extracelular, nos fungos Fusarium sp. e S. rolfsii. Os fitopatógenos foram incubados com a enzima purificada por 120h, demonstrando que os valores de inibição do crescimento de S. rolfsii e Fusarium sp. foram superiores e estatisticamente diferentes do controle (11 e 24%, respectivamente). Os mesmos autores não encontraram diferenças significativas no crescimento com a enzima purificada, em comparação com o extrato bruto enzimático. Melent ev et al. (2001) testaram o extrato bruto e purificado de quitinase de Bacillus sp. e descobriram que a enzima purificada perdeu a sua capacidade de inibir o crescimento de Fusarium oxysporum e Helminthosporium sativum. No entanto, há relatos de que algumas cepas bacterianas apresentam uma relação direta entre as suas habilidades para reprimir o crescimento de fungos fitopatogênicos e para produzir quitinases (Inbar e Chet, 1991). Resmuska e Pria (2007) avaliaram o efeito dos agentes antagonistas B. thuringiensis e Trichoderma sp. no crescimento micelial, sobre os fungos fitopatogênicos: Sclerotium rolfsii, Diaporthe phaseolorum, Pythium aphanidermatum., Monilinia fructicola, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solani. Verificaram que a bactéria B. thuringiensis mostrou-se eficiente no controle de M. fructicola, S. sclerotiorum, F. solani. e S. rolfsii, impedindo que o fungo S. sclerotiorum formasse escleródios. O fungo Trichoderma sp., exerceu efeito no crescimento micelial do fungo S. rolfsii. B. thuringiensis mostrou-se mais eficiente que Trichoderma sp. no controle biológico dos fitopatógenos D. phaseolorum, P. aphanidermatum, M. fructicola, S. sclerotiorum, R. solani e F. solani. 1.5 Referências Agrawal, A.A Mecanisms, ecological consequences and agricultural implications os tri-trophic interactions. Current Opinion in Plant Biology 3: Almeida, J.E.M.; Batista-Filho, A.; Lamas, C.; Leite, L.G.; Trama, M.; Sana, A.H Avaliação da compatibilidade de defensivos agrícolas na conservação de microrganismos entomopatogênicos no manejo de pragas do cafeeiro. Arquivos do Instituto Biológico, 70: Alves, S.B.; Moino, A.J.; Almeida, J.E.M Produtos fitossanitários e entomopatógenos. In: Alves, S.B. (ed.), Controle microbiano de insetos. São Paulo, FEALQ, p Andrade, C.F.S.; Modolo, M Susceptibility of Aedes aegypti larvae to temephos and Bacillus thuringiensis var israelensis in integrated control. Revista de Saúde Pública 25(3): Azambuja, A. 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54 Pesquisa TOXICIDADE DE BACILLUS THURINGIENSIS EM ORGANISMOS NÃO-ALVO Andresa Patrícia Regert Lucho Engenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). Diouneia Lisiane Berlitz Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). entomopatógeno B. thuringiensis tem elevada especificidade, porém para uma utilização segura são necessários ensaios toxicológicos com diferentes organismos não-alvo, sendo nesse trabalho apresentados dados referentes à toxicidade aos inimigos naturais, especialmente aos parasitóides e predadores de insetos, assim como às aves e aos mamíferos. 1.1 Efeitos de B. thuringiensis sobre predadores e parasitóides Emerson Luiz Nunes Costa Engenheiro Agrônomo (UFRGS) e Mestre e Doutor em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS) Lidia Mariana Fiuza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). Os inimigos naturais dos insetos são de suma importância, pois, além de desenvolverem seu papel ecológico de predação ou parasitismo, podem ser associados aos métodos alternativos de controle de pragas-alvo, através de criação massal em laboratórios (Gallo et al., 2002). O uso de inseticidas pode causar danos diretos e indiretos ao controle biológico natural, ao causar a mortalidade de insetos benéficos ou reduzir sua fonte alimentar pela mortalidade de insetos-praga (Shepard et al., 1987; Wick & Freier, 2000; Berti Filho & Ciociola, 2002). Por isso, o uso de bioinseticidas que controlam as pragas com baixo impacto sobre organismos benéficos deve ser incentivado (Fragoso et al., 2001; Degrande et al., 2002). Nesse sentido, Dequech et al. (2005) estudaram a interação entre o parasitóide Campoletis flavicincta e B. thuringiensis aizawai em lagartas de Spodoptera frugiperda em condições de laboratório. Os autores avaliaram o consumo alimentar e a mortalidade de lagartas parasitadas, infectadas pela bactéria, e parasitadas e infectadas, além da biologia dos parasitóides emergidos a partir de lagartas infectadas e não infectadas pela bactéria. O menor consumo foliar e a maior taxa de mortalidade foram observados em lagartas afetadas pelos dois agentes de controle biológico. No caso do parasitóide, não foram verificadas alterações nas características biológicas dos seus descendentes emergidos de lagartas infectadas com B. thuringiensis. Segundo Stevenson & Walters (1983), embora a toxicidade de inseticidas possa ser avaliada em condições de laboratório, só é possível medir o efeito real do pesticida em condições de campo, onde ocorrem as situações naturais de abrigo, proteção, alternativas de escape, alimentação e sobrevivência das espécies. Esses autores também destacam que as condições meteorológicas, o comportamento e o ciclo de vida de cada espécie e a dose aplicada são fatores que influenciam a toxicidade dos inseticidas. Lucho (2004) avaliou a emergência de parasitóides em lagartas de S. frugiperda recapturadas em arroz irrigado com e sem tratamento de B. thuringiensis aizawai em condições de telado e a campo. A emergência de parasitóides das famílias Braconidae, Ichneumonidae e Tachinidae ocorreu em lagartas recapturadas em plantas não tratadas, mantidas em condições de telado. Das lagartas coletadas em áreas tratadas com o bioinseticida, tanto em telado quanto a campo, não foi observada emergência de parasitóides. Já Costa (2007), durante dois anos agrícolas, avaliou o efeito de inseticidas sobre os inimigos naturais de insetos-praga, por meio da quantificação de grupos taxonômicos de inimigos naturais presentes antes e após a aplicação de produtos químicos e biológicos em lavoura de arroz irrigado. Nesse estudo foram avaliados seis tratamentos (quatro inseticidas químicos sintéticos, um inseticida à base de B. thuringiensis aizawai e testemunha sem inseticidas) e cinco épocas de amostragem realizadas com rede de varredura do florescimento ao enchimento de grãos (prévia e aos 2, 7, 14 e 21 dias após a aplicação dos tratamentos - DAT). Entre os inimigos naturais coletados foram considerados oito subgrupos: aranhas, micro-himenópteros, coleópteros, odonatos, dermápteros, neurópteros, dípteros e hemípteros. No primeiro ano do estudo não foram observados efeitos significativos dos inseticidas sobre os inimigos naturais. No segundo ano, o inseticida lambdacialotrina reduziu o total de inimigos naturais coletados aos 2DAT. O número de 54 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

55 Figura 1. Mortalidade de camundongos CF1 submetidos aos tratamentos intraperitoneais com Bacillus thuringiensis, ( Susp. = suspensão contendo células e esporos; Sob. = sobrenadante da cultura; Prot. = proteína purificada; Test. = testemunha tratada somente com água; Número total de indivíduos = 15 por tratamento) coleópteros predadores, representados em sua maioria por Coccinellidade ( joaninhas ), foi reduzido significativamente aos 2DAT por lambdacialotrina, carbaril, malationa e imidacloprido. Nos dois anos do estudo não foi observado efeito significativo de B. thuringiensis sobre o número de inimigos naturais coletados após a aplicação do bioinseticida. Em outra pesquisa, Nascimento et al. (1998) avaliaram o efeito de B. thuringiensis kurstaki sobre o predador de lagartas de lepidópteros, Podisus nigrispinus, em laboratório. Em seus resultados, não foi observada a presença de esporos ou células vegetativas do entomopatógeno na hemolinfa do predador, apenas no intestino médio e nas fezes. Os autores relatam que, em laboratório, são utilizadas altas dosagens de biopesticida e oferecido apenas uma alternativa alimentar e que, em campo, o predador tem alternativas de alimentação, não dependendo somente de uma presa infectada. Além dos produtos formulados a base de B. thuringiensis, atualmente as pesquisas na área biotecnológica visam a transformação genética de plantas com os genes cry de B. thuringiensis para conferir a resistência dessas plantas aos insetos-praga. Plantas de milho, algodão e batata transgênicos têm sido comercializados (Shelton et al. 2002), porém, os dados de O Callaghan et al. (2005) revelam que não foram detectados efeitos dessas plantas em insetos benéficos, como polinizadores e inimigos naturais. Nesse contexto, Romeis et al. (2008) relatam que dados como a descrição da cultivar, as características moleculares dos elementos genéticos inseridos na planta, a natureza e a estabilidade da expressão protéica, o espectro de ação das proteínas, a composição de macro e micronutrientes e as características morfológicas e agronômicas da planta, são exigidos pelas autoridades para a regulamentação dessas plantas. Os autores mostram que o milho modificado com o gene expressando a proteína Cry 1Ab de B. thurigniensis, ativa a insetos da ordem Lepidoptera, não afeta insetos de outras ordens. Ou seja, as proteínas de B. thuringiensis são altamente específicas, não atingindo artrópodes não alvos. Na revisão de Fontes et al.(2002) são discutidos princípios e questões ecológicas, impacto ambiental e efeitos de plantas geneticamente modificadas no ambiente. Em relação aos inimigos naturais, os autores relatam a existência de fatores importantes em relação às plantas, como o ciclo de vida (anual ou perene) que difere na composição das comunidades de artrópodes associados a essas plantas. Dos 41 trabalhos avaliados pelos autores, 20 foram conduzidos em laboratório e desses, 14 não mostraram efeito sobre inimigos naturais, quando utilizadas plantas modificadas e não modificadas. No restante (6 trabalhos) não foram observados efeitos em alguns inimigos naturais. E em 14 de 21 trabalhos avaliados em campo, os autores não mostraram diferença na densidade de inimigos naturais entre áreas com plantas-bt e plantas não transgênicas. Porém, nos 7 casos restantes ocorreu um decréscimo nessa densidade. No trabalho de Chen et al. (2008) foram avaliados os efeitos diretos e indiretos da proteína Cry1Ac de B. thuringiensis que está presente em plantas transgênicas de milho e algodão, sobre o parasitóide da lagarta Plutella xilostella, Diadegma insulare. Os autores utilizaram a planta transgênica e a proteína proveniente de uma formulação líquida comercial (MC), em três tratamentos: a proteína purificada, o produto comercial e a planta transgênica. Também avaliaram o efeito de inseticidas a base de spinosad, indoxacarb, lambda-cialotrina e cipermetrina. Em seus resultados, observaram que, mais de 90% das lagartas foram parasitadas após a ingestão dos tratamentos, indicando que esses não influenciam o parasitismo. Porém, o número de D. insulare emergidos das lagartas, diferiu entre o controle e o grupo tratado com a formulação comercial, mas não diferiu entre o controle e as lagartas tratadas com a planta expressando a proteína Cry 1Ac ou somente com a proteína purificada. Os autores citados também demonstraram que o parasitóide D. isulare foi altamente suscetível aos inseticidas comumente utilizados para o controle das lagartas de P. xylostella, ocorrendo a morte dos mesmos após duas horas de contato. Sendo assim, os inseticidas usados afetam as populações do parasitóide e, conseqüentemente aumentam as populações do inseto praga-alvo, no caso, P. xylostella. Estudo semelhante foi realizado por Torres & Ruberson (2008) com a mesma proteína expressa em plantas de algodão. Os resultados desse estudo mostraram que a proteína foi detectada em três níveis tróficos avaliados, porém, os insetos predadores e parasitas das lagartas de S. exigua não foram afetados quando as lagartas forma alimentadas com algodão transgênico. Um caso bem polêmico entre a comunidade científica, foi o trabalho de Losley et al. (1999) que mostrou que o milho geneticamente modificado com a proteína Cry1Ab de B. thuringiensis, afetou severamente a população da borboleta monarca, Danaus plexippus. Em seu trabalho foi comparado a alimentação, o crescimento e a mortalidade de lagartas que se alimentavam de plantas com pólen Bt, com pólen de milho não modificado e plantas sem pólen. O resultado apresentou sobrevivência de 56% com milho-bt e 100% de sobrevivência com pólen normal e sem pólen. Entretanto novas pesquisas foram realizadas posteriormente como Stanley-Horn, et al. (2001) que avaliou 6 híbridos de B. thuringiensis em quatro cidades diferentes (EUA) divididos em duas etapas (na borda e na parte interna das lavouras) frente à D. plexippus. As conclusões dos auto- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 55

56 res fornecem evidências de que a quantidade de pólen e a expressão de Cry1Ab no pólen predizem um impacto na alimentação das lagartas da monarca, porém isso ocorre em lagartas do 1º instar, sendo que não ocorrem diferenças significativas da sobrevivência da monarca nas regiões com milho-bt e milho não transgênico. Além disso, os autores identificaram a mortalidade de lagartas poucas horas após a alimentação em áreas com milho não transgênico pulverizados com λ-cialotrina. A sobrevivência e o crescimento foram afetados também em áreas próximas ao local. Entretanto pesquisas devem continuar sendo realizadas para entender o impacto do milho não transgênico sendo que é relativamente de baixa toxicidade a borboletas monarca. Apesar desses dados o conhecimento a respeito da influência de novas tecnologias seja para a produção de biopesticidas ou para a transgenia, ainda são carentes de informação. Entretanto, os estudos realizados até então indicam que efeitos nocivos em organismos não-alvo verificados em laboratório são raramente detectados no ambiente, provavelmente porque a quantidade de produto utilizada em laboratório é superior àquela utilizada e recomendada em campo. 1.2 Efeitos de B. thuringiensis sobre aves Um grupo de predadores de lagartas, os pássaros, também deve ser avaliado em relação ao uso de biopesticidas ou plantas geneticamente modificadas. Porém existem poucos dados na literatura a respeito desse assunto. Os autores Sopuck et al. (2002) relatam a utilização do produto comercial Foray 48B a base de B. thuringiensis. kurstaki, para o controle de Lymantria dispar e avaliaram a resposta de pássaros associados ao sul da Ilha de Vancouver, no Canadá. Em seus resultados não observaram diferença na abundância relativa de pássaros nas áreas tratadas e não tratadas com o biopesticida, entre os anos de 1999 e 2000, indicando que o tratamento não influencia na presença dos mesmos. Já Norton et al. (2001) avaliaram o efeito secundário da mesma subespécie de B. thuringiensis citada acima porém proveniente do produto Thuricide, em aves da espécie Dendragapus canadensis. Os autores citam essa ave como um herbívoro primário, porém os pintos, em suas primeiras duas semanas de vida, são essencialmente insetívoros. Lattner (1982) descreve a alimentação dessa ave como sendo cerca de 64% de lagartas, seguido de gafanhotos (10%), formigas (7%) e outras variedades de invertebrados e partes de plantas. O trabalho de Norton et al. (2001) teve como objetivo avaliar os itens da dieta e o crescimento de D. canadensis em áreas tratadas e não tratadas com B. thuringiensis kurstaki. Os resultados indicam que o crescimento dos pintos foi afetado em relação às duas áreas, ocorrendo uma redução de 30% no tamanho desses na área tratada com a bactéria. Porém esses dados podem estar relacionado ao fato de que, com a morte das lagartas devido à ingestão do patógeno, os pintos passaram a se alimentar principalmente de formigas e estas tem um baixo índice de proteínas em comparação com às lagartas. Isso pode ser determinante para o decréscimo no tamanho dos pintos, uma vez que a dieta alimentar teve seu teor de proteínas também reduzido. 1.3 Efeitos de B. thuringiensis sobre mamíferos Pequenos mamíferos, como ratos e camundongos, também estão associados às áreas agrícolas uma vez que esses animais podem se alimentar dos grãos das culturas. Então também existem pesquisas que avaliam o possível efeito do entomopatógeno nesses mamíferos, sendo que a bactéria também pode produzir toxinas ativas a esses animais. Na área da saúde, os trabalhos de Prasad & Shethna (1975) sugerem que as proteínas de B. thuringiensis têm atividade antitumoral em sarcoma Yoshida em ratos, além de acentuarem a resposta imune de ovelhas. Yamashita et al. (2000), também demonstram efeito citocida em células de leucemia, em ensaios in vitro. Em relação a humanos, a revisão de Siegel (2001) apresenta dados em que o produto Thuricide (B. thuringiensis thuringiensis) foi ingerido (100mg) e inalado (100mg) por 18 pessoas, durante 5 dias, e esses não apresentaram nenhuma reação decorrente do microrganismo. Além dessa reportagem, o trabalho apresenta alguns dados sobre isolados de B. thuringiensis que foram re-isolados de queimaduras ou feridas de pessoas, entretanto foi averiguado que a água utilizada para a limpeza desses ferimentos estava contaminada. Além disso, o autor relata que o isolado pode se desenvolver nesses locais feridos quando o sistema imune não está respondendo de forma adequada ao ferimento, mas não causa nenhuma reação. Betz et al. (2000) relatam que B. thuringiensis kurstaki foi administrado em humanos voluntários durante 3 dias, na quantidade de 1000mg/pessoa ou 1x10 10 esporos/ml, e não apresentaram sintomas de toxicidade, nem culturas de células bacterianas nas amostras de sangue avaliadas. Os autores relatam a presença das proteínas Cry 1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry 2Aa no isolado testado. Diferentes autores relatam os resultados de suas pesquisas com ratos tratados com B. thuringiensis. No caso de Bishop et al. (1999), a aplicação oral de esporos/ dia de B. thuringiensis thuringiensis e B. thuringiensis israelensis, em ratos não mostrou diferença significativa no peso corporal dos animais tratados e não tratados. Nos dados de Siegel (2001), ratos foram tratados via oral com 10 9 esporos/dia, por 730 dias, também não apresentaram nenhuma reação. Também em ensaios toxicológicos, Berlitz et al. (2006) avaliaram o efeito da suspensão de células e esporos de B. thuringiensis aizawai proveniente do produto comercial Xentari e B. thuringiensis thuringiensis (H1), em ratos Wistar. Os autores avaliaram o conteúdo estomacal e as fezes em SDS-PAGE, onde os resultados sugerem que as proteínas são degradadas no estômago dos animais. Os estômagos foram avaliados em estereomicroscópio (40x) não apresentando modificações superficiais, como pipocas vermelhas ou raias hemorrágicas, em relação ao grupo controle. Os autores concluíram que as proteínas de B. thuringiensis não afetam os ratos quando administradas oralmente. Em outra pesquisa, Berlitz (2006) avaliou a suspensão e as proteínas purificadas de dois novos isolados bacterianos, em camundongos CF1, via oral e intraperitoneal, divididos em grupos de 5 animais e três repetições. Os dados dos tratamentos, via oral, não causaram mortalidade dos camundongos, porém nas administrações intraperitoneais os camundongos morreram a partir de 6horas após a aplicação dos tratamentos, quando aplicada a suspensão bacteriana contendo células e esporos (Figura 1). Apesar desses resultados, deve-se salientar que injeções intraperitoneais não são uma via de acesso natural do entomopatógeno nos mamíferos. Essa mortalidade também não deve estar associada à thuringiensina, uma proteína tóxica a vertebrados que é produzida pelo entomopatógeno, pois essa toxina está presente no sobrenadante da cultura, e esse tratamento não causou a mortalidade dos animais. O tratamento via oral, não causou reações nos camundongos. Nesse sentido, Betz et al. (2000) revelam que as proteínas Cry1, Cry2 e Cry3 são degradadas em 30 segundos após a ingestão, em ensaios in vitro, resultando em proteínas de 2 kda. Também, os dados de Vasquez-Padrón et al. (2000) e Moreno-Fierros et al. (2000) revelaram que camundongos Balb/c apresentaram elevada produção de anticorpos IgA, seguidos de IgG e IgM, após a administração oral, retal e intraperitoneal da proteína Cry1Ac, mostrando uma eficiente resposta imune desses animais. Como já comentado anteriormente, as preocupações têm sido em torno dos efeitos das plantas geneticamente modificadas com genes de B. thuringiensis em seus consumidores. Porém, Azevedo & Araújo (2003) mostram a ausência de efeitos tóxicos, mutagênicos, teratogênicos ou clastogênicos dessas plantas. Betz et al. (2000) também relatam que as proteínas Cry de B. thuringiensis não são tóxicas em contato direto, sendo que a exposição de animais não-alvo é extremamente baixa e a presença dessas proteínas nos tecidos vegetais também ocorre em baixas concentrações. Romeis et al. 56 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

57 (2008) também comentam que os testes laboratoriais utilizando essas plantas, são conduzidos com elevadas concentrações da proteína purificada, muito acima daquelas concentrações encontradas nos tecidos das plantas. Apesar desses dados, periodicamente estão sendo lançados produtos comerciais à base de B. thuringiensis e que, para chegarem ao mercado devem passar por diferentes análises para confirmar a não toxicidade em organismos não-alvo. O mesmo ocorre com as plantas geneticamente modificadas que são testadas em diferentes organismos para garantir a sua segurança. Nesse sentido, a Lei de Biossegurança nº , estabelece as normas de segurança e os mecanismos de fiscalização de atividades que envolvam organismos geneticamente modificados e seus derivados. 1.4 Referências Azevedo J L, Araújo W L Genetically modified crops: environmental and human health concerns. Mutation Research. 544: Berti Filho, E.; Ciociola, A.I. Parasitóides ou predadores? Vantagens e desvantagens. 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58 Pesquisa PRODUTOS DE BACILLUS THURINGIENSIS: REGISTRO E COMERCIALIZAÇÃO Lidia Mariana Fiúza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD- Montpellier). Diounéia Liziane Berlitz Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). onsiderando os biopesticidas, aqui serão apresentados aspectos básicos relacionados às avaliações toxicológicas dos produtos formulados à base de B. thuringiensis, assim como os procedimentos relacionados ao registro desses produtos comerciais, os quais seguem a lei base dos agrotóxicos. Atualmente aproximadamente 98% dos biopesticidas, utilizados na agricultura e na saúde, correspondem às formulações de B. thuringiensis (Schnepf et al., 1998; Polanczyk, 2003). No início desse milênio as vendas desses produtos foram de aproximadamente US$ 2 milhões. Em alguns países, como no Brasil, o acesso a esses produtos ainda é limitado, pois os custos das formulações são elevados e as multinacionais que os comercializam não mantém uma distribuição regular nas diferentes regiões do país. Além desses problemas soma-se a baixa persistência de alguns produtos e a falta de informações dos produtores sobre o potencial e as vantagens dos biopesticidas. No Brasil, a prospecção de entomopatógenos bacterianos é realizada em laboratórios de pesquisa ligados à agricultura e saúde pública, como: Embrapa, Fiocruz, Universidades Públicas e Privadas. Essas mesmas instituições têm desenvolvido os produtos ou efetuado convênio com Empresas Particulares. Os registros dos produtos à base de B. thuringiensis seguem basicamente as mesmas regras dos químicos sintéticos, cujos órgãos federais responsáveis pela avaliação e registro são Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), os quais prometem no atual contexto priorizar os biopesticidas em relação aos agrotóxicos convencionais, facilitando assim o registro dos produtos comprovadamente menos agressivos aos organismos não-alvo e ao ambiente. 1.1 Legislação e Registro de produtos A utilização de biopesticidas, assim como dos demais agrotóxicos baseia-se na relação riscos x benefícios que requer ensaios, os quais revelam a segurança ao homem e ao meio ambiente. Sendo assim, a legislação deve assegurar a sociedade que o biopesticida autorizado para comercialização e aplicação no controle biológico foi adequadamente avaliado quanto aos parâmetros agronômicos, saúde pública e meio ambiente (Meadows, 1993; Alves, 1998; Gallo et al., 2002). O registro de produtos à base de B. thuringiensis segue a Lei dos Agrotóxicos, cuja legislação básica é a Lei n de 11 de julho de 1989, onde os produtos são avaliados pelo Ministério da Agricultura e Ministério da Saúde quanto aos seguintes aspectos: 58 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

59 Tabela 1. Produtos comerciais de Bacillus thuringiensis para controle de pragas agrícolas Produtos Dipel Thuricide Agree Bactur Ecotech Pro Bactospeine Javelin Foray Biobit Foil/Condor Delfin Cutlass Larvo Bt Nubilacid MVP Bac-control XenTari M-One Di-Terra Trident Novodor M-One Plus Foil Empresas Abbott Sandoz Mitsui Milenia Agrociências Bayer Solvay Sandoz Novo-Nordisk Novo-Nodisk Ecogen Sandoz Ecogen Fermone Radonja Mycogen Agricontrol Abbott Mycogen Abbott Sandoz Novo Nordisk Mycogen Ecogen B. thuringiensis (Bt) Bt kurstaki Bt kurstaki Bt aizawai Bt kurstaki Bt kurstaki Bt kurstaki Bt kurstaki Bt kurstaki Bt kurstaki Bt kurstaki Bt kurstaki Bt kurstaki Bt kurstaki Bt kurstaki Bt kurstaki Bt kurstaki Bt aizawai Bt san diego Bt tenebrionis Bt san diego Bt tenebrionis Bt san diego Bt tenebrionis Bt san diego Bt tenebrionis Bt san diego Bt tenebrionis (empacotadas) Bt (recombinante) Insetos-alvo lepidópteros lepidópteros lepidopteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros lepidópteros coleópteros coleópteros coleópteros coleópteros coleópteros coleópteros pesquisas; experimentação; produção; embalagem e rotulagem; transporte; armazenamento; comercialização; propaganda comercial; utilização; importação; exportação; destino final de resíduos e embalagens; registro; classificação; controle; inspeção e fiscalização de produtos. A Lei dos Agrotóxicos foi regulamentada pelos Decretos n , de 11 de janeiro de 1990 e Dec de 04 de janeiro de 2002, sendo que atualmente para registro de um biopesticida no Brasil estão envolvidos os seguintes ministérios: MAPA: avaliação dos aspectos agronômicos. ANVISA: avaliação da toxicologia ao homem, incluindo as análises de resíduos em alimentos. IBAMA: avaliação das interações dos agrotóxicos com o meio ambiente e seus componentes bióticos. Ao Ministério da Agricultura competem basicamente as determinações sobre as pragas a serem controladas, assim como as dosagens e o número de aplicações dos produtos, cujos dados podem ser consultados no Compêndio de Defensivos Agrícolas (Andrei, 1999) e o seu complemento editado em O Ministério da Saúde baseia-se 26 ensaios de exposição aguda em animais de laboratório, cujos dados são extrapolados para o homem, estabelecendo assim 4 Classes Toxicológicas aos agrotóxicos: Classe I - Extremamente tóxicos - rotulagem vermelha Classe II Altamente tóxico - rotulagem amarela Classe III Moderadamente tóxico rotulagem azul - Bt Classe IV Pouco tóxico rotulagem verde - Bt No caso das formulações de B. thuringiensis, essas se encontram predominantemente distribuídas entre as classes III e IV, as quais se classificam como moderadamente ou pouco tóxicas. Essas classes toxicológicas referem-se sempre a manipulação dos produtos pelos fabricantes, transportadores, aplicadores e outros. Também compete a ANVISA o estabelecimento de tolerância que se refere aos limites máximos dos resíduos, os quais são avaliados em estudos de exposição subcrônica e crônica e dados desses resíduos nos produtos agrícolas. Junto ao MAPA são determinados os períodos de carência dos produtos, que fazem referência ao intervalo de segurança. O Ministério do Meio Ambiente requer 20 ensaios ecotoxicológicos, 36 estudos de características físico-químicas, 4 testes de metabolismo e degradação. Em seguida o produto é classificado quanto ao seu potencial de periculosidade no meio ambiente: Classe I Produto altamente perigoso Classe II Produto muito perigoso Classe III Produto perigoso - Bt Classe IV Produto pouco perigoso - Bt Como anteriormente, nesse caso os produtos de B. thuringiensis se enquadram como perigosos ou pouco perigosos ao meio ambiente. Os dados que competem ao IBAMA envolvem os aspectos: físico-químicos que revelam a identidade da molécula do biopesticida; ecotoxicológicos que englobam estudos com organismos não alvos (abelhas, minhocas, microcrustáceos, peixes, aves, microrganismos do solo e outros); comportamento no meio ambiente que Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 59

60 avalia a lixiviação, mobilidade no solo e bioconcentração nas cadeias tróficas, entre outros. Nos estudos toxicológicos dos biopesticidas podem ser avaliados somente o ingrediente ativo ou a formulação que se deseja registrar, podendo ambas as formas serem avaliadas simultaneamente. Após as análises requeridas pela ANVISA e IBA- MA, é o MAPA quem registra a formulação do produto, publicando a decisão no Diário Oficial da União, com validade nacional e tempo indeterminado (Gallo et al.,2002). 1.2 Produtos comerciais à base de B. thuringiensis Entre os biopesticidas, a base de B. thuringiensis (Entwistle et al, 1993; Schnepf et al., 1998), apresentados na Tabela 1, alguns se destacam no controle biológico de pragas agrícolas por serem utilizados há várias décadas, levando atualmente esse entomopatógeno a quase totalidade do mercado dos pesticidas microbianos. B. thuringiensis é um importante agente de controle de insetos-praga, principalmente para lepidópteros e coleópteros, porque seu ingrediente ativo tóxico, representado por proteínas Cry, pode ser considerado atóxico aos vertebrados e aos insetos não-alvo (Siegel, 2001). Por outro lado, as formulações comerciais de B. thuringiensis apresentam uma estabilidade limitada a campo, além de apresentarem um período de aplicação crítico devido à redução da suscetibilidade com o desenvolvimento larval dos insetos. Para complementar e manter atualizadas essas informações recomenda-se a revisão de alguns sites que indicados a seguir: - (Associação Nacional de Defesa) - (EPA Environmental Protection Agency) http: www. pesticide.net Quanto às formulações de B. thuringiensis israelensis e comercialização em escala mundial contra dípteros, especialmente os vetores de doenças humanas como Aedes aegypti, destacamse os seguintes produtos (Thomas e Ellar, 1983; Armstrong et al., 1985; Thiery et al., 1996; Andrade, 2008): Vectobac, Skeetal, Bactimos (Abbot) Teknar (Sandoz) Aquabac (Becker Microbials) LarvX SG (Meridian Precision Realease Technologies) Biotouch (Zohar Dalia) Culinex (Culinex Gmbh) Bacticide( Biotech International Ltd) Bactivec (Labiofam) Bt Horus SC (Bthek) (http:// Os mesmos autores também mencionam algumas formulações comerciais de B. sphaericus para o controle de larvas de Culex pipiens, como: Spherimos e Vectolex (Abbot) Sphericide (Biotech International Ltda) Spicbiomoss (Turicorin Alkali Chemicals and Fertilisers Ltda). Apesar de haver um número significativo de produtos à base de B. thuringiensis, ainda há um longo percurso para que sejam atingidas a maioria das ordens de insetos-praga de importância agrícola e vetores de doenças humanas. Enquanto mais pesquisas vêm sendo desenvolvidas nessa área, devem ser priorizados os biopesticidas já registrados e comercializados para o controle de insetos a fim de reduzir a contaminação ambiental causada pelos inseticidas químicos. 1.3 Referências ANDRADE, C.F.S Controle Biológico de Borrachudos Dosagens de Produtos a Base de Bacillus thuringiensis var. israelensis Artigos Técnicos - Unicamp, Instituto de Biologia, Dep. de Zoologia, Campinas, Site Ecologia Aplicada, 19p. Disponível em: eco_aplicada/. Acesso em: ANDREI, E. Compêndio de defensivos agrícolas. 6 ed. São Paulo, Organizações Andrei p. ALVES, S.B Controle microbiano de insetos. 2 ª ed. Piracicaba, SP. FEALQ, 1163 p. 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61 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 61

62 Pesquisa PLANTAS AS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAM TOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS E OUTRAS Lidia Mariana Fiúza Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier). Laura Massochin Nunes Pinto Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS). o contexto das aplicações biotecnológicas do entomopatógeno B. thuringiensis, aqui se encontram dados bibliográficos sobre a transformação genética de plantas, com genes de B. thuringiensis e outros, que conferem resistência ou tolerância das plantas hospedeiras aos insetos-praga. As espécies vegetais apresentam naturalmente uma resistência aos insetos fitófagos, diferenciando assim os grupos de pragas em função das plantas hospedeiras. A resistência vegetal está baseada em vários mecanismos de defesa, incluindo uma gama de metabólitos secundários nocivos produzidos pelas plantas. A biotecnologia vegetal, através do desenvolvimento de técnicas de biologia celular e molecular de vegetais superiores oferece novas possibilidades ao melhoramento de plantas cultivadas, facilitando a obtenção de plantas resistentes ao ataque dos insetos. A transformação genética e a regeneração in vitro de plantas, somadas à disponibilização de genes de interesse agronômico, destinados a introdução em plantas, têm permitido a geração de plantas transgênicas com características específicas, sem o rompimento de combinações genéticas já selecionadas pelos programas convencionais de melhoramento genético de plantas cultivadas. A transformação de plantas com genes de origem microbiana, vegetal e animal, os quais codificam especificamente toxinas com efeito inseticida, vem sendo considerada uma alternativa relevante junto aos métodos de controle de insetos-praga das plantas de interesse econômico, onde se destacam as plantas-bt resistentes a diversas ordens de insetos, principalmente aos lepidópteros e coleópteros. 1.1 Genes de B. thuringiensis em plantas B. thuringiensis apresenta um genoma de 2,4 a 5,7 milhões de pares de bases, com elementos extracromossômicos lineares ou circulares (Carlson et al., 1994). Os genes cry estão localizados em plasmídios, sendo esses responsáveis pela síntese de diferentes proteínas inseticidas, cuja clonagem e caracterização desses genes em 1981 (Schnepf & Whiteley, 1981) revelou novas perspectivas de aplicação do entomopatógeno. Entre essas se encontra a transgenia que permite introduzir os genes de B. thuringiensis codificadores das toxinas nos genomas dos vegetais, permitindo a expressão contínua das proteínas em todos os tecidos da planta e atingindo, assim, apenas os insetos-praga que se alimentam dos tecidos (de Maagd et al., 1999). A primeira geração de plantas transgênicas resistentes a insetos foi desenvolvida com o uso de genes codificadores de proteínas inseticidas de B. thuringiensis (Fischhoff, 1987; Vaeck et al., 1987). Os genes cry de B. thuringiensis são talvez os exemplos mais conhecidos de genes exógenos para os quais tem sido difícil obter um nível satisfatório de expressão em plantas transgênicas (Diehn et al.,1996). A baixa expressão dos genes de B. thuringiensis em plantas tem sido associada à instabilidade das moléculas de mrna, uma característica amplamente observada da expressão destes genes em plantas é o pouco ou nenhum acúmulo de mrna mesmo quando sob controle de promotores fortes. Para tanto várias modificações têm sido testadas para aumentar a eficiência de expressão destes genes, como adaptar os códons preferenciais de bactérias para códons preferenciais de plantas e/ou aumentar o conteúdo de G/C nas seqüências codificantes (Perlak et al., 1991), retirada de sítios de splicing, modificações dos sinais de poliadenilação dentro da região codificante (Koziel et al., 1993), inserção de íntrons na região 5 da seqüência não traduzida (Jouanin et al., 1998) bem como a inserção de genes nativos em cloroplastos inicialmente restrita a tabaco (McBride et al., 1995). Genes parcialmente ou totalmente sintéticos têm sido construídos, nestes genes a seqüência de nucleotídeo é modificada sem a troca da seqüência de aminoácido, a expressão destes genes em plantas aumentou significativamente (de menos de 0,001% de proteína solúvel na folha para até 1%), sendo os genes totalmente sintéticos os mais eficientes em testes de campo (Jouanin et al., 1998). Os estudos iniciais se basearam em plantas como tabaco e tomate (Barton et al., 1987; Fischhoff et al., 1987; Vaeck et al., 1987) devido às facilidades de transformação, cultivo em casa de vegetação e crescimento rápido. Vários genes quiméricos contendo um gene promotor de origem vegetal; a seqüência completa do gene cry e uma região de poliadenilação foram introduzidos em tabaco e tomate, porém nenhuma expressão foi detectada em tabaco e níveis muito baixos foram observados em tomate (Perlak et al., 2001). A truncagem da seqüência codificadora do gene cry por eliminação da metade 3 desta seqüência aumentou a expressão para níveis detectáveis de proteína e mrna (Estruch et al., 1997). Os primeiros testes de campo com versões truncadas do gene cry foram eficientes no controle de Helicoverpa zea no caso do tomate (Perlak & Fischhoff, 1993), porém não no controle de Heliothis virescens no caso do algodão (Jenkins et al., 1991). Os resultados mais efetivos foram obtidos utilizando genes sintéticos (Perlak et al., 1990; Perlak et al., 1991; Van der Salm et al., 1994). 62 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

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