Artigo RESUMO. Palavras-chave: Hidrólise Ácida. Materiais Lignocelulósicos. Açúcares Redutores. Etanol. ABSTRACT

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1 OBTENÇÃO DE AÇÚCARES FERMENTESCÍVEIS A PARTIR DA CASCA DE LARANJA E BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR OBTAINING REDUCING SUGARS FROM ORANGE PEEL AND SUGAR CANE BAGASSE RESUMO Cada vez mais existe a necessidade de desenvolvimento de tecnologias para produção de energias limpas, como os bicombustíveis (etanol) a partir de materiais lignocelulósicos, os quais são ricos em açúcares fermentescíveis. Neste contexto, o Brasil vem explorando o bagaço de cana-de-açúcar como principal fonte de matéria-prima, no entanto, o mercado agroindustrial brasileiro mostra forte estabilidade no setor de citrus, tendo a laranja como principal representante. A grande quantidade de subprodutos gerados no processamento desta fruta apresenta alto potencial como fonte de material para bioconversão. Neste trabalho fez-se a hidrólise ácida da casca de laranja tendo como parâmetro o rendimento de açúcares do bagaço de cana-de-açúcar, em diferentes tempos (15, 30, 60, 90 e 120 minutos), realizado em triplicata. Realizou-se a hidrólise utilizando-se ácido sulfúrico 6% (v/v) na proporção amostra/ácido 1:10 (m/v) e temperatura de 122ºC em autoclave. Recuperou-se o hidrolisado com água destilada (1:10) por filtração, elevando o ph da amostra com hidróxido de sódio para 4,5. A análise de açúcares redutores (AR) procedeu-se pelo método ADNS (ácido dinitrosalicílico); os resultados foram submetidos a análises estatísticas. As maiores hidrólises das amostras em açúcares redutores foram encontradas no tempo 15 minutos de tratamento, com tendência a redução destes nos outros tempos. Não houve diferença significativa (Teste T de Student, P>0,05) entre a concentração de açúcares da casca da laranja e o bagaço de cana de açúcar em 15 minutos de tratamento. Fernanda Miller*, Lucas Caldeirão*, Claudia Dorta e Paulo Sérgio Marinelli Faculdade de Tecnologia de Marília *Autores para correspondência fer_miller83@hotmail.com lucascaldeirao@terra.com.br Palavras-chave: Hidrólise Ácida. Materiais Lignocelulósicos. Açúcares Redutores. Etanol. ABSTRACT There is an increasing requirement to develop technologies to produce clean energy, such as biofuels (ethanol) from lignocellulosic materials, which are rich in fermentable sugars. In this context, Brazil has been exploring the sugarcane bagasse as the main source of raw material, however, the Brazilian agribusiness market shows strong stability in the citrus industry, and orange is its main representative. The large amount of waste generated in the processing of this fruit has a high potential as source material for bioconversion. In this work was carried out the acid hydrolysis of the orange peel, using as parameter the yield of sugars of the sugarcane bagasse, at different times (15, 30, 60, 90 and 120 minutes), performed in triplicate. The hydrolysis was performed with sulfuric acid 6% (v/v) in the ratio sample/ acid of 1:10 (w/ v) and temperature of 122ºC in autoclave. The hydrolyzed was recovered by filtration using distilled water (1:10) and the sample ph was raised to 4.5 with sodium hydroxide. The reducing sugars (RS) analysis was carried out by the DNS method (dinitrosalicylic acid) and the results were submitted to statistical analysis. The larger hydrolysis of the samples in reducing sugars was obtained in 15 minutes of treatment time with tendency to reduce these at all other times. There was no significant difference (Student s T test, P>0.05) between the sugars concentration in the orange peel and in the sugarcane bagasse in 15 minutes of treatment. Keywords: Acid Hydrolysis. Lignocellulosic Materials. Reducing Sugar. Ethanol. 2

2 INTRODUÇÃO Desde 1975 quando o governo brasileiro criou o Proálcool, Programa Nacional do Álcool, com um intuito de produzir um combustível alternativo à gasolina, devido à crise do petróleo, o Brasil vem crescendo a cada ano como produtor de etanol obtido a partir da cana de açúcar (GURGEL). O etanol pode ser produzido a partir de diferentes culturas, como trigo, mandioca, milho, beterraba, cana-de-açúcar e qualquer biomassa que tenha uma grande quantidade de amido e açúcares. No Brasil, a produção deste biocombustível é feita a partir da cana de açúcar. Produzido a partir do caldo da cana ou de subprodutos da produção de açúcar, ricos em açúcares, que são fermentados, posteriormente destilados e tratados, originando o etanol anidro e o hidratado (BNDES). Além da grande quantidade de açúcares, a cana possui também uma significativa quantidade de fibras caracterizadas como bagaço, no final da moagem da cana, tanto para a produção de açúcar quanto de etanol. Muitas usinas utilizam esse bagaço para produzir energia elétrica, para uso próprio, no entanto, a busca por novas fontes de energia vegetal intensificou-se. Há algum tempo tem-se desenvolvido tecnologias para obtenção de etanol celulósico, principalmente em países onde o clima não favorece o cultivo de cana (BNDES). O Brasil segue também nessa direção, já que possui uma grande fonte de material vegetal para a produção de etanol de segunda geração, o bagaço da cana de açúcar, o que torna sua produção vantajosa, sustentável e economicamente eficiente (FERREIRA). A cana de açúcar é constituída de 75 a 82% de água, 18 a 25% de sólidos solúveis e de 10 a 16% de fibra (4). A fibra é composta por aproximadamente 50% de celulose, 25% de hemicelulose e 25% de lignina (PANDEY), esses componentes formam os materiais lignocelulósicos e a partir do processamento desses é que se obtém o etanol de segunda geração (SILVA). A celulose é um polímero homogêneo composto por glicose (hexose) e a hemicelulose é um polímero heterogêneo constituído por pentoses (D-xilose e L-arabinose), hexoses (D-glucose, D- -manose e D-galactose) e ácidos como o acético. A xilose é o açúcar predominante na hemicelulose, podendo compreender de 20 a 40% do total de carboidratos dos subprodutos agrícolas. A lignina é uma macromolécula polifenólica a qual grande parte de sua estrutura ainda é desconhecida (ROSSELL, TSAO & RODRIGHEZ-CHONG et al.). O processo mais estudado para extração de açúcares simples do bagaço de cana-de-açúcar é a hidrólise ácida juntamente com tratamento térmico. O ácido mais utilizado é o sulfúrico, mas pode-se também utilizar o ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fluorídrico, ácido fosfórico, entre outros (RODRIGHEZ-CHONG et al., AGUILAR et al., MARTÍNEZ et al.). Existem também técnicas de hidrólise enzimática baseada na utilização de enzimas produzidas por microrganismos capazes de hidrolisar a celulose e a hemicelulose. As enzimas mais empregadas são as celulases e hemicelulases de microrganismos como Penicilliumechinulatum e Pleurotus ssp. (DILLON et al.). Segundo Schuchardt et al. além do etanol, é possível produzir outros tipos de insumos a partir de biomassa que podem substituir produtos petroquímicos, utilizando os frutos, as sementes, as folhagens, as cascas, óleos essenciais, vegetais e os carboidratos não-estruturais. Podendo-se utilizar como biomassa subprodutos agrícolas que, geralmente, são subutilizados, causando até problemas ambientais. Sendo assim, analisando o mercado agrícola e industrial brasileiro, temos que o Brasil é o maior produtor mundial de laranja e maior produtor e exportador de suco de laranja concentrado e congelado (15). Este produz 50% de todo suco de laranja produzido no mundo, participa com cerca de 85% do mercado mundial, exporta 98% do que produz e em 2009 participou com US$ 6,5 bilhões no PIB (CITRUSBR). Segundo o IBGE, a safra brasileira para o ano de 2010 foi pouco superior de 19 milhões de toneladas da fruta. Como consequência disso, há uma grande produção de subprodutos dessa indústria, já que o bagaço da laranja corresponde a 50% do peso da fruta fresca, no entanto, sua casca seca é rica em celulose e hemicelulose, podendo ser aproveitada para produção de etanol celulósico, ou de segunda geração (YLITERVO). A casca deste vegetal contém como componente base açúcares e polissacarídeos insolúveis, dentre os solúveis, que correspondem 16,9% da casca, estão frutose, glicose e sacarose. Os polissacarídeos insolúveis compõem 9,21% de celulose, 10,5% de hemicelulose e 42,5% de pectina. (REZZADORI et al.). Ylitervo em seu estudo empregou dois métodos de hidrólise para casca de laranja, hidrólise ácida, onde usou ácido sulfúrico e hidrólise enzimática, na qual utilizou as enzimas celulase, pectinase e β-glucosidase. Diante da necessidade de se buscar novos subprodutos agroindustriais para a produção etanólica de segunda geração, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de obtenção de açúcares fermentescíveis a partir casca da laranja, usando como parâmetro o bagaço de cana- deaçúcar, através da hidrólise ácida destes em diferentes tempos de tratamento térmico. MATERIAL E MÉTODOS Materiais As cascas de laranjas utilizadas no experimento foram obtidas de uma casa de sucos da cidade de Marília (SP). O bagaço da cana-de-açúcar foi obtido do comércio local de Marília. Preparo da amostra - Cascas de laranja Foram retirados e descartados os resíduos dos carpelos, vesículas de suco, núcleo, e albedo, restando apenas o flavedo (casca), posteriormente lavado para a retirada de resquícios de suco, picado manualmente e mantido em refrigeração a 4ºC. 3

3 O óleo essencial presente na casca da laranja pode ser tóxico aos microrganismos fermentadores, assim fez-se a extração deste por hidrodestilação em aparelho de Clevenger. Para tanto, a amostra foi previamente triturada, pois nessas condições esse processo apresenta-se mais eficiente (FER- NANDES, et al.). Após a remoção do óleo essencial, fez-se a secagem das cascas até atingir peso constante a 75ºC em estufa com circulação de ar. - Bagaço da cana-de- açúcar O bagaço da cana-de-açúcar foi triturado e lavado para a retirada de resíduos do caldo, então seco em estufa a 105ºC até peso constante. Hidrólise ácido-sulfúrica A hidrólise das duas amostras procedeu-se em triplicatas, utilizando-se ácido sulfúrico 6% na proporção 1:10 (p/v) em cinco tempos distintos,15, 30, 60, 90 e 120 minutos, a 122ºC em autoclave (AGUILAR et al.). Recuperou-se o hidrolisado filtrando-o com água destilada na diluição 1:10 (v/v) (AGUILAR et al.), uma pequena fração deste foi reservado para correção do ph 4,5 com hidróxido de sódio 4,0M e 0,1M, simulando o ph ideal para uma fermentação alcoólica. As amostras foram, posteriormente, submetidas ao tratamento com carvão ativado (Synth) para a clarificação, esse processo auxilia também na remoção de furfural, 5-hidroximetilfurfural e ácido acético, sintetizados a partir da hidrólise ácida (CARVALHO et al.). Fez-se então análise de açúcares redutores (AR) pelo método ADNS (item 2.5). PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS Açúcares redutores Os açúcares redutores resultantes da hidrólise ácida dos materiais vegetais estudados foram determinados pelo método ADNS, descrito por Miller. A absorbância foi realizada em espectrofotômetro a 540nm. A curva padrão de glicose e xilose foi feita para efetivação dos cálculos da concentração de açúcares. Análise estatística Os dados das hidrólises foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey através do programa GRAPHPAD INSTAT (Rutgers University Camden, New Jersey). O Teste-t e Teste- -F foram aplicados através do mesmo programa quando houve necessidade de comparar médias entre dois grupos amostrais. Os resultados foram considerados significativos para P<0,05. RESULTADOS E DISCUSSÃO O maior valor médio de açúcares hidrolisados do bagaço de cana-de-açúcar foi encontrado no tratamento de 15 minutos, representando um aumento significativo (Tukey, P<0,05) da concentração de açúcares de até 34% em relação à 120 minutos. As médias e os desvios padrão estão representados na Tabela 1. Um menor tempo de tratamento térmico indica redução nos custos do processo, ou seja, quanto menos se gasta energia para se obter etanol de segunda geração mais viável fica sua obtenção. Durante a hidrólise ácida, além da obtenção de monômeros de açúcares, com binômio baixo ph e alta temperatura, há geração de produtos de decomposição dos carboidratos como furfural, que provêm das pentoses e o ácido acético formado a partir de radicais acetilas, ambos da hemicelulose; 5-hidroximetilfurfural que se origina das hexoses da celulose (ROSSELL, RODRIGUEZ-CHONG et al., GÁMEZ et al.). Esta perda de açúcares redutores em forma de outros compostos químicos pode se intensificar com o aumento de tempo de tratamento. Assim, nesse trabalho, tempos de tratamento térmico superiores a 15 minutos provavelmente resultaram numa maior perda de açúcares fermentescíveis. A maior concentração de açúcares do bagaço de cana- -de-açúcar obtida neste trabalho foi apenas 15,20% do valor conseguido, em condições semelhantes, por Aguilar et al, no entanto, tal variação pode ser justificada pela diferente origem da matéria-prima, equipamentos e reagentes utilizados. Tabela 1. Concentração média de açúcares redutores hidrolisados da cana-de-açúcar. Concentração média de açúcares Tempo de tratamento (min.) redutores [g/l] 15 3,74 ± 0,2 30 3,63 ± 0, ,23 ± 0, ,17 ± 0, ,76 ± 0,17 Gámez et al, a maior concentração de açúcares obtidos do bagaço de cana-de-açúcar no presente trabalho foi de aproximadamente 16% de seus resultados. Tais autores utilizaram para a hidrólise do bagaço o ácido fosfórico e 300 minutos a 122 C Santos e Gouveia empregaram a hidrólise enzimática, em alternativa à hidrólise ácida, alcançaram um rendimento aproximado de 44% a mais que Aguilar et al., 47% a mais que Gámez et al. e 91,5% mais que este trabalho, em relação ao bagaço de cana-de-açúcar. Isso indica que o emprego de tecnologias enzimáticas para obtenção de açúcares de material lignocelulósicos é uma alternativa interessante. A Tabela 2 apresenta as médias e seus desvios padrão dos açúcares resultantes da hidrólise de casca de laranja. As- 4

4 sim como no bagaço de cana-de-açúcar, na casca da laranja a maior concentração de açúcares encontrada foi no tempo 15 minutos, representando significativamente (Tukey, P<0,05) um aumento de até 31,7% em relação aos 120 minutos de tratamento. Tabela 2. Concentração média de açúcares redutores hidrolisados da casca de laranja Tempo de tratamento (min.) Concentração média de açúcares redutores [g/l] 15 3,39 ± 0, ,06 ± 0, ,01 ± 0, ,96 ± 0, ,58 ± 0,09 Após a análise estatística, verificou-se que não existiu diferença significativa (Teste t, P> 0,05) das maiores médias de açúcares redutores obtidos da hidrólise do bagaço de cana e da casca da laranja (Tabela 1 e 2). Este resultado indica que a casca de laranja poderia ser usada para a produção de etanol de segunda geração em substituição ao bagaço de cana. Para o Brasil esses dados são extremamente positivos, pois detém a maior produção e industrialização de laranja do mundo, consequentemente é o maior gerador de subprodutos a partir desta fruta e encontra na produção de etanol uma alternativa, reduzindo a poluição ambiental e agregando valores aos rejeitos (MACHADO, CITRUSBR, REZZADORI et al.). A Tabela 3 mostra o rendimento de açúcares fermentescíveis do bagaço de cana e da casca de laranja. Os maiores rendimentos médios foram encontrados em 15 minutos de hidrólise, sem diferença significativa (Teste t, P > 0,05) para ambos os materiais vegetais testados. Tabela 3. médio de açúcares redutores hidrolisados do bagaço de cana-de-açúcar e da casca de laranja Tempo de tratamento (min) g de açúcar/g de bagaço seco (%) g de açúcar/g de casca de laranja seca (%) 15 0,37 37,4 0,33 33,4 30 0,36 36,3 0,31 30,6 60 0,32 32,2 0,30 30,1 90 0,32 31,7 0,30 29, ,28 27,6 0,26 25,8 Ylitervo obteve até 0,56g de açúcar/g de sólidos da casca de laranja após hidrólise enzimática pelo fungo Mucor indicus. A Tabela 3 mostra que os rendimentos de açúcares obtidos do bagaço e da casca corresponderam a 66 e 60%, respectivamente, ao citado por tal autor. CONCLUSÕES O maior rendimento na obtenção de açúcares fermentescíveis através da hidrólise ácida a 122ºC foi para o tratamento de 15 minutos para o bagaço de cana e a casca de laranja. Existiu tendência de perdas de açúcares em função do aumento de tratamento térmico. Não houve significância estatística na quantidade de açúcares redutores entre as amostras, podendo viabilizar a utilização da casca de laranja na produção de etanol. Entretanto, é necessário otimizar a metodologia de obtenção de açúcares de ambos os materiais vegetais para obtenção de melhores rendimentos. R e f e r ê n c i a s GURGEL, L. V. A. Hidrólise ácida do bagaço de cana-de-açúcar: Estudo cinético de sacarificação de celulose para produção de etanol. São Carlos, p. Tese (Doutorado em Ciências) Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Paulo, BNDS, CGEE. Banco Nacional do Desenvolvimento Econômico e Social; Centro de Gestão e Estudos Estratégicos (Coord.). Bioetanol de cana-de-açúcar:energia para o desenvolvimento sustentável. Rio de Janeiro: BNDES, FERREIRA, A. D. Utilização da levedura Pichia stipitis UFMG- IMH 43.2 para obtenção de etanol em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Lorena, p. Tese (Mestre em Ciências) Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial na Área de Conversão de Biomassa, Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena OLIVEIRA, E. R. Fiscalização de laboratórios de análise da qualidade da cana-de-açúcar. Piracicaba: ORPLANA, CD ROM. PANDEY, A.; SOCCOL, C. R.; NIGAM, P.; SOCCOL, V. T. Biotechnological potencial of agro-industrial residues. I: sugarcane bagasse. Bioresouce Technology, v.74, p.69-80, SILVA, G. O. Produção de etanol com a utilização do bagaço de cana-de-açúcar. Faculdade de tecnologia de Araçatuba, Araçatuba ROSSELL, C. E. Fermentação do hidrolisado. III Workshop Tecnológico sobre Hidrólise para Produção de Etanol, São Paulo, dez

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