Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

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1 Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Análise fotoacústica da concentração relativa de Piroxicam administrado por sonoforese na pele humana in vivo Fernanda Henrique dos Anjos Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica. São José dos Campos, SP 2004

2 Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Análise fotoacústica da concentração relativa de Piroxicam administrado por sonoforese na pele humana in vivo Fernanda Henrique dos Anjos Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica. Orientador: Prof. Dr. Paulo Roxo Barja Co-orientador: Prof. Dr. Daniel Acosta Avalos São José dos Campos, SP 2004

3 A619a Anjos, Fernanda Henrique dos Análise fotoacústica da concentração relativa de Piroxicam administrado por sonoforese na pele humana in vivo / Fernanda Henrique dos Anjos. São José dos Campos: UniVap, p; il.: 31cm. Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraiba, Pele 2. Sonoforese 3. Fotoacústica 4. Fonoforese 5. Absorção cutânea I. Barja, Paulo Roxo, Orient. II. Avalos, Daniel Acosta, Co-Orient. III. Título CDU: Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta dissertação, por processo fotocopiador ou transmissão eletrônica. Assinatura do aluno: Data:

4 Análise fotoacústica da concentração relativa de Piroxicam administrado por sonoforese na pele humana in vivo Fernanda Henrique dos Anjos Banca Examinadora Prof. Dr. Luíz Vicente Franco de Oliveira, Presidente (Univap) Prof. Dr. Paulo Roxo Barja, Orientador (Univap) Prof. Dr. Daniel Acosta Avalos, Co-orientador (Univap) Prof. Dr. Edson Corrêa da Silva (UNICAMP) Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco Diretor do IP&D São José dos Campos, 10 de maio de 2004

5 Dedico este trabalho a Deus.

6 Agradeço em primeiro lugar a Deus; Agradeço também a todas as pessoas que estiveram do meu lado, não só torcendo, me apoiando, me fortalecendo, me incentivando, mas jogando de fato no meu time e me ajudando a realizar os méritos deste trabalho; Agradeço em especial aos meus pais que não me deram adeus no porto, mas sim embarcaram comigo nesta aventura; À Fernanda R Marciano, e Paula C. Bueno Rompe pelo exemplo prático de amizade, atenção, boa vontade e cooperação; Agradeço ao meu namorado pela paciência em me ajudar e me compartilhar com tanto trabalho, e também pelo incentivo; À Claudia e a Nídia pela atenção, preocupação, eficiência e principalmente por realizarem tudo com muita simpatia e com uma educação que deveria ser matéria obrigatória; As faxineiras que fizeram do nosso laboratório um lugar assíduo e agradável de se trabalhar; Agradeço ainda ao orientador e ao co-orientador do trabalho que me guiaram seguramente na jornada.

7 Nós vos pedimos com insistência Não digam nunca: Isto é natural! diante dos acontecimentos de cada dia numa época em que reina a confusão em que corre o sangue em que o arbitrário tem força de lei em que a humanidade se desumaniza; Não digam nunca: Isto é natural Para que nada possa ser imutável (Brecht)

8 Resumo Nas últimas duas décadas, o ultra-som (US) tem sido utilizado para otimizar a administração de medicamentos através da pele e tecidos subjacentes. Seu mecanismo baseia-se na produção de ondas sonoras de alta freqüência que atravessam a pele utilizando um gel como condutor e favorecendo a penetração do fármaco veiculado no gel. A aplicação do US pode ser feita no modo contínuo, mais utilizado, ou no modo pulsado, que minimiza a produção de calor. O presente estudo tem por objetivo avaliar comparativamente a concentração de Piroxicam (a 0,5%) na pele após sua administração por sonoforese nos modos contínuo e pulsado, utilizando a fotoacústica como técnica de diagnóstico. A técnica fotoacústica possibilita o estudo de materiais biológicos e de suas propriedades ópticas e térmicas através da análise do sinal produzido em conseqüência da absorção de luz modulada por uma amostra. Neste estudo, a sonoforese foi ministrada no antebraço de cada voluntário: a) com o ultra-som no modo contínuo numa frequência de 3MHz, intensidade de 1W/cm 2, por um minuto; b) com o ultra-som no modo pulsado, mesmos valores de frequência e intensidade (razão ligado/desligado 1:4, equivalendo a uma intensidade média de 0,2W/cm 2 ), por cinco minutos. O sinal fotoacústico do antebraço limpo foi coletado, com as demais medidas sendo realizadas logo após cada aplicação do Piroxicam. O sinal fotoacústico pós-sonoforese, para ambos os modos de aplicação (contínuo ou pulsado), apresenta amplitude inferior à do sinal fotoacústico da pele limpa; além disso, a sonoforese no modo pulsado apresenta amplitude de sinal fotoacústico inferior à do sinal coletado após a sonoforese no modo contínuo. Medidas placebo realizadas com o aparelho de US desligado não mostram diferença significativa entre os dois tempos de fricção utilizados; assim, a diferença na amplitude do sinal após sonoforese no modo contínuo e sonoforese no modo pulsado pode ser atribuída a diferenças de penetração do medicamento. O cálculo das concentrações relativas indica maior concentração do produto na epiderme após realização da sonoforese no modo pulsado. Palavras-chave: Sonoforese, Fonoforese, Fotoacústica, Pele, Absorção transcutânea

9 Abstract In the last two decades, the ultrasound (US) technique has been employed to enhance drug administration through the skin and subjacent tissues. Its mechanism is based upon the production of sound waves of high frequency that penetrate in the skin, utilizing a conductor gel and increasing the penetration of the drug delivered with the gel. Ultrasound can be applied in the continuous mode, most employed, or in the pulsed mode, that minimizes heat production. The aim of the present work is to comparatively evaluate the concentration of Piroxicam (0,5%) in the skin after its administration by sonophoresis in the continuous and in the pulsed mode, utilizing photoacoustics as a diagnosis technique. The photoacoustic technique allows the study of biological materials and their optical and thermal properties through the analysis of the signal produced as a consequence of modulated light absorption by a sample. In this study, the phonophoresis was administrated in the forearm of each volunteer: a) with the US in the continuous mode, with a 3MHz frequency and 1W/cm 2 intensity, for one minute; b) with the US in the pulsed mode, same frequency and intensity values (1:4 on/off ratio, corresponding to an average value of 0,2W/cm 2 for intensity), for five minutes. The photoacoustic signal of the clean forearm was obtained, with the subsequent measurements being performed immediately after each application of Piroxicam. The photoacoustic signal post-phonophoresis, for both modes of application (continuous or pulsed) presents amplitude inferior to the photoacoustic signal of the clean skin; furthermore, phonophoresis in the pulsed mode generates a photoacoustic signal amplitude inferior to that of the signal obtained after phonophoresis in the continuous mode. Placebo measurements performed with the US turned off do not show significant difference between the two friction times utilized; therefore, the difference between the signal amplitude post-phonophoresis in the continuous mode and the phonophoresis in the pulsed mode can be attributed to differences in transdermal drug delivery. The calculus of the relative concentration indicates higher concentration of the product in the epidermis after phonophoresis in the pulsed mode. Keywords: Phonophoresis, Sonophoresis, Photoacoustic, Skin, Transdermal absorption

10 Lista de Figuras Figura 1 Esquema da célula fotoacústica...12 Figura 2 Esquema da montagem fotoacústica...19 Figura 3 Montagem fotoacústica utilizada...19 Figura 4 Aparelho de Ultra-som utilizado...20 Figura 5 Exemplo da aplicação do Piroxicam gel a 0.5% por sonoforese no antebraço do voluntário...22 Figura 6 Antebraço limpo em contato com a célula fotoacústica...24 Figura 7 Exemplo de série de medidas fotoacústicas...26

11 Lista de Tabelas Tabela 1 Resultados das medidas efetuadas no primeiro voluntário Bloco Tabela 2 Resultados das medidas efetuadas no primeiro voluntário Bloco Tabela 3 Resultados das medidas efetuadas no segundo voluntário Bloco Tabela 4 Resultados das medidas efetuadas no segundo voluntário Bloco Tabela 5 Resultados das medidas efetuadas no terceiro voluntário Bloco Tabela 6 Resultados das medidas efetuadas no terceiro voluntário Bloco Tabela 7 US-placebo. Nível de sinal PA após aplicação placebo para o primeiro voluntário...31 Tabela 8 US-placebo. Nível de sinal PA após aplicação placebo para o segundo voluntário...31 Tabela 9 US-placebo. Nível de sinal PA após aplicação placebo para o terceiro voluntário...31 Tabela 10 Sinal relativo. Razão entre o nível de sinal após sonoforese e o sinal obtido com o braço limpo, para o primeiro voluntário...32 Tabela 11 Concentração relativa primeiro voluntário...32 Tabela 12 Sinal relativo. Razão entre o nível de sinal após sonoforese e o sinal obtido com o braço limpo, para o segundo voluntário...33 Tabela 13 Concentração relativa segundo voluntário...33 Tabela 14 Sinal relativo. Razão entre o nível de sinal após sonoforese e o sinal obtido com o braço limpo, para o terceiro voluntário...34 Tabela 15 Concentração relativa terceiro voluntário...34

12 Lista de Abreviaturas e Símbolos EC Estrato córneo µm Micrômetros khz Quilohertz US Ultra-som UST Ultra-som terapêutico MHz Megahertz TDD Transporte transdermal de drogas UV Ultravioleta PA Fotoacústica PAS Espectroscopia fotoacústica Hz Hertz W Watt mv Milivolts cont Contínuo puls Pulsado BL Braço limpo X Concentração relativa

13 1 Sumário 1. INTRODUÇÃO PELE HUMANA ULTRA-SOM E SONOFORESE EFEITOS DA SONOFORESE NA PELE FOTOACÚSTICA CONTEXTO HISTÓRICO BASE TEÓRICA JUSTIFICATIVA OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS MATERIAL PARA ANÁLISE FOTOACÚSTICA MATERIAL PARA SONOFORESE METODOLOGIA RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO...38 BIBLIOGRAFIA...39 ANEXO A TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO...42 ANEXO B APROVAÇÃO DO PROJETO PELO COMITÊ DE ÉTICA DO IP&D / UNIVAP...45

14 2 1. INTRODUÇÃO 1.1 PELE HUMANA A pele, com aproximadamente 4,5kg, representa 12% da massa seca total do corpo humano. Com uma espessura que varia de 0,5 a 4 milímetros e contendo perto de 20% do conteúdo total de água do organismo, a pele constitui o maior sistema de órgãos exposto ao meio ambiente, representando o mais extenso órgão sensorial do corpo para a recepção de estímulos táteis, térmicos e dolorosos. Recobrindo a superfície do corpo e formando o sistema tegumentar juntamente com a epiderme, que é a porção epitelial, e a derme (porção conjuntiva) está a hipoderme, tela subcutânea que, embora estando imediatamente abaixo da derme e tendo a mesma origem e morfologia desta, não faz parte da pele. A hipoderme proporciona suporte e união da derme com os órgãos subjacentes, permitindo à pele uma considerável amplitude de movimentos (GUIRRO e GUIRRO, 2002). A pele é constituída de duas camadas: a epiderme e a derme. A camada mais superficial da pele é a epiderme, constituída de células epiteliais intimamente unidas. A camada mais profunda, a derme, é constituída de tecido conjuntivo denso. Não existe um limite regular entre essas duas camadas: a divisão é marcada pela presença de saliências e reentrâncias das duas camadas que se ajustam formando papilas dérmicas (GUIRRO e GUIRRO, 2002). A epiderme promove uma cobertura para o corpo humano. Geralmente possui espessura entre 0.075mm e 0.15mm dependendo da região do corpo que recobre, podendo chegar a 0.6mm de espessura em regiões como a palma da mão e sola do pé. A epiderme é formada por quatro camadas distintas, sendo que o estrato córneo (EC), a mais externa das camadas, desempenha um importante papel no transporte transdermal de medicamentos (ROBERTS, 1999). Na epiderme não encontramos vasos sanguíneos, por isso sua nutrição é mantida por meio da difusão dos nutrientes do leito capilar da derme, que é bem vascularizada. Desse modo, as células da epiderme que estão mais próximas da derme têm suas necessidades nutritivas suficientemente supridas, mas as células da camada mais

15 3 superficial da epiderme, e portanto mais distantes da derme, morrem (GUIRRO e GUIRRO,2002). A pele apresenta diversas funções. O fato de ser relativamente impermeável, devido à camada de queratina que recobre a epiderme, proporciona proteção contra agentes físicos, químicos e biológicos ambientais. Além disso, a pele serve como base dos receptores sensoriais, localização do sentido do tato, fonte organizadora e processadora de informações, fonte imunológica de hormônios para diferenciação de células protetoras, proteção contra efeitos das radiações, traumas mecânicos e elétricos, reguladora do metabolismo e armazenamento de gordura, reservatório de alimento e água, agente sintetizante de compostos importantes como a vitamina D, reguladora da pressão e do fluxo sanguíneo e linfático e reguladora da temperatura (GUIRRO e GUIRRO, 2002). A pele, juntamente com os tecidos subcutâneos e a gordura desses tecidos, é considerada um isolante térmico para os tecidos internos, constituindo um sistema eficaz para a manutenção da temperatura central interna normal do corpo (GUYTON, 1998). A camada mais superficial da epiderme é conhecida como estrato córneo (EC). O EC é uma membrana que compreende uma matriz lipídica rica em queratina. Esta camada é responsável por promover ao corpo humano uma barreira contra agentes externos estressantes químicos, biológicos e ambientais, bem como por evitar a perda de água. A designação dos sistemas dermal e transdermal são importantes para a compreensão dos mecanismos do transporte de drogas através da pele (HANH et al., 2001). O EC humano possui uma espessura de aproximadamente 15µm. É uma membrana heterogênea constituida por células mortas ricas em queratina (queratinócitos), cercadas por camadas duplas de lipídio (WU et al., 1998; ROBERTS, 1999; HANH et al., 2001). Sua estrutura consiste em vários planos de células mortas interligadas. Estas células têm seu citoplasma substituído por uma proteína fibrosa denominada queratina e são chamadas de células corneificadas. Embora possua uma espessura delgada, o estrato córneo possui uma capacidade de retenção hídrica que conserva a superfície da pele hidratada (MORGANTI et al., 2001).

16 4 O EC apresenta em sua composição uma concentração de água entre 10% e 20% enquanto as outras camadas da epiderme concentram cerca de 60% de água. A presença de água no EC é essencial para manter a rigidez, elasticidade e maciez da pele (ROBERTS, 1999). A aplicação tópica de medicamentos é de grande relevância no tratamento de doenças da pele. O EC atua como uma barreira à penetração de drogas por causa da sua estrutura complexa (CHRIST et al., 2001). No entanto, o EC não é apenas uma camada inerte e sim uma barreira ativa que se opõe à penetração de agentes externos ambientais (sendo que esta função se aplica tanto para agentes tóxicos como cosméticos) e regula continuamente a perda de água, mantendo a homeostase da pele e de todo corpo humano (MORGANTI et al., 2001). O transporte transdermal de drogas é dificultado pela baixa permeabilidade que o EC proporciona à pele. Recentemente foi demonstrado que a aplicação pulsada de ultra-som pode aumentar a permeabilidade da pele humana para administração de drogas, incluindo proteínas de alto peso molecular (WU et al., 1998). 1.2 ULTRA-SOM E SONOFORESE As ondas sonoras produzidas numa freqüência acima de 18kHz não podem ser captadas pelo ouvido humano, constituindo dessa forma o chamado ultra-som (US). No final da década de 1940, o US teve sua primeira aplicação com finalidade terapêutica em medicina, e a partir daí tem se revelado eficiente no tratamento de muitas formas de lesões quando aplicado em animais e no homem (GUIRRO e GUIRRO, 2002). A sonoforese é um procedimento caracterizado pelo movimento de drogas através das membranas biológicas (como a pele), estimulado por meio do US, com fins terapêuticos (FANG et al., 1999). Nas últimas duas décadas, o ultra-som (US) tem sido usado como uma técnica de otimização na aplicação de medicamentos através da pele (WU et al., 1998). O US aumenta a permeabilidade das membranas, aumentando a transferência de fluidos para os tecidos, característica importante na sonoforese (KAHN, 2001; LOW e REED, 2001).

17 5 Uma onda sonora pode ser produzida por qualquer elemento vibrador (cristal, corda etc) que cause variações na densidade ou pressão do meio ao seu redor. Os sons e ultra-sons são vibrações capazes de se propagarem através de gases, líquidos e sólidos (GUIRRO e GUIRRO, 2002). As freqüências ultra-sônicas podem ser geradas por um transdutor que transforma energia elétrica em energia mecânica (som) através do efeito piezelétrico (KAHN, 2001). O efeito piezoelétrico consiste na alteração de espessura de um cristal submetido a uma diferença de potencial. Se uma diferença de potencial for aplicada de forma modulada sobre uma lâmina de quartzo cortada perpendicularmente ao seu eixo elétrico, o cristal ficará alternadamente mais espesso ou mais delgado em relação à sua espessura de repouso. Isto gera no transdutor regiões de compressão e rarefação na mesma freqüência da corrente elétrica aplicada, gerando a onda ultra-sônica. (KITCHEN et al., 1998; BISSCHOP et al., 2001). O equipamento de ultra-som terapêutico (UST) consiste de um gerador de corrente elétrica de alta frequência conectado a uma cerâmica piezoelétrica sintética. Esta cerâmica se deforma na presença de um campo elétrico (GOULD, 1993; GUIRRO e GUIRRO, 2002). Para a produção do UST, podem ser usados cristais piezoelétricos cortados, que mudam de formato de acordo com o potencial elétrico aplicado (LOWe REED, 2001). O material piezoelétrico também é responsável pela freqüência do US, uma vez que determina a freqüência de ressonância. No mercado nacional, os equipamentos disponíveis de UST caracterizam-se por apresentar freqüências de 1,0 e/ou 3,0 megahertz (MHz). Já a intensidade varia de 0,01 a 2,0W/cm 2 nos equipamentos mais recentes, projetados de forma mais compatível com a prática clínica (LOW e REED, 2001; GUIRRO e GUIRRO, 2002). Ao penetrar no corpo, o US pode exercer sobre as células e tecidos dois tipos de efeitos físicos: térmicos e atérmicos. O efeito térmico ocorre como resultado da oscilação que as partículas de um tecido sofrem ao absorverem a onda ultra-sonora, com a energia sonora sendo convertida em energia térmica. Este efeito depende da natureza do tecido, seu grau de vascularização e da freqüência do US (KITCHEN, 1998).

18 6 Este calor pode ser dissipado por meios fisiológicos normais (associados ao fluxo sanguíneo). Quando a dissipação do calor é equivalente a sua geração, temos efeitos não-térmicos agindo sobre o tecido; no entanto, quando o calor não é dissipado proporcionalmente a sua geração, temos efeitos térmicos que resultam no aumento da temperatura local (KAHN, 2001). O efeito térmico pode ser considerado terapêutico, uma vez que o aquecimento de estruturas constituídas de tecido fibroso pode gerar um aumento temporário na sua extensibilidade e conseqüente diminuição da rigidez articular; o aquecimento leve pode também ser utilizado para reduzir a dor e o espasmo muscular e auxiliar nos processos de cicatrização (GOULD, 1993; KAHN, 2001). Os efeitos atérmicos englobam: 1) a cavitação, que é a formação de pequenas bolhas gasosas (da ordem de 1µm de diâmetro) nos tecidos como resultado da vibração do US; 2) a microcorrenteza ou microfluxo, que são movimentos muito pequenos de líquido tecidual em torno das células ou mesmo em torno das bolhas gasosas geradas pela cavitação; 3) ondas estacionárias, que ocorrem como resultado da sobreposição das ondas refletidas sobre as ondas incidentes; e 4) a micromassagem, que é produzida pela vibração do US (LOW e REED, 2001). A cavitação é um processo decorrente da energia mecânica gerada pela vibração ultra-sônica; é caracterizada pela formação de cavidades ou bolhas no meio líquido, com quantidades variáveis de gás ou vapor (SIMONIN, 1995). Este processo pode alterar a estrutura e/ou função celular, uma vez que produz intensas ondas de choque, aumentos instantâneos de temperatura e pressão e efeitos químicos no meio, devidos aos colapsos das microbolhas. Esse fenômeno é utilizado terapeuticamente para produzir efeitos escleróticos como a mobilização e liberação de aderências no tecido cicatricial e quebra de depósito de cálcio (GUIRRO e GUIRRO, 2002; KAHN, 2001). A cavitação pode ser de dois tipos: estável ou transitória. A cavitação estável tem valor terapêutico e ocorre quando as bolhas oscilam dentro das ondas de pressão do US, permanecendo intactas, e é basicamente não térmica. Já a cavitação transitória ou instável ocorre quando o volume de bolhas se altera rapidamente e então colapsa, causando alta pressão e mudanças de temperatura que resultam num dano considerável do tecido. Normalmente está associada a altas intensidades (LOW e REED, 2001).

19 7 Outro efeito não térmico do US no incremento da difusão de substâncias através de membranas é o microfluxo, que consiste em movimentos unidirecionais e circulares gerados no fluido biológico que podem provocar danos nas células, alterando, por outro lado, a permeabilidade das membranas e o ritmo de difusão das partículas (GUIRRO e GUIRRO, 2002). Um efeito indesejável é o ocasionado pelas ondas estacionárias como a lesão no endotélio e até mesmo a formação de trombos. O movimento adequado e constante do transdutor durante o tratamento evita a formação dessas ondas (LOW e REED, 2001). A aplicação do US pode ser feita no modo contínuo (onda contínua, ou CW), quando a diferença de potencial através do transdutor do UST é aplicada durante todo o período do tratamento, ou no modo pulsado, quando a aplicação é feita com intervalos de pausa entre as rajadas de US (KITCHEN, 1998). Em geral, o modo pulsado acarreta efeitos não-térmicos como a cavitação estável e o microfluxo; já o modo contínuo promove, além dos efeitos mecânicos, um efeito térmico pronunciado. Assim, o modo escolhido deve ser apropriado à ação desejada (GUIRRO e GUIRRO, 2002). Com a utilização do US no modo pulsado, é possível atingir intensidades mais altas com segurança, uma vez que neste modo há mais tempo para que ocorra a dissipação do calor, garantido assim um aquecimento médio reduzido (LOW e REED, 2001; KAHN, 2001). A utilização do ultra-som como método otimizador do transporte de drogas através da pele pressupõe o uso do modo contínuo (GUIRRO e GUIRRO, 2002). No entanto, ao realizarmos a sonoforese no modo pulsado, podemos evitar a produção pronunciada de calor que poderia destruir o equilíbrio molecular do medicamento (BISSCHOP et al., 2001). A sonoforese tem sido usada clinicamente para conduzir medicação através da pele e tecidos subjacentes de forma relativamente segura e indolor. Seu mecanismo baseia-se na produção de ondas sonoras de alta freqüência que atravessam a pele utilizando um gel como condutor e favorecendo dessa forma a penetração do fármaco veiculado no gel. As ondas ultrasônicas com freqüências na faixa dos megahertz são fortemente atenuadas através do ar; assim, faz-se necessário utilizar um meio de contato (água, óleos minerais ou géis aquosos) que permita a condução de US do transdutor até

20 8 a pele de modo eficaz (KITCHEN, 1998). Para tanto, formulações farmacológicas com fins terapêuticos para sonoforese devem ter preferencialmente como base o gel (GUIRRO e GUIRRO, 2002). O transporte de drogas através da pele (transporte transdermal de drogas, TDD) muitas vezes mostra-se vantajoso em relação aos métodos oral e de injeção. Quando comparado com a administração oral, o TDD é mais efetivo por evitar o metabolismo gastrintestinal e os efeitos colaterais associados. Quando comparado à injeção, o TDD elimina o medo e a dor associados (WU et al., 1998). Processos dolorosos e inflamatórios crônicos requerem um tratamento continuado. Um método mais eficaz de aplicação de medicamentos facilita o retorno do paciente a função normal. O transporte transdermal nas áreas afetadas pode ser otimizado pela sonoforese (ROBERTS, 1999). Outro processo utilizado é a iontoforese, caracterizada pelo transporte de drogas ionizadas como anestésicos locais e antiinflamatórios através das membranas biológicas por meio da aplicação de corrente elétrica, com fins terapêuticos (KANIKKANNAN et al., 2001). A iontoforese aumenta a penetração de substâncias polares através da pele sob um gradiente de potencial constante. Existem várias vantagens na utilização da sonoforese, dentre as quais a ação localizada da droga, evitando-se os efeitos colaterais decorrentes de ação sistêmica, e a somatória dos efeitos da droga associados aos efeitos do US; além do mais, a sonoforese dispensa a necessidade do medicamento ser polarizado, o que no caso da administração transdérmica por iontoforese se faz necessário (GUIRRO e GUIRRO, 2002). 1.3 EFEITOS DA SONOFORESE NA PELE As bicamadas de lipídio que cercam os queratinócitos no estrato córneo têm uma estrutura altamente ordenada que torna o EC impermeável a várias drogas. Baseado no fato de que o US é capaz de gerar defeitos nas bicamadas com diâmetros da ordem de dezenas a centenas de nanômetros, pode-se propor a geração de um aumento temporário da permeabilidade da pele (WU et al., 1998).

21 9 A eficiência do EC como barreira para o transporte molecular tem levado ao desenvolvimento de uma variedade de tecnologias não-invasivas para aumentar o potencial de aplicação de drogas transdermais ou para tornar simples a extração de moléculas para monitoramento e/ou diagnóstico. O US tem se mostrado útil no aumento da permeabilidade transdermal de várias drogas, incluindo a insulina. No entanto, o mecanismo de ação da sonoforese permanece definido de forma incompleta, e tem sido explicado em termos de aquecimento local, desorganização lipídica do estrato córneo e/ou cavitação, formação e oscilação de pequenas inclusões gasosas. São fatores importantes a freqüência e amplitude de pressão ótimas do US para maximizar o transporte molecular através da pele (MERINO et al., 2003). O efeito térmico do US na pele resulta da transferência e conversão da energia mecânica gerada pela vibração do cristal piezoelétrico na aplicação da sonoforese. A absorção dessa energia pela pele causa um aumento na temperatura diretamente relacionado com a intensidade da onda sonora. Considerando que a permeabilidade da pele pode aumentar significativamente com a temperatura (por exemplo, a absorção do estradiol dobra quando a temperatura aumenta cerca de 10 o C), e que fases de transição dos lipídios intercelulares do estrato córneo (EC) podem ocorrer em temperaturas próximas do fisiológico, conclui-se que mudanças térmicas podem contribuir no transporte transdermal otimizado pela sonoforese (MERINO et al., 2003). Na fisioterapia, a sonoforese pode ser utilizada na resolução dos sintomas de diversos quadros clínicos como tendinites, bursites, aderências, depósitos de cálcio e dores musculares onde podemos ministrar medicamentos antiinflamatórios, miorrelaxantes, escleróticos, vasodilatadores e analgésicos. Dentre os vários medicamentos de aplicação na resolução de desordens indicadas aos cuidados fisioterápicos, alguns dos mais conhecidos e utilizados são: o diclofenaco, o piroxican, a lidocaína, a dexametasona e a hidrocortisona (BISSHOP et al., 2001; LOW e REED, 2001). Poucos produtos apresentam características apropriadas para a sonoforese, sendo os géis o tipo mais apropriado de formulação para a terapia. As diferentes preparações farmacológicas tópicas apresentam grande variação nos respectivos coeficientes de transmissão. Num estudo experimental apresentado por GUIRRO e GUIRRO (2002),

22 10 o coeficiente de transmissão de diversos produtos foi comparado ao coeficiente de transmissão da água. O Feldene Gel (piroxican) apresentou um índice de transmissão de 108% (em relação ao índice da água) com o US numa frequência de 3MHz; já para uma frequência de 0,75MHz, o índice relativo de transmissão do mesmo produto caiu para 75%. Todos os outros produtos (lidocaína, benzocaína, dexametazona e betametazona) analisados (de acordo com a tabela apresentada em GUIRRO e GUIRRO, 2002) apresentaram porcentagens de transmissão menores que a do piroxican para o US numa frequência de 3MHz. Uma constatação experimental importante diz respeito ao fato de que estas formulações normalmente apresentam maior índice de transmissão para frequências maiores. 1.4 FOTOACÚSTICA CONTEXTO HISTÓRICO O efeito fotoacústico foi descoberto por Alexander Graham Bell em 1880, ao perceber que a incidência de luz modulada em uma superfície sólida em forma de diafragma produzia som. Observando este efeito, Bell mostrou que a intensidade do sinal acústico era influenciada pela absorção da luz pelo material no qual era incidida (BARJA, 1996). Em 1880, Graham Bell reportou pela primeira vez o efeito após ouvir o som gerado numa amostra iluminada por luz solar modulada. Quase um século mais tarde, Rosencwaig e Gersho (1976) publicaram um modelo matemático para descrever o efeito fotoacústico. A técnica fotoacústica utilizava um microfone que captava o aquecimento e esfriamento de uma camada de gás em contato térmico com uma amostra de matéria condensada natural irradiada por uma fonte de luz modulada, e sua aplicação era limitada pela difusão térmica no gás (AUTREY et al, 2001). O efeito fotoacústico consiste basicamente na transformação da radiação absorvida pela amostra em energia térmica por um processo de desexcitação não radiativo (BARJA, 1996).

23 11 A fotoacústica constitui uma opção experimental com diversas aplicações no estudo de propriedades ópticas como a absorção e transmissão de radiação eletromagnética. Na literatura são reportados vários trabalhos teóricos e práticos que demonstram as aplicações espectroscópicas da fotoacústica no campo da física, química, engenharia e também da biologia e medicina. O uso da fotoacústica na dermatologia não é novidade, tendo iniciado em 1977 com Rosencwaig. Os estudos envolvendo aplicação de cosméticos começaram em Neste campo, um dos temas de interesse é a análise do fator de proteção ultra-violeta (UV) dos protetores solares (BERNENGO et al., 1998). Recentemente, a fotoacústica tem sido aplicada numa extensa variedade de campos da medicina. Uma de suas mais importantes possibilidades é a de analisar meios opacos em profundidade, sendo um método não destrutivo que fornece informações tanto qualitativas como quantitativas sobre o material analisado. As propriedades de absorção das moléculas de um material são geralmente obtidas analisando-se a transmissão ou a reflexão óptica do mesmo. O método fotoacústico é particularmente útil no estudo de amostras biológicas cuja análise por técnicas convencionais não se torna possível por causa do excesso de luz espalhada, ou em amostras completamente opacas para transmitir radiação (ROSENCWAIG, 1980). A fotoacústica distingue-se de outras técnicas por permitir a análise de materiais opacos e sistemas biológicos complexos (PUCCETI e LEBLANC, 1996). A camada da amostra estudada por fotoacústica depende da frequência de modulação utilizada (BARJA, 1996). Muitos materiais biológicos alvos de estudos como membranas, amostras ósseas ou estruturas de tecidos são insolúveis e biologicamente possuem função semelhante à de uma matriz sólida, o que dificulta a obtenção de dados ópticos por técnicas convencionais uma vez que solubilizados são significantemente alterados. A espectroscopia fotoacústica possibilita a obtenção de dados ópticos nestes tecidos biológicos intactos e também em amostras opticamente opacas, constituindo assim uma importante ferramenta de pesquisa e de diagnóstico na biologia e medicina (ROSENCWAIG, 1980). Rosencwaig (1980) afirma que, para uma análise fotoacústica apropriada em tecidos biológicos, é preciso ter os dados espectrais do tecido normal dados estes que

24 12 não eram avaliados por métodos convencionais devido ao espalhamento da luz e aos efeitos da opacidade no tecido. Estas dificuldades levaram ao uso da técnica fotoacústica para obtenção de tais dados. Desde então, começou o estudo da epiderme e, em particular, do estrato córneo, com experimentos cujos resultados demonstram a importância potencial da espectroscopia fotoacústica (PAS) em estudos médicos de tecidos humanos (ROSENCWAIG, 1980). Recentemente, Sehn e colaboradores (2003) utilizaram a técnica de espectroscopia fotoacústica para avaliar a penetração de diferentes filtros solares na pele humana in vivo. Medidas preliminares mostram que a espectroscopia fotoacústica pode ser utilizada para monitorar a cinética de desidratação da pele, através da análise do espectro fotoacústico em função do tempo (ROMPE et al, 2003), bem como avaliar a cinética da absorção de radiação no sistema pele + protetor solar (ANJOS et al, 2003) BASE TEÓRICA O efeito fotoacústico consiste na produção de som pela absorção de luz modulada. A energia luminosa modulada é absorvida por uma amostra e convertida em calor, gerando modulação de temperatura; dessa forma, a camada de gás mais próxima da amostra sofre um efeito mecânico de expansão e contração periódicas, atuando como um pistão vibratório no restante do gás dentro da célula fotoacústica. Essas variações de pressão produzidas geram ondas sonoras captadas pelo microfone acoplado à célula (ROSENCWAIG e GERSHO, 1976; BARJA, 1996). A Figura 1, a seguir, mostra o esquema de uma célula fotoacústica semelhante à que foi utilizada no presente estudo. Há vários mecanismos de geração do sinal fotoacústico em sólidos, como: a) difusão térmica; b) expansão térmica; c) flexão termoelástica e d) evolução de gases. No presente estudo, o principal mecanismo a ser considerado é o da difusão térmica.

25 13 Célula Fotoacústica Janela de vidro Luz modulada GÁS Amostra Microfone FIGURA 1 Esquema da célula fotoacústica Na difusão térmica, a radiação eletromagnética modulada é absorvida pela amostra e convertida total ou parcialmente em calor. O calor modulado assim produzido na amostra difunde-se para a camada gasosa dentro da câmara fotoacústica que está em contato com a amostra. De acordo com o modelo de Rosencwaig-Gersho (modelo RG) (ROSENCWAIG e GERSHO, 1976), a camada de gás mais próxima da amostra sofre contração e expansão periódicas, atuando como um pistão vibratório sobre o restante do gás. As variações de pressão assim produzidas geram ondas acústicas captadas pelo microfone no interior da célula fotoacústica. A equação da difusão térmica diz que a variação temporal da quantidade de calor T num volume unitário é igual ao fluxo de calor que atravessa este volume mais a taxa do calor gerado (absorvido) por fontes (sumidouros) neste volume. A equação de difusão térmica é: (1/α) T(r, t)/ t = ² T (r, t) + s(r, t)/ k (1.1) onde α é a difusividade térmica (em cm 2.s -1 ), k é a condutividade térmica (W.cm -1.K -1 ) e o último termo da equação é o chamado termo de fonte.

26 14 As ondas que propagam calor são exponencialmente atenuadas ao longo da distância de propagação. Deste modo, a modulação de temperatura passa a ser desprezível a partir de uma certa profundidade. Define-se esta profundidade como o comprimento de difusão térmica µ, dado por µ = (α/πf) 1/2 (1.2) onde α é a difusividade térmica e f, a frequência de modulação. A partir da equação (1.2), é possível constatar que o comprimento de difusão térmica para uma determinada amostra diminui à medida que a frequência de modulação (da radiação incidente) aumenta. Werner et al (1992) avaliaram a difusividade térmica da epiderme humana seca in vitro estudando a propagação das ondas térmicas em camadas epidérmicas finas para frequências de modulação entre 10Hz e 200Hz. Estes autores mediram a transmissão de calor através da epiderme por meio da geração de ondas térmicas num suporte de cobre colocado em contato com a amostra. Além disso, fizeram medidas com ondas térmicas geradas por absorção de luz modulada numa camada de grafite aplicada à amostra. O resultado obtido para a difusividade térmica da epiderme foi α = 2, cm 2 /s. Adotando o valor acima para a difusividade térmica da pele, obtém-se para a frequência de modulação utilizada (17Hz) um comprimento de difusão térmica de aproximadamente 30µm para a pele. Pode-se classificar uma amostra quanto ao regime térmico comparando sua espessura com o comprimento de difusão térmica. A freqüência de modulação da radiação determinará se a amostra é termicamente fina ou grossa. Isso acontece porque o comprimento de difusão térmica depende da frequência de modulação (eq.1.2). Quanto maior for a frequência de modulação, menor será o comprimento de difusão térmica. Dessa forma, uma amostra é considerada termicamente grossa quando sua espessura ultrapassa o valor de comprimento de difusão térmica gerado por determinada freqüência de modulação; caso contrário, a amostra é considerada termicamente fina. Na maior parte do corpo, a epiderme é delgada, apresentando espessura aproximada menor que 0,12mm (GUIRRO e GUIRRO, 2002). No entanto, pode ser considerada termicamente grossa para a frequência de modulação utilizada em nossas medidas.

27 15 A efusividade térmica (ε ) é um parâmetro físico relevante para estudos que envolvem processos de aquecimento ou resfriamento de uma amostra. Este parâmetro mede essencialmente a impedância da amostra, ou seja, a habilidade da amostra em trocar calor com o meio (BALDERAS-LÓPEZ et al., 1995). A efusividade ε de uma amostra é definida pela equação ε = (kρ c) 1/2 (1.3) onde k, ρ e c são respectivamente condutividade térmica, densidade e calor específico. Em nossa configuração experimental, o antebraço (pulso) é posicionado sobre um disco fino de papel alumínio. O alumínio é opticamente opaco e termicamente fino. Por outro lado, para a amostra (pele), o nível de sinal fotoacústico depende da efusividade térmica da seguinte forma: SINAL PA = Ye fε π / 4 S σ SlS ( b + 1) e ( b 1) σ σ l S S SlS ( g + 1)( b + 1) e ( g 1)( b 1) e e σ l S S (1.4) Na equação acima, Y é um coeficiente que depende exclusivamente das propriedades térmicas da coluna do gás na câmara fotoacústica, f é a frequência de modulação, σ s é o coeficiente complexo de difusão térmica da amostra, l s é a espessura da amostra, b = ε r /ε S (razão entre as efusividades da referência e da amostra) e g = ε g /ε S (razão entre as efusividades do gás e da amostra) (GUTIÉRREZ-JUÁREZ, 2002). Para analisar as propriedades térmicas da pele, precisamos de um modelo de condução de calor para este sistema. Recentemente, Gutiérrez-Juàrez e colaboradores (1998) propuseram um modelo para determinar a efusividade térmica de misturas binárias. Estes autores assumem que a efusividade térmica efetiva comporta-se como a condutividade térmica para um sistema de duas fases. As duas fases que compuseram o sistema foram misturadas aleatoriamente. Isto significa que, se k 1 e k 2 são respectivamente a condutividade dos meios 1 e 2, então a condutividade efetiva do sistema é k = k 1 (k 2 / k 1 ) X (1.5) onde x é a concentração de 1 no meio 2.

28 16 No trabalho de Gutiérrez-Juárez (1998), uma mistura de água e acetona foi usada. Assumindo que (ρ c) 1 e (ρ c) 2 são similares, a efusividade efetiva é obtida por ε = ε 1 (ε 2 / ε 1 ) X (1.6) onde ε 1 e ε 2 são as efusividades da água e da acetona, respectivamente. Em nosso trabalho, um modelo similar de fase dupla como o obtido na equação (1.6) foi usado. Nosso sistema binário foi composto por substância aplicada à pele humana. A absorção relativa de substância através da pele pode ser calculada da equação (1.7). X ln( ε m ε p ) = (1.7) ln( ε ε ) s p onde ε m é a efusividade térmica mensurada, ε p é a efusividade da pele limpa e ε s é a efusividade da substância aplicada. De acordo com o modelo de Gutiérrez-Juárez et al. (1998), as alterações de efusividade térmica refletem a mudança na concentração relativa do produto na pele. No presente trabalho, associamos a mudança no nível do sinal fotoacústico a alterações na efusividade térmica do sistema pele + produto topicamente aplicado e, consequentemente, às mudanças na concentração do produto na pele após a terapia ultra-sônica. Deste modo, pode-se utilizar o sinal fotoacústico para avaliar comparativamente a concentração do produto na pele após diferentes modos de tratamento por sonoforese.

29 17 2. JUSTIFICATIVA A sonoforese é uma técnica que permite administração de medicamentos através da via transdérmica de modo não invasivo. No entanto, é uma metodologia clínica em fisioterapia ainda pouco estudada e de parâmetros subjetivos, com alguns efeitos não totalmente esclarecidos. A fotoacústica é uma técnica que permite a análise de amostras em profundidade e vem apresentando uma crescente evolução no estudo de amostras biológicas in vivo e também in situ de forma não-invasiva. Demonstrar a viabilidade do uso da fotoacústica para melhor descrever a sonoforese configura-se como o início de uma importante integração entre estes campos em função do benefício científico em ambas as áreas.

30 18 3. OBJETIVOS O presente estudo tem por objetivo demonstrar a viabilidade do uso da fotoacústica para avaliar comparativamente a concentração de um produto (Piroxican a 0,5%) na pele após sua administração por sonoforese nos modos contínuo e pulsado do ultra-som e seus efeitos associados.

31 19 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 MATERIAL PARA ANÁLISE FOTOACÚSTICA A montagem fotoacústica utilizada nas medições era composta por: Modulador mecânico (Stanford Research Systems, modelo SR540) Amplificador síncrono (lock-in, Stanford Research Systems, modelo SR530) Espelho odontológico; Lâmpada halógena de tungstênio (XELUX, tipo JC), com fonte alimentadora de 24V, 250W; Fonte alimentadora (LR) de 24V para lâmpada; Ventilador (115V) para lâmpada; Duas lentes Schneider-Kreuznarch, Xenotar 1:2,8/100; Célula fotoacústica fabricada em latão na Oficina Mecânica da UNIVAP; Microfone comercial de eletreto; Discos de alumínio (espessura de 65µm); Microcomputador para aquisição de dados. A montagem experimental encontra-se esquematizada na Figura 2. A luz branca proveniente da lâmpada halógena passa por um modulador mecânico e pelo conjunto de lentes que direciona o feixe até uma das faces da célula fotoacústica. Esta face possui uma janela de vidro de modo que a luz modulada atravessa a câmara e incide sobre a folha de alumínio situada na face oposta. A amostra a ser estudada é colocada sobre a folha de alumínio e o sinal fotoacústico produzido é coletado por um microfone de eletreto situado no interior da célula. O sinal fotoacústico é processado pelo amplificador síncrono, conectado ao modulador mecânico, que informa a frequência de modulação utilizada, e ao computador, onde os dados são arquivados. A montagem fotoacústica utilizada pode ser visualizada na Figura 3.

32 20 LÂMPADA M O D U L A D O R CÉLULA PA MICROCOMPUTADOR AMPLIFICADOR SÍNCRONO FIGURA 2 Esquema da montagem fotoacústica FIGURA 3 Montagem fotoacústica utilizada

33 MATERIAL PARA SONOFORESE Para a realização da sonoforese, utilizou-se o seguinte material: Aparelho gerador de ultra-som terapêutico, marca SONOPULSE III (Ibramed), Brasil; Seringa plástica dosadora descartável; Piroxicam manipulado a 0.5% em gel de carbopol, que contém a mesma formulação do Feldene Gel e que serviu como meio acoplador do cabeçote do US na pele do sujeito. Este é um medicamento anti-inflamatório e/ou analgésico, de uso tópico que atua como um bom transmissor da energia US na frequência de 3MHz. Na Figura 4, vemos o aparelho gerador de ultra-som terapêutico utilizado neste estudo para a realização da sonoforese. FIGURA 4 Aparelho de Ultra-som utilizado (Sonopulse III, Ibramed)

34 METODOLOGIA a) Voluntários: Participaram do estudo três voluntários com idades entre 20 e 24 anos do sexo feminino e de raça branca. Para a participação neste estudos os voluntários deveriam apresentar os seguintes critérios de inclusão: - Estar de acordo com a participação no estudo mediante leitura e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (anexo); - Não apresentar reação alérgica ao medicamento; - Não apresentar patologia associada ao uso do Piroxicam (0,5%) ou a qualquer outro medicamento, para não haver interferência em algum possível tratamento em andamento; - Não apresentar qualquer doença ou desordem gástrica; - Não possuir implantes metálicos na região de estudo ou próximo a esta. b) Ajuste do sinal fotoacústico Inicialmente, era feita a observação do sinal fotoacústico da lâmina de alumínio que vedava a célula fotoacústica através de uma varredura temporal de 50 pontos (correspondente a 25 segundos), numa frequência de 17 Hz com uma sensibilidade de acordo com o nível de sinal. Estas medidas iniciais, realizadas apenas com a folha de alumínio, serviram para observar o nível do sinal fotoacústico e a relação sinal/ruído, permitindo avaliar a eficiência da vedação da câmara fotoacústica. Para uma lâmina de alumínio com espessura de 65µm, a frequência de corte é de aproximadamente 500Hz. Ou seja: para frequências de modulação acima de 500Hz, o sinal dependeria apenas da folha de alumínio. Em nosso caso, utilizamos frequências bem mais baixas, de modo que a folha de alumínio pode ser considerada termicamente fina.

35 23 c) Sonoforese O procedimento descrito a seguir foi realizado num total de três voluntários, sempre pelo mesmo operador. Em cada um dos voluntários, a sonoforese foi ministrada de dois modos com o medicamento veiculado no gel condutor: 1) Modo Contínuo frequência de 3MHz, intensidade de 1W/cm 2, durante um minuto; 2) Modo Pulsado frequência de 3MHz, intensidade de 1W/cm 2 (razão on/off 1:4, equivalendo a uma intensidade média de 0,2W/cm 2 ), durante cinco minutos. Assim, os tempos de aplicação em cada modo foram ajustados de forma a manter a mesma intensidade total em cada aplicação. Foi mantida sempre uma mesma dose de medicamento (8mL) para cada aplicação de sonoforese. A Figura 5 ilustra a aplicação do Piroxicam por sonoforese. FIGURA 5 Exemplo da aplicação do Piroxicam gel a 0.5% por sonoforese no antebraço do voluntário.

36 24 d) Grupo controle Três grupos de medidas controle foram estabelecidos para melhor entendimento e análise dos dados obtidos na terapia por sonoforese: 1) Análise fotoacústica do braço limpo: região ventral da porção medial do antebraço; 2) US placebo do modo contínuo. Neste grupo o medicamento foi espalhado sobre a superfície no mesmo local do antebraço descrito previamente, utilizando-se o cabeçote com o UST desligado durante um minuto; 3) US placebo do modo pulsado. O medicamento foi espalhado sobre a superfície no mesmo local do antebraço descrito previamente, utilizando-se o cabeçote com o UST desligado durante cinco minutos. Os dois grupos de US placebo foram ministrados para uma discriminação entre os efeitos da sonoforese e os efeitos do tempo de fricção do cabeçote na pele sobre a penetração do medicamento. e) Coleta do sinal fotoacústico Durante as medições, o antebraço era pressionado contra a face externa da folha de alumínio que vedava a célula fotoacústica, mantida na posição vertical. A face interna do alumínio, pintada de preto para aumentar a absorção luminosa, ficava voltada para o interior da célula. A Figura 6 ilustra o posicionamento do antebraço durante as medições.

37 25 FIGURA 6 Antebraço limpo em contato com a célula fotoacústica (posição mantida durante as medições). A primeira etapa de coleta pode ser dividida em quatro fases. Inicialmente, obteve-se o sinal fotoacústico da lâmina de alumínio; em seguida, sob os mesmos parâmetros de coleta, foi obtido o sinal do antebraço limpo sobre a lâmina; após esta coleta, o sujeito foi submetido a sonoforese no modo contínuo e imediatamente após este procedimento o antebraço foi pressionado contra a folha de alumínio que vedava a célula fotoacústica para coleta do sinal fotoacústico. Na última fase, o sujeito sofreu a sonoforese no modo pulsado e imediatamente após este procedimento o antebraço foi situado na célula (sobre o alumínio) para a coleta do sinal. Na segunda etapa de coleta, o voluntário foi submetido ao que denominamos de US-placebo. Nesta etapa o medicamento foi aplicado topicamente no antebraço (com movimentos circulares) utilizando-se a fricção com o cabecote do US (simulando a aplicação por sonoforese) durante um minuto (US-placebo contínuo ) e logo em seguida foi coletado o sinal fotoacústico da região onde foi aplicado o medicamento.

38 26 O mesmo procedimento foi utilizado para o US-placebo pulsado (aplicação com duração de 5 minutos). Imediatamente após as aplicações do medicamento (tanto por sonoforese quanto por US-placebo) e imediatamente antes das coletas do sinal fotoacústico o excesso do gel foi cuidadosamente retirado do antebraço com papel toalha embebido em álcool. Esta medida garantiu que o sinal coletado fosse proveniente da pele e não de uma provável camada do medicamento sobreposta ao tecido. Cada voluntário foi submetido a uma série de doze aplicações do medicamento em cada modalidade (contínuo, pulsado, US-placebo/1min e US-placebo/5min) e às respectivas coletas do sinal fotoacústico após cada uma das aplicações. O sinal fotoacústico foi coletado sempre numa frequência de 17Hz, em um tempo de 25 segundos, a uma taxa de 2 pontos/segundo, e com o amplificador síncrono ajustado para a sensibilidade de 10mV. As medidas do sinal fotoacústico foram feitas em função do tempo. O sinal era coletado pelo amplificador síncrono e enviado ao microcomputador para arquivo e tratamento estatístico dos dados, posteriormente analisados com o auxílio do programa Microcal Origin 6.0.