UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DIFERENTES SOLUÇÕES A BASE DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO Eduardo José Guerra Seabra Natal\RN 2008

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DIFERENTES SOLUÇÕES A BASE DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO Eduardo José Guerra Seabra NATAL 2008

3 Divisão de Serviços Técnicos Catalogação da Publicação na Fonte UFRN/Biblioteca Setorial de Odontologia Seabra, Eduardo José Guerra. Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana de diferentes soluções a base de hidróxido de cálcio. Eduardo José Guerra Seabra Natal, RN, p Orientador: Antonio de Lisboa Lopes Costa. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde - UFRN. 1. Hidróxido de cálcio Tese. 2. HCT20 Tese. 3. Controle químico do biofilme dental Tese. 4. Clorexidina Tese. 5. Odontologia Tese. 6. Periodontia. Tese. I. Costa, Antonio Lisboa Lopes da. II. Título. RN/UF/BSO Black D 64

4 DEDICATÓRIA A morte de um professor equivale ao incêndio de uma biblioteca. Ele não só se vai, mas leva consigo acúmulo de conhecimentos capazes de iluminar gerações de estudantes e profissionais. Dizer africano. O professor, e grande cientista, Sérgio Valmor Barbosa pode até ter levado algumas chaves importantes para os caminhos da ciência. Mas, certamente, deixou àqueles que souberam apreciá-lo e observá-lo princípios, curiosidades e inquietudes. Valores estes primordiais à docência, bem como a alma de cientista essencial a um bom pesquisador. Que os princípios deixados por este grande homem perpetuem através de seus orientados e seguidores. Como eu, que tive a honra de ser orientado por ele no mestrado e grande parte do doutoramento. Este trabalho, pela sua própria essência, não existiria se não fosse a mente brilhante de Sérgio Valmor Barbosa. Fazendo alusão aos escritos sagrados, Matuzalém foi um homem que viveu por 900 anos mais ou menos. Qual o seu legado? Deixou filhos e filhas. Já Moisés não viveu mais que 50 anos. Mas certamente a Bíblia seria diferente não fosse sua existência e sua obra. O professor Sérgio Valmor trilhou seu caminho estando sempre mais para Moisés que para Matuzalém. Enfim, qualquer atitude diferente de dedicar 100% da realização desta etapa da minha vida profissional a Sérgio Valmor faria com que eu me sentisse desprestigiando sua importância não só para a minha formação, mas também a relevância que ele para a ciência da Odontologia, com toda a sua obra real e palpável. iv

5 AGRADECIMENTOS Esta é a parte mais difícil do trabalho, pois a responsabilidade de não cometer nenhuma injustiça é enorme. E isso faz com que a gente fique por vários minutos simplesmente olhando para a tela do computador, na vil esperança que ela nos tire deste perrengue. Todas as pessoas que são ou que foram importantes para a minha vida, seja a profissional ou a pessoal sintam-se sincera e humildemente abraçadas e reverenciadas por mim. A minha família merece sempre um carinho e atenção especiais de agradecimentos. Meus pais: Eduardo e Zélia; esposa: Isabela; filhos: Gabriel e Maria Eduarda. Deus os abençoe e nos ajude a construir nossos caminhos. Amém. Agradecimentos especiais aos professores Kênio Costa Lima pela construção e execução de grande parte deste projeto. Ao professor Antonio de Lisboa Lopes Costa, pelo desprendimento e presteza mostrados ao assumir a continuidade deste trabalho, mesmo com todos os seus afazeres, o meu agradecimento só é menor que minha reverência. Quero agradecer também a todas as pessoas importantes na minha vida profissional, onde para não citar todos e certamente esquecer alguém, represento-os com muita propriedade na pessoa da professora Auxiliadora Nesi, que sempre foi tão amiga e me acolheu tão bem, como lhe é peculiar, na carreira docente. Finalmente, agradeço à UFRN, por ter me dado oportunidade de trilhar toda a espinha dorsal do caminho acadêmico nas suas dependências estruturais e cerebrais (professores): graduação, mestrado e doutorado. v

6 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Fase 1 - medição dos halos de inibição de crescimento bacteriano por solução teste. Medição e média em milímetros p.19 Tabela 2- Fase 1 desempenho das soluções em valores de halos de inibição mínimos, máximos e mediana p.20 Tabela 3- Fase 2 número de unidades formadoras de colônias (UFC s) em log de 10 para S. sanguis p.21 Tabela 4- Fase 2 número de unidades formadoras de colônias (UFC s) em log de 10 para S. mutans p.21 Tabela 5- Fase 2 número de unidades formadoras de colônias (UFC s) em log de 10 para S. sobrinus p.22 vi

7 RESUMO Na busca pela ciência odontológica de se chegar ao composto que possa ser considerado o agente ideal para o controle químico do biofilme dental foi idealizado este estudo. Avaliou-se a capacidade antimicrobiana in vitro de diferentes soluções a base de hidróxido de cálcio e tergentol partindo em princípio do HCT 20, solução irrigadora dos canais radiculares composta por 80% da solução saturada de hidróxido de cálcio (água de cal) e 20% do detergente tergentol buscando verificar sua possível indicação como solução para bochechos, visando prevenção ou combate a doenças como cárie dentária e doença periodontal. No laboratório de microbiologia do Departamento de Odontologia da UFRN, foram realizados testes em discos de antibiograma para os microrganismos: Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei. Bem como em bactérias formadoras de biofilme para os mesmos, à exceção do L. casei. Estipulou-se diferentes concentrações de tergentol para a água de cal, além do tergentol em água destilada, usou-se digluconato de clorexidina a 0,12% como controle positivo e água destilada como controle negativo. Os resultados mostraram desempenho inferior das soluções a base de Ca(OH) 2 em relação à clorexidina frente a estes microrganismos e à metodologia empregada, direcionando pois, para a não indicação do uso do HCT 20 como colutório bucal. PALAVRAS-CHAVE Hidróxido de cálcio; HCT 20; Controle químico do biofilme dental; Odontologia vii

8 SUMÁRIO Dedicatória... iv Lista de tabelas... vi Resumo... vii 1- INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ABSTRACT... 41

9 1- INTRODUÇÃO A cavidade oral é naturalmente sítio para vários tipos microbianos, que, quando organizados e estruturados compõem a flora oral. As bactérias presentes na boca são as principais causadoras de duas das patologias mais comuns; cárie dentária e doença periodontal. Pode-se afirmar seguramente que o controle da placa bacteriana ou biofilme dental tem importância ímpar na prevenção, cura e controle destas doenças. Tal controle pode ser realizado mecanicamente ou por intermédio de substâncias químicas. O HCT 20 (80% de água de cal + 20% de tergentol) é uma solução irrigadora dos canais radiculares desenvolvida por Barbosa em 1984.Tal substância vem sendo usada desde então, com bastante sucesso clínico na desinfecção dos canais radiculares por ser dotada de boas propriedades antimicrobianas, de biocompatibilidade e de tensão superficial atestadas 1, 2, 3. Trata-se de uma solução composta na proporção de 0,2g de hidróxido de cálcio P.A. (pró-análise), 80 ml de água destilada e 20 ml de detergente Tergentol (lauril-dietileno-glicol-éter-sulfato de sódio) a 0,125%. Sua concepção teve o intuito de ser uma efetiva solução irrigadora dos canais radiculares, sendo usada desde então com larga margem de sucesso clínico neste sentido. Ensaios clínicos foram realizado com o HCT 20 introduzindo o seu uso sob a forma de bochechos 29, 30, 31. Comparativos clínicos entre o HCT 20 e a clorexidina em pacientes com gengivite e periodontite no qual foram obtidos com as duas drogas índices de redução de placa bacteriana estatisticamente similares. 1

10 A capacidade antimicrobiana do HCT 20 deve-se ao Hidróxido de cálcio, 1, 2, 3, uma substância que tem poder bactericida como atestam alguns trabalhos 12, 29, 30, 31. A ação do tergentol nesta solução tem vital importância para o seu desempenho. O detergente atua como tensoativo aumentando a capacidade de difusão da solução no interior da massa microbiana organizada incrementando, assim, sua ação anti-séptica. A presente pesquisa visou: estudar diferentes concentrações de HCT como antimicrobianos; confirmar o potencial antimicrobiano desta solução (HCT 20); avaliar o potencial de uso do HCT 20 como solução para bochechos. Para tanto, desenvolveu-se um estudo comparativo entre HCT 20 com sabor e sem sabor e a clorexidina in vitro. Partiu-se então do princípio básico de que nem sempre, com o tratamento convencional e boa orientação sobre higiene bucal, os Cirurgiões- Dentistas conseguem devolver e/ou manter as condições de saúde ao paciente. Nestas situações (entre outras), está indicado o controle químico da placa. Como não está disponível no mercado aquilo que se poderia chamar de agente químico ideal, ou seja, uma substância que possua excelente capacidade bactericida com especificidade para microrganismos patogênicos, ao mesmo tempo em que não exerça qualquer efeito danoso sobre os tecidos moles e/ou duros da cavidade bucal (propriedade denominada toxicidade seletiva), justifica-se a continuidade dos estudos sobre o controle químico do biofilme dental. 2

11 Pesquisar a ação antimicrobiana do HCT 20 e outras concentrações de soluções a base de hidróxido de cálcio e tergentol frente a bactérias colonizadoras iniciais da cavidade bucal e cariogênicas em testes microbiológicos diferentes visando contribuir para o estudo dos agentes químicos para controle do biofilme dental vem a ser, basicamente, o que este trabalho se propõe. Para propiciar ratificação dos testes com as soluções em análise, optouse pelo uso, com a mesma metodologia, do digluconato de clorexidina a 0,12% como controle positivo por ser esta solução bastante utilizada em Odontologia com eficácia microbiológica e clínica comprovada, e da água destilada como controle negativo. Finalmente, por meio da comparação entre os resultados, torna-se possível uma avaliação fidedigna sobre o potencial do HCT 20 como agente anti-placa, bem como o do seu uso em solução para bochechos e o objetivo deste trabalho é avaliar através de testes microbiológicos in vitro o potencial do HCT 20 como uma substância capaz de ser utilizada como colutório bucal na forma de solução para bochechos. 3

12 2- REVISÃO DA LITERATURA É sabido que as patologias mais prevalentes na cavidade oral em humanos são: cárie e doença periodontal. Tais condições são provocadas por desequilíbrio no biofilme dental associado a diversos outros fatores. Logo, é de extrema importância a manutenção da microflora contida na cavidade bucal em níveis compatíveis com a saúde 30, 31. O ambiente exerce ação direta sobre o comportamento da microbiota residente no biofilme dental. Qualquer alteração, que pode ser proveniente de fatores como dieta cariogênica, queda na higienização ou até mesmo o uso de agentes químicos antimicrobianos pode resultar em alterações clínicas nos tecidos do hospedeiro 25. Ao longo dos anos tem havido constante preocupação de pesquisadores no tocante às drogas usadas para o controle químico da placa bacteriana e, com isso, existe grande diversidade de estudos a esse respeito. Principalmente em se tratando da eficácia como antimicrobianos e a toxicidade das soluções 30. Várias substâncias têm sido desenvolvidas e\ou aplicadas para este fim. No entanto, o digluconato de clorexidina é o composto químico que mais se destaca para o controle do biofilme dental 6, 9, 10, 11, 24. Desde que foi sintetizada em laboratório por Davies em 1954, a clorexidina tem sido bastante estudada 10. Suas formas mais frequentemente encontradas são gluconato e digluconato. Relatos 10, 26 afirmam que o digluconato é mais indicado, pois tem maior solubilidade em água e, em ph fisiológico, dissocia-se liberando o componente catiônico. 4

13 A clorexidina é um agente catiônico, uma biguanidina que tem ação sobre bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras. É estável, e apresenta como característica principal a substantividade, ou seja, tempo de permanência ativa na cavidade bucal de aproximadamente 12 horas 26. A clorexidina tem afinidade pela célula bacteriana provavelmente devido à interação entre sua molécula carregada positivamente e a parede celular carregada negativamente (principalmente pelos grupos fosfato). Esta interação aumenta a permeabilidade da parede celular e permite que o agente antimicrobiano penetre no citoplasma e provoque a morte do microrganismo 10. Este mesmo trabalho conclui que: entre as substâncias químicas existentes, a clorexidina é a que melhor inibe o desenvolvimento da placa subgengival sendo, portanto, a droga mais efetiva no controle químico da placa bacteriana. A clorexidina parece ser o mais efetivo agente para redução de placa bacteriana e gengivite podendo conseguir redução de até 60% nos índices de placa bacteriana 27. A ação da clorexidina é descrita como atuando na formação da película adquirida, alterando a adsorção bacteriana às superfícies e sobre microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos aumentando a permeabilidade da membrana e conseqüente rompimento celular ou coagulação e precipitação de seus constituintes citoplasmáticos levando à diminuição significativa na placa bacteriana 26. 5

14 A clorexidina, por possuir eficácia comprovada tem sido grandemente estudada nos últimos anos, constitui-se no padrão-ouro, quando se deseja fazer comparações com outros compostos anti-sépticos 6, 9, 10, 11, 17, 25, 26, 27. O HCT 20, solução composta na proporção de 80 ml de água de cal para 20 ml de detergente tergentol lauril-dietileno-glicol-éter-sulfato de sódio a 0,125% tem sido usada com bastante sucesso como solução irrigadora em Endodontia por ser dotada de boas propriedades antimicrobianas, de ph e de tensão superficial 1, 2, 3, 29, 30, 31, 39. A capacidade antimicrobiana do HCT 20 deve-se ao Hidróxido de cálcio, que é uma substância que tem poder bactericida confirmado por vários estudos 12, 13, 19, 23, 32, 34 e pode ser explicado resumidamente em seu ph, em torno de 12 a 13 (o ph do HCT 20 é 10,8), ser considerado incompatível com germes patógenos orais; e também na penetração de íons cálcio no interior da célula bacteriana inviabilizando seu metabolismo e provocando, por conseguinte a morte celular. A ação do tergentol nesta solução tem vital importância para o seu bom desempenho antimicrobiano. É que um detergente, quando adicionado a qualquer solução provoca diminuição da sua tensão superficial 16, o que acarreta em maior capacidade de difusão desta no interior da massa microbiana organizada com conseqüente maior velocidade no desenvolvimento de sua ação antisséptica. O HCT 20 mostrou-se eficaz em estudos in vitro para microrganismos como a Cândida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Bacillus subtillis 15. Mas estes organismos não são considerados importantes no início da cárie e a doença periodontal. 6

15 Em , uma extensa revista da literatura sobre hidróxido de cálcio reportou vários aspectos sobre este composto desde que este teve seu uso para tratamento da polpa dental por Herman em 1920 em virtude da detecção de sua capacidade de estimular a mineralização associada a um poder antimicrobiano, o que conferia ao Ca(OH) 2 uma possibilidade de vir a ter sucesso como medicação endodôntica. A frente benéfica de ação do hidróxido de cálcio de interesse para este estudo é sua capacidade antimicrobiana. Afirma-se que o ph influi na atividade enzimática de bactérias anaeróbias. Acredita-se que a hidroxila dissociada do Ca(OH) 2 desenvolve ação na membrana plasmática bacteriana devido a enzimas localizadas na mesma. A membrana responde por funções essenciais do metabolismo bacteriano, tais como: divisão e crescimento celular, estágio final da formação da parede celular e transporte de íons. O ph da membrana plasmática é alterado pela alta concentração de íons hidroxila do hidróxido de cálcio que promove a desnaturação de proteínas da membrana. O alto ph do Ca(OH) 2 altera a parede celular e membrana plasmática bacteriana prejudicando componentes orgânicos e transporte de nutrientes. Com propriedades importantes como a permeabilidade seletiva alteradas, a bactéria não tem condições de sobreviver 1, 2, 3, 12, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 23, 29, 30, 31, 32, 35, 39. Considerando que a liberação de íons hidroxila pelo hidróxido de cálcio é essencial ao processo antimicrobiano, é importante que se use veículos que favoreçam a rápida dissociação iônica, e ainda mantenham o ph alto do Ca(OH) 2 durante o período de atividade 11, 12, 13. 7

16 Um trabalho clássico de 1927 já afirmava que o efeito de um germicida sobre uma célula bacteriana é dependente da razão de difusão do mesmo através da membrana celular. Se a tensão superficial de uma solução é diminuída pela adição de um tensoativo, ainda que este redutor de tensão não seja dotado de qualquer ação anti-séptica, vai fazer com que um número muito maior de moléculas do germicida se difunda na célula num mesmo intervalo de tempo. Ou seja, a diluição de um germicida que era totalmente ineficaz em cinco minutos, pode fazê-lo tornar-se completamente eficiente em apenas dois minutos, meramente pela adição do redutor de tensão superficial 16. Um bom método para se conseguir abaixamento na tensão superficial em líquidos (como a solução saturada de hidróxido de cálcio-água de cal), é a adição de detergente à sua composição 14, 16, 19. Estes trabalhos conceituam detergentes como sendo substâncias que diminuem a tensão superficial dos líquidos, aumentando o poder de penetração. Tensão superficial é conceituada como a força existente entre superfícies moleculares que propicia que uma porção de líquido se espraie ou se concentre quando aplicada em uma superfície. Este fenômeno depende do valor de forças coesivas (forças de atração que resultam de forças que moléculas de um líquido exercem entre elas) e forças adesivas (forças que moléculas de uma superfície exercem quando em contato com um líquido) 14, 16, 19. 1, 2, 3, A adição do detergente tergentol à solução de hidróxido de cálcio na proporção de 20% (HCT 20) leva à diminuição no tempo que esta solução necessita para desencadear sua ação antimicrobiana 1. E que isto deveria 8

17 ocorrer por algum mecanismo que envolva o potencial de superfície e a constituição da membrana da célula bacteriana 1, 2, 3. Afirma também que ao se adicionar um agente tensoativo na solução saturada de hidróxido de cálcio pode-se aumentar a sua ação anti-séptica e de limpeza. Mediu-se a tensão superficial do hidróxido de cálcio associado a diferentes substâncias, entre as quais o digluconato de clorexidina e o detergente sulfato éter lauril sódio 3%. E foi justamente a associação com o detergente aniônico que resultou na mais baixa tensão superficial 12. Um estudo microbiológico in vitro envolvendo a solução aquosa de hidróxido de cálcio a 2% avaliou positivamente sua potencial capacidade antimicrobiana frente a 30 microrganismos diferentes (Gram-positivos e Gramnegativos) 20. Avaliou-se o HCT 20 como agente anti-placa 29 usando estudantes de Odontologia e pacientes. Nesse estudo, comparou-se o HCT 20 com o digluconato de clorexidina a 0,2% como redutores do índice de placa bacteriana de Löe e Silness, e obtiveram melhores resultados com o HCT 20. Em avaliação comparativa em indivíduos portadores de gengivite e periodontite crônicas 30, a capacidade de redução do índice de Löe e Silness de placa bacteriana com digluconato de clorexidina a 0,12% ou HCT 20 e encontrou como resultado a equivalência estatística entre os níveis de redução do índice de placa entre as duas soluções. 9

18 3- METODOLOGIA A atividade experimental desta pesquisa desencadeou-se no laboratório de microbiologia do Departamento de Odontologia da UFRN Determinação da Concentração Inibitória Mínima Tergentol/ água de cal. A etapa primeira deste trabalho teve como objetivo fundamental determinar a concentração inibitória mínima para a associação hidróxido de cálcio + tergentol. Este estudo realizou-se da seguinte maneira: confeccionouse em farmácia de manipulação amostras com concentrações diferentes de tergentol na solução saturada de hidróxido de cálcio (água de cal) onde se chamou estas soluções teste de HCT 5, HCT 10, HCT 20, HCT 30 e HCT 40, digluconato de clorexidina a 0,12%, Tergentol e água destilada. Os números para o HCT: 5, 10, 20, 30 e 40 representam a proporção de tergentol na solução de água de cal, onde se procurou determinar que diluição da solução a base de Ca(OH) 2 em tergentol ( lauril-dietileno-éter-sulfato de sódio a 0,125%) propiciaria melhor ação antimicrobiana (concentração inibitória mínima). Sendo que, para se descartar a ação do tergentol, optou-se pelo uso de uma solução-teste com este detergente. A todas as soluções foi acrescentado o flavorizante Aniz. Destes frascos, foram removidos os rótulos de identificação e trocados por uma numeração pré-definida por sorteio de 1 a 9 com o objetivo de quem 10

19 estiver manuseando as soluções não saber com que solução se estaria trabalhando (estudo tipo cego). A aleatorização para esta primeira etapa resultou na seguinte ordem: - Solução 1: HCT 20 + flavorizante Aniz; - Solução 2: HCT 10 + flavorizante Aniz; - Solução 3: HCT 40 + flavorizante Aniz; - Solução 4: HCT 20 convencional ( sem flavorizante ); - Solução 5: Água destilada + flavorizante Aniz; - Solução 6: HCT 5 + flavorizante Aniz; - Solução 7: Tergentol + flavorizante Aniz; - Solução 8: Digluconato de clorexidina a 0,12% + flavorizante Aniz; - HCT 30 + flavorizante Aniz. A primeira etapa deste estudo se constituiu na verificação da atividade antimicrobiana através do teste de difusão em ágar. Foram ativadas 04 cepas bacterianas de estoque: Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei. A ativação bacteriana realizou-se em meio de cultura Brain Heart Infusion (BHI-ágar)-(Difco-Detroit-Michigan) com as referidas bactérias incubadas em caldo a 37 o C por 48 horas em condições de anaerobiose. As cepas foram semeadas em placas de Petri com auxílio de Swabs estéreis por esgotamento. Em seguida, discos de antibiograma estéreis, cada um com 6 milímetros de diâmetro foram embebidos com as soluções teste e dispostos de um modo eqüidistante nas placas com o meio de cultura para 11

20 posterior verificação dos halos de inibição promovidos por cada solução teste em milímetros. Foi necessário 0,25 ml de solução para saturar cada disco. Após este processo, é preciso que se promova condições de anaerobiose para o crescimento bacteriano em toda a placa semeada. A anaerobiose foi conseguida através de jarras de Gaspak a 37 o C por 48 horas para posterior mensuração dos halos de inibição. Objetivando a redução da variabilidade e obtenção de resultados precisos, o experimento foi feito em triplicata para cada microrganismo e solução, exceto o L. casei, que foi realizado em duplicata. O valor dos diâmetros dos halos de inibição foi dado pela média aritmética tirada a partir da soma dos maiores diâmetros de cada halo obtido nas três repetições. O desenho esquemático a seguir ilustra a conformação desta etapa do experimento. PLACA DE PETRI COM O MEIO DE CULTURA DISCO DE ANTIBIOGRAMA + SOLUÇÃO TESTE 3,2- Verificação da atividade antimicrobiana em microrganismos formadores de biofilme. A segunda fase do trabalho, também in vitro, ocorreu da seguinte maneira: as mesmas soluções teste da etapa anterior foram confeccionadas e 12

21 novamente distribuídas aleatoriamente e numeradas de 1 a 9. O meio de cultura foi o mesmo da etapa anterior e as cepas bacterianas, exceto o L. casei por não ser um microrganismo formador de biofilme, foram também as mesmas. O que diferiu foi o fato das bactérias terem sido usadas para testar a ação do HCT 20 em biofilme bacteriano. Estes biofilmes foram produzidos de acordo com o modelo proposto por Thrower e Pinney & Wilson, onde os biofilmes são produzidos em membranas de filtro de nitrato de celulose de 13 milímetros de diâmetro com 0,22 micrômetros de diâmetro do poro (Milipore Corp., New York- NY). Cada membrana foi colocada em placas de Petri com meios de cultura com as cepas de estoque para crescimento bacteriano. Esta fase do experimento também se desencadeou em triplicata para cada microrganismo e para cada solução-teste. A aleatorização das soluções para esta fase da pesquisa foi a seguinte: - Solução 1: Clorexidina + flavorizante Aniz; - Solução 2: Tergantol + flavorizante Aniz; - Solução 3: HCT 5 + flavorizante Aniz; - Solução 4: Água destilada + flavorizante Aniz; - Solução 5: HCT 10 + flavorizante Aniz; - Solução 6: HCT 20 sem flavorizante; - Solução 7: HCT 20 + flavorizante Aniz; - Solução 8: HCT 30 + flavorizante Aniz; - Solução 9: HCT 40 + flavorizante Aniz. Após 48 horas, cada biofilme (3 membranas) foi transferido da cultura para um recipiente contendo 10 ml de cada solução testada. Os biofilmes 13

22 permaneceram em contato com estas soluções por 1 minuto, simulando assim a duração de um bochecho com antisséptico. Após a permanência do biofilme em contato com a solução pelo tempo determinado (1 minuto), cada um foi então, transferido para um recipiente contendo 10 ml de água deionizada estéril e homogeneizado em vibrador vortex por 1 minuto para ressuspender os microrganismos. Então, transferiuse 1 ml desta suspensão resultante para 9 ml de solução salina redutora estéril, quando foi diluída. O número de microrganismos foi determinado em placas de Petri com meio de cultura ( ágar BHI + 5% de sangue desfibrinado de carneiro, incubadas em anaerobiose por 48 horas a 37 graus Celcius). Foi contado o número de microrganismos para verificar se foram perdidas células dos biofilmes controle. Ao final deste processo, foi determinada a média do número de unidades formadoras de colônias (UFC) de todos os biofilmes submetidos a cada produto e suas diluições Análise Estatística Os testes estatísticos utilizados neste experimento foram o teste de Kruskal-Wallis para a primeira etapa e o pós-teste de comparação múltipla de Dunn. Os dados obtidos foram enfim, analisados estatisticamente para a tabulação dos resultados com suas respectivas médias, valores de p e desviospadrões. 14

23 Para a etapa dos discos de antibiograma, os valores importantes a serem levantados eram a média aritmética dos halos de inibição em milímetros, bem como a mediana, o valor mínimo e máximo destes halos e o valor de p dado pelo teste de Kruskal-Wallis deveria ser menor que 0,05. Na etapa dos testes em microrganismos formadores de biofilme, o número de unidades formadoras de colônias para os diferentes tratamentos nos vários tempos, para serem apresentados, foi transformado em logaritmo de base 10, para reduzir a variabilidade dos dados microbianos. Levou-se em consideração também os valores mínimo, máximo e a mediana do número de Unidades Formadoras de Colônias obtidos com cada solução. 15

24 4- RESULTADOS Na fase de estudos realizados com discos de antibiograma em placas de Petri, a medição dos halos de inibição provocados pelas soluções testadas obteve os valores expressos na tabela 1. Ela representa as três medições em milímetros dos halos de inibição de crescimento microbiano provocados por cada solução teste, seguidos da média aritmética destas medidas. A tabela 1 da fase 1 deste experimento se apresenta na página a seguir. 16

25 Tabela 1- Fase 1: valores dos halos de inibição das soluções frente aos microrganismos testados e média aritmética. Solução S. mutans Média S. sanguis Média S. sobrinus Média L. casei Média HCT , , , ,0 Aniz 2 HCT , , , ,0 Aniz 3 HCT , , , ,0 Aniz 4 HCT , , , ,0 5 Água Destil. + Aniz , , , ,0 6 HCT , , , ,0 Aniz 7 Tergentol , , , ,6 Aniz 8 Clor , , , ,0 Aniz 9 HCT 30 + Aniz , , , ,0 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde-UFRN

26 A seguir, a tabela 2 da fase 1 mostra o desempenho das soluções em valores de halos de inibição mínimos, máximos e mediana ( em milímetros). Tabela 2- Fase 1: valores de halos de inibição mínimos, máximos e mediana ( em milímetros). Solução Medições Mediana Valor mínimo de halo inibitório Valor máximo de halo inibitório 1 HCT 20 + Aniz HCT 10 + Aniz HCT 40 + Aniz Água destilada Aniz 5 HCT 5 + Aniz Tergentol + Aniz Clorexidina + Aniz HCT 30 + Aniz HCT Fonte: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde-UFRN Para consubstanciar estes dados, aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis. O valor de p obtido foi inferior a 0,0001 para todas as bactérias juntas, sendo considerado então, extremamente significante. No teste com o biofilme, aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis o pós-teste de Comparação Múltipla de Dunn. Os resultados são expostos nas tabelas a seguir. 18

27 Tabela 3- Fase 2 log de 10 Para S sanguis: número de unidades formadoras de colônias (UFC) em Solução Teste de Dunn Mediana Mínimo Máximo Valor de p 1 Clorexidina + A Aniz 2 Tergentol + Aniz B HCT 5 + Aniz A,B Água destilada + A,B ,0016 Aniz 5 HCT 10 + Aniz A,B HCT 20 A,B HCT 20 + Aniz A,B HCT 30 + Aniz A,B HCT 40 + Aniz A,B Fonte: Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde- UFRN Tabela 4- Fase 2 log de 10. Para S mutans: número de unidades formadoras de colônias (UFC) em Solução Teste de Mediana Mínimo Máximo Valor de Dunn p 1 Clorexidina + Aniz A Tergentol + Aniz B HCT 5 + Aniz B Água destilada + A,B Aniz 0, HCT 10 + Aniz A,B HCT 20 A,B HCT 20 + Aniz A,B HCT 30 + Aniz A,B HCT 40 + Aniz A,B Fonte: Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde- UFRN

28 Tabela 5- Fase 2 log de 10 Para S. sobrinus: número de unidades formadoras de colônias (UFC) em Solução Teste de Dunn Mediana Mínimo Máximo Valor de p 1 Clorexidina + Aniz A Tergentol + Aniz A,B HCT 5 + Aniz A,B Água destilada + A,B Aniz 0, HCT 10 + Aniz A,B HCT 20 A,B HCT 20 + Aniz B HCT 30 + Aniz A,B HCT 40 + Aniz A,B Fonte: Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde- UFRN

29 5- DISCUSSÃO O que se observou na primeira análise deste experimento foi uma grande discrepância positiva da ação antimicrobiana da clorexidina frente a todas as concentrações de HCT. Também chamou atenção o desempenho do tergentol isoladamente ter sido melhor que o do HCT 20 principalmente. Isso porque o HCT 20 é a solução que realmente estava sendo testada neste experimento em virtude de ser um composto químico que já possui vida clínica em Endodontia e alguns trabalhos apontarem boa capacidade antimicrobiana 1, 2, 3, 6, 10, 23, 24, 25. No tocante à efetividade da clorexidina, os resultados da primeira fase deste trabalho (discos de antibiograma) são plenamente condizentes com o que a literatura mostra de maneira bastante vasta sobre esta droga 5, 7, 8, 9, 14, 20, 29, 30. Isto corrobora para que se ateste veracidade a esta metodologia. A clorexidina foi utilizada nesta pesquisa justamente por se tratar de um composto amplamente estudado e aprovado em testes in vitro e in vivo, sendo a mesma até considerada como padrão-ouro para testes comparativos quando se deseja testar novas e\ou outras soluções 9. Em relação à fase 2 desta pesquisa (mais especificamente à tabela 4), qualquer teste que se promova usando Streptococcus mutans já remete a uma maior atenção devido ao seu poder acidogênico considerável, característica esta que, somada a outras, confere à esta bactéria grande importância na etiopatogenia da cárie dental. 21

30 O teste mostrou extrema eficácia da clorexidina frente a este microrganismo, enquanto que as demais soluções apresentaram desempenho estatisticamente semelhante, com ligeira vantagem para o HCT 30 e o HCT 40. Para os testes realizados com o S. sobrinus, todas as soluções testadas obtiveram desempenho estatístico bastante semelhante, com resultados sutilmente melhores do tergentol frente aos outros compostos. Para S. sanguis (tabela 3), pode-se observar que todas as soluções obtiveram desempenho estatisticamente semelhante, sendo que o digluconato de clorexidina a 0,12% apresentou constância entre as três amostras com média ligeiramente menor de número de UFC s em relação às demais, porém sem significado estatístico. Estes dados poderiam conferir ao HCT 20, o status de agente antimicrobiano em nível semelhante ao da clorexidina (para S. sanguis). Baseando-se na literatura, de maneira geral, os achados deste experimento se confrontam com as demais pesquisas sobre o HCT 20. Ao longo deste capítulo será discorrido detalhadamente sobre esta pesquisa em relação à literatura. Deixando-se bem claro que foram estudos com metodologias diferentes 1, 2, 3, 8, 21, 30, 31, 39. Em primeiro lugar faz-se necessário que se explane toda a idéia sobre o desenvolvimento do HCT 20, bem como, a possibilidade de seu uso como colutório bucal. 22

31 O HCT 20 foi desenvolvido e descrito por BARBOSA, em Os princípios que nortearam tal desenvolvimento serão colocados e discutidos a seguir 1, 2, 3. Partiu-se inicialmente de achados praticamente consensuais da literatura ao longo da história que atestam duas grandes características do Hidróxido de Cálcio em sua forma pró-análise (P.A.), que são a biocompatibilidade e a capacidade antimicrobiana, além do ph 1, 2, 3, 11, 12, 13, 14, 15, 19, 20, 23, 29, 30, 31, 32, 35. Afirmação sobre a qual destacamos uma revisão sistemática sobre o uso do hidróxido de cálcio em Odontologia 12. Mas sempre se relatou grande dificuldade em se encontrar uma composição que pudesse servir como veículo para que o Ca(OH) 2 pudesse desenvolver este potencial antibiótico. A pasta de hidróxido de cálcio e mesmo a água de cal não conseguiam permitir que ele se difundisse pela massa microbiana e desencadeasse a ação desejada. Chegou-se à conclusão que era preciso se adicionar à solução saturada de hidróxido de cálcio (água de cal) algum composto químico que reduzisse sua tensão superficial 1, 2, 3, 13, 16. Sumarizando as colocações do parágrafo anterior, as pesquisas apontavam para a necessidade de se chegar a algum composto que fizesse com que o tempo necessário para que o hidróxido de cálcio desencadear o efeito antimicrobiano de modo mais rápido e efetivo diminua. Tal afirmação consubstanciava-se por conclusões de vários trabalhos 1, 2, 3, 13, 16, 20. Em já se afirmava que a mera redução da tensão superficial de um líquido anti-séptico aumentaria sua capacidade de difusão em um biofilme 23

32 bacteriano incrementado e aumentando a velocidade com que este desenvolvesse a ação anti-séptica. Este princípio norteou a busca de um composto químico a ser adicionado à solução saturada de hidróxido de cálcio com objetivo de incrementar sua ação anti-séptica. Resolveu-se através de análise química que o composto tenso-ativo a ser usado para este fim seria o tergentol (detergente do grupo lauril), onde alguns trabalhos atestaram posteriormente ser este o agente que propiciou menor valor resultante de tensão superficial à água de cal 1, 13. Algumas pesquisas concluíram 1, 2, 3 que a concentração ideal para esta solução seria de 80% de água de cal e 20% de tergentol, composto que foi denominado neste estudo de HCT 20. Logo, baseando-se no que a literatura afirmava 16, estava-se diante de um composto de grande potencial antimicrobiano. Os resultados da análise feita nos ensaios com placas de Petri e discos de antibiograma neste experimento mostraram extrema superioridade na capacidade antimicrobiana do digluconato de clorexidina a 0,12% sobre os quatro tipos bacterianos testados, seja no colonizador inicial, que é o Streptococcus sanguis, ou nas bactérias cariogênicas (Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei). Apesar da metodologia e tipo de análise diferirem do que a literatura traz sobre o HCT 20 1, 2, 3, 29, 30, 31, no presente trabalho, a clorexidina se mostrou consideravelmente superior ao referido composto, seja em sua apresentação convencional ou quando acrescido do flavorizante Aniz. 24

33 Esta diferença metodológica nos chamou atenção em relação aos alguns trabalhos 1, 2, 3, onde se encontrou bons resultados de ação antimicrobiana in vitro frente a vários tipos de microrganismos, inclusive os testados neste experimento. Desde então o HCT 20 vem sendo utilizado como solução irrigadora dos canais radiculares com larga margem de sucesso clínico descrito pela literatura 1, 2, 3, 8, 12, 13. O presente trabalho só encontrou boa efetividade do HCT 20 frente ao Streptococcus sanguis, não tendo obtido halo de inibição de crescimento bacteriano algum para os demais tipos bacterianos testados. Pensou-se na hipótese desta diferença na atividade anti-séptica ter relação com algum tipo de reação negativa do hidróxido de cálcio do HCT 20 e demais concentrações de tergentol nas soluções de HCT (água de cal + tergentol) com o ágar presente no meio de cultura gelatinoso usado nesta etapa do experimento. Hipótese esta que encontrava contraposição dentro mesmo desta pesquisa, já que todas as concentrações de HCT (5, 10, 20, 30 e 40% de tergentol) induziram formação de halos de inibição de crescimento bacteriano contra o Streptococcus sanguis. Tomando-se por base apenas esta metodologia de experimentação, poder-se-ia raciocinar equivocadamente que o HCT 20 seria efetivo apenas contra bactérias colonizadoras iniciais da cavidade bucal, sendo ineficaz contra microrganismos cariogênicos. Os achados do presente trabalho, contraindicariam frente a esta metodologia, o uso desta solução como anti-séptico bucal para bochechos. Pois não há sentido algum lançar mão de substância 25

34 antibiótica, seja ela em qualquer nível de ação (local ou sistêmico) sabendo-se que esta não irá agir sobre os microrganismos causadores da condição patológica, bem como tendo conhecimento da existência de compostos mais efetivos 9, 10, 21, 27, 36, 37. Confrontando com outros trabalhos sobre o HCT 20 1, 2, 3, 29, 30, 31, os resultados do presente estudo mostram uma diferença no caminho a ser tomado quanto a esta indicação para a referida solução. Poderia se pensar que, devido aos achados de grande desvantagem do HCT 20 frente a clorexidina, não valeria a pena continuar desenvolvendo estudos sobre o uso do HCT 20 como anti-séptico bucal. Mas, é preciso que se venha a testar todas as possibilidades de estudo para que se possa fazer qualquer tipo de afirmação com caráter científico. Além disso, não se pode desconsiderar estudos realizados anteriormente a esta pesquisa que atestam bom potencial do HCT 20 como solução para bochechos 29, 30, 31. Então, somando-se este raciocínio à possível reação do Ca(OH) 2 com o ágar, levou-se este estudo adiante e realizou-se a fase 2 do experimento testando-se as mesmas soluções com as mesmas cepas bacterianas, só que agora em biofilme, condição tal que simula com mais precisão um bochecho com enxaguatório bucal, e também isenta as soluções teste do contato com o ágar. Analisando-se agora os testes realizados com as bactérias formadoras de biofilme, cruzando-se os resultados dos testes feitos com cada solução, a clorexidina também apresentou os melhores resultados para os Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis, tendo havido resultados semelhantes ao 26

35 Tergentol para Streptococcus sobrinus. Não se pode considerar como fator causador de surpresa o fato da clorexidina apresentar performance satisfatória ou melhor que outro anti-séptico bucal, pois a literatura a considera o padrãoouro para testes com soluções anti-sépticas para uso em bochechos 37. 9, 10, 21, 27, 36, O HCT 20, assim como no teste com os discos de antibiograma, apresentou os melhores resultados frente aos Streptococcus sanguis. Se compararmos os HCT 20 puro e adicionado do flavorizante ao digluconato de clorexidina a 0,12%, o pós-teste de Dunn revelou diferença estatisticamente significante (p< 0,05) para suas ações contra o Streptococcus sobrinus. Mesmo com a ação inibitória total do crescimento bacteriano que somente a clorexidina desempenhou frente ao Streptococcus mutans. Faz-se importante relatar que a literatura consubstancia os achados desta pesquisa 17, 34, 36, 37, 38, 39. Os achados deste experimento pareciam direcionar que a capacidade antimicrobiana das soluções de Ca(OH) 2 + Tergentol (HCT) incrementava-se conforme se aumentava a proporção de tergentol da composição. Mas a análise estatística não confirmou tal relação. Quanto à fase 2 deste modelo experimental, o que pode se afirmar é que o digluconato de clorexidina é o anti-séptico mais efetivo contra bactérias formadoras de biofilme. Este achado corrobora o que é relatado na literatura sobre este composto 4, 5, 6, 7, 10, 11, 17, 24, 25, 26, 27, 36, 37, 38, 39. Baseado neste trabalho atesta-se que o uso do HCT 20 como anti-séptico bucal a princípio, não deve ser aconselhado. E como os achados obtidos nas 27

36 fases 1 e 2 desta experiência mostraram resultados negativos para a solução que era o objetivo central deste trabalho (HCT 20), tais dados inviabilizam sob o ponto de vista ético, a continuidade e aprofundamento da pesquisa sobre o uso potencial do HCT 20 como enxaguatório bucal. Tal etapa do processo científico investigativo seria uma fase clínica experimental para dar resultados finais sobre este assunto. Esta experiência trata-se da fase in vitro do protocolo padrão da American Dental Association para estudo sobre agentes antimicrobianos para bochechos. Não vale a pena conduzir o estudo a etapas in vivo, tendo em vista que o mesmo não atingiu dentro desta metodologia patamares satisfatórios em suas fases iniciais. Ainda que os resultados obtidos refiram-se eminentemente à metodologia empregada para este experimento, faz-se oportuno que se discuta a partir de agora sobre uma comparação crítica sobre os achados deste experimento em relação ao que a literatura traz sobre as soluções abordadas neste estudo. Em primeiro lugar o pensamento sobre a ação antimicrobiana do hidróxido de cálcio nos remete a analisar toda uma literatura que, ao longo de todos estes anos, atesta com clareza sobre o potencial do Ca(OH) 2 como bactericida 1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 39. Não se acredita que se tenha chegado por acaso a qualquer composto químico, e o HCT 20 está entre eles. O que se tinha por base para a construção desta solução? A resposta consiste em toda uma literatura pregressa com afirmações positivas sobre o hidróxido de cálcio e que sua ação antimicrobiana 28

37 não se dava da forma que se desejava porque não se havia chegado a uma associação química que propiciasse ao Ca(OH) 2 condições para que tal desenvoltura se concretizasse 14, 16,17, 19, 25, 31. O que se quer dizer com o desenvolvimento deste raciocínio é o seguinte: de acordo com o que se tinha na literatura sobre hidróxido de cálcio, tergentol, tensão superficial, biocompatibilidade e ação antimicrobiana, era de se esperar que este experimento nos mostrasse como resultados finais um composto que tivesse desempenho ao menos satisfatório, mesmo que com resultados aquém do padrão-ouro da clorexidina. Se o Ca(OH) 2 tem ação bactericida descrita essencialmente como desestabilizador de membrana e parede celular bacterianas; se a adição do detergente tergentol confere redução de tensão superficial à solução de hidróxido de cálcio; se esta redução da tensão superficial propicia melhor razão de difusão da solução frente à massa microbiana gerando assim contato da substância com maior número de bactérias 16 ; e principalmente, em havendo estudos 1, 2, 3, 21, 28, 29, 30, 31, 39 e considerável vida clínica da solução HCT 20, não era esperado um desempenho insatisfatório das soluções teste, principalmente as composta de Ca(OH) 2 com 20% de tergentol (HCT 20), ainda que esta metodologia não desqualifique as demais. Vale ressaltar que os fatores considerados no parágrafo anterior não são frutos de discussão desenvolvidos nesta pesquisa. Mas sim, de relatos de vários pesquisadores ao longo da história do uso do Ca(OH) 2 na Odontologia. 29

38 Tal raciocínio é consubstanciado por relatos de pesquisadores 12, em revisão sistemática da literatura sobre o hidróxido de cálcio onde os trabalhos por eles pesquisados afirmam claramente sobre o potencial antimicrobiano do hidróxido de cálcio ser bastante positivo. Pontos importantes para uma reflexão crítica são: o que terá passado desapercebido ao longo de todas estas metodologias em forma de análises clínicas, microbiológicas e críticas? Por qual ou quais razões uma solução que teria tudo, de acordo com as pesquisas ao longo da história, para vir a se constituir em boa opção no estudo dos agentes para o controle químico do biofilme dental não obteve resultados cientificamente esperados? Como investigar que tipo ou tipos de variáveis estavam presentes em cada um dos estudos? Quanto às demais metodologias empregadas no estudo do HCT 20, chama-se atenção em especial aos trabalhos de Barbosa 1, 2, 3, já que tratam-se de uma pesquisa in vitro onde dentre os trabalhos com soluções de hidróxido de cálcio, são os que mais se assemelham ao presente estudo. A conclusão principal destes trabalhos foi que a solução saturada de Ca(OH) 2 em 80% adicionada de 20% de tergentol foi bactericida em 5 minutos para vários microrganismos testados, inclusive os desta pesquisa. Comparando estes resultados aos deste experimento, notamos que a metodologia empregada em 1984 assemelha-se à fase 2 desta pesquisa, onde não havia contato das soluções com meio de cultura gelatinoso. Mas a principal diferença entre as duas metodologias foi o fato da primeira ter objetivo de 30

39 desenvolver solução irrigadora dos canais radiculares e esta pesquisa, uma solução para bochechos. Então, mesmo se tratando da mesma solução, o tempo de contato solução/microrganismos ganha relevância importante. Pois 5 minutos de contato e ação bactericida encontrada se constitui em ótimo resultado quando pensamos em um tratamento de canal, seja em bio ou em necropulpectomias. Já quando se pensa em bochecho com colutório, deve-se pensar em torno de 1 minuto, pois este é o tempo médio de indicação das soluções enxaguatórias existentes atualmente. Logo, o fator tempo de contato soluçãoteste microrganismos provavelmente é o gerador de tal discrepância de resultados 1, 2, 3, 29, 30, 31. Os resultados obtidos nesta pesquisa mostram com clareza: o simples fato do digluconato de clorexidina a 0,12% ter galgado melhores patamares de ação anti-séptica já propicia um direcionamento para que não se aprofunde frente a esta metodologia, o estudo sobre o uso do HCT 20 como solução para bochechos com a finalidade redutora do biofilme dental. Lembrando sempre que existiria uma fase in vivo para aprofundar o conhecimento e se chegar a uma conclusão definitiva sobre o uso potencial do HCT 20 como colutório bucal. O HCT 20 vem tendo bastante sucesso clínico como solução irrigadora dos canais radiculares desde 1984, e a literatura que atesta este fato ancora-se em fatores como: biocompatibilidade, baixa tensão superficial e, é claro a 1, 2, 3, 8, 12, 13, 29, 30, 31, presença do Ca(OH) A união destas três características confrontadas com os achados ao longo da literatura direcionou a uma 31

40 expectativa de bons resultados para esta solução como antisséptico bucal em forma de solução para bochechos. Vale lembrar que existe uma pesquisa que relata bom desempenho de bochechos com HCT 20 como fator estimulante de salivação para pacientes internados em hospital pós-irradiação ou quimioterapia 8, bem como há relato de trabalho in vitro na área médica com resultados efetivos em biofilme para Enterococcus faecallis quando se associa gel de eritromicina ao Ca(OH) 2 P.A. 5.Existem também trabalhos relatando metodologias de adição de Hidróxido de cálcio ao gel de gluconato de clorexidina com finalidade de medicação intra- 4, 21, 39 canal Os nossos resultados mostram também os níveis de ação antimicrobiana alcançados pelo HCT 20, em sua forma convencional ou adicionado do flavorizante não foram condizentes com o que a literatura mostra e, principalmente, não podem ser considerados padrões redutores de biofilme dental que sejam adequados à sua indicação como colutório bucal. O HCT 20 mostrou-se eficaz em estudos in vitro para microrganismos como a Cândida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Bacillus subtillis 15. Mas estes organismos não são considerados importantes no início da cárie e a doença periodontal, que são as principais patologias bucais a nível de prevalência em humanos, não sendo pois necessários em um estudo para solução de bochechos. Enfim, o planejamento inicial desta pesquisa contemplava um estudo completo com cinco fases, sendo duas in vitro e as três seguintes in vivo. 32