Faculdade de Medicina Veterinária

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1 DIC UNIVERSIDADE TÉCNICA DE LISBOA Faculdade de Medicina Veterinária PARASITISMO POR GIARDIA SPP. EM CANIS DE CRIAÇÃO NA REGIÃO DE VISEU, PORTUGAL ÂNGELO DUARTE PITÃES FERNANDES CONSTITUIÇÃO DO JÚRI Doutora Isabel Maria Soares Pereira da Fonseca de Sampaio Doutor Luís Manuel Madeira de Carvalho Doutor José Augusto Farraia e Silva Meireles Dr. Abel Nuno Calçada Fernandes ORIENTADOR Dr Abel Nuno Calçada Fernandes CO-ORIENTADOR Doutor Luís Manuel Madeira de Carvalho 2012 LISBOA

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3 UNIVERSIDADE TÉCNICA DE LISBOA Faculdade de Medicina Veterinária PARASITISMO POR GIARDIA SPP. EM CANIS DE CRIAÇÃO NA REGIÃO DE VISEU, PORTUGAL ÂNGELO DUARTE PITÃES FERNANDES DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA CONSTITUIÇÃO DO JÚRI Doutora Isabel Maria Soares Pereira da Fonseca de Sampaio Doutor Luís Manuel Madeira de Carvalho Doutor José Augusto Farraia e Silva Meireles Dr. Abel Nuno Calçada Fernandes ORIENTADOR Dr Abel Nuno Calçada Fernandes CO-ORIENTADOR Doutor Luís Manuel Madeira de Carvalho 2012 LISBOA

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5 DEDICATÓRIA Uma mente que se abre a uma nova ideia jamais retoma a sua forma original Albert Einstein À minha mãe, ao meu irmão e à minha irmã Porque sempre me apoiaram e muito sacrificaram para eu perseguir este sonho, Por tudo que vivemos, por tudo que perdemos, Nada tem valor se não o vivermos juntos À mãe, ao pai e à Sara Porque, apesar dos anos passarem e a distância existir ou não, nunca nos afastamos de verdade Sempre me deram mais do que eu poderia pedir

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8 AGRADECIMENTOS A realização e apresentação deste trabalho significam o fim de um percurso académico inundado de conhecimentos, amizades e experiências que guardo com muito orgulho pelo impacto que tiveram na minha vida até este momento. Assim tenho de reconhecer e agradecer o apoio das pessoas que tornaram possível esta caminhada até aqui. Ao Dr Abel Fernandes por todos os conhecimentos e experiências partilhadas pondo os meus à prova incentivando a minha vontade de aprender, apoio e orientação constantes e acima de tudo pela alegria com que exerce esta prestigiada profissão.. Ao Professor Doutor Luís Madeira de Carvalho, pelo entusiasmo e vontade com que sempre transmite conhecimentos e cativa os seus alunos. Pela disponibilidade e apoio desde o primeiro instante, pelo incentivo e acompanhamento constantes durante o estágio e na realização do trabalho. À equipa do SOS Animal - Hospital Veterinário de Viseu, por me receberem da melhor maneira possível e por terem proporcionado um período de estágio recheado de boas experiências. À Dra Liliana Antunes e D. Filomena Cunha pois sem a sua contribuição não teria sido possível realizar este estudo. Aos médicos veterinários do SOS Animal, Dra Liliana Antunes, Dra Ana Dias, Dra Joana Fernandes e Dr Nuno Guedes por tudo que me ensinaram, pela alegria com que o fizeram criando um excelente ambiente durante todo o meu percurso. Às enfermeiras Ana Marlene Teixeira e Daniela Ferraz pela simpatia e experiência, mostrando um lado muitas vezes negligenciado mas importante da medicina veterinária. À Virbac, na pessoa do Dr Francisco Ferraz por disponibilizar os testes rápidos Speed Giardia, indispensáveis no modelo de estudo idealizado e pela cordialidade e disponibilidade que sempre demonstraram. Tenho ainda de agradecer a importante ajuda da Professora Doutora Berta São Braz por facilitar o contacto com o Dr Francisco Ferraz À Dra Lídia Gomes, porque sem a sua preciosa orientação no laboratório dificilmente poderia terminar este trabalho. Ao Dr Telmo Nunes pela preciosa orientação no tratamento estatístico dos dados recolhidos. i

9 À Faculdade de Medicina Veterinária, a todas as pessoas que fazem desta instituição um lugar de excelência na formação veterinária no nosso país. A todos os professores que se esforçam por iluminar mentes capazes, a todos os funcionários que são peça fundamental no dia-a-dia da instituição e aos animais que pelas nossas mãos passam e nos relembram o que é ser veterinário. À AEFMV e a todos que dela fizeram parte durante a minha passagem, em especial à Ausenda Pais, por tudo que faz pela Associação e por quem lá passa. A todos os colegas e amigos que partilharam estes últimos 6 anos na FMV, em especial ao Joel Mendes, Rui Silva e Vasco Simões que foram uns companheiros e amigos de excelência nesta caminhada, sem os quais não teria sido possível alcançar este momento. Aos meus amigos bracarenses Pedro, Marina e Cristina, não há palavras para descrever todos estes anos de amizade. Ao Tó, à Beta e à Marta, a minha família lisboeta, por todo o apoio desde o primeiro dia em que cheguei a Lisboa, nada disto teria sido possível sem a vossa ajuda. À minha família, que tudo deram para que eu pudesse trilhar este caminho no meio de tanta adversidade e sempre me acompanharam para que não falhasse as oportunidades de seguir esta ambição. Este sonho foram vocês que realizaram. Por fim, à minha Chienne, a principal razão da vontade de ser veterinário. ii

10 RESUMO Os protozoários do género Giardia spp são parasitas de distribuição mundial e infectam vários tipos de hospedeiros entre os quais mamíferos domésticos e silvestres. Têm a capacidade de se manter na natureza durante várias semanas e são infectantes logo após a sua excreção. Provocam episódios de diarreia aguda intermitente tanto em humanos como em animais, sendo parasitas gastrointestinais muito comuns em locais com elevada densidade animal como é o caso dos canis e a sua contínua elevada prevalência em cães pode potenciar o seu risco zoonótico. Considerando estes aspectos foi realizado um estudo parasitológico em 2 canis de criação diferentes na região de Viseu (Portugal), avaliando um total de 51 cães de diversas raças. Este estudo procurou avaliar a prevalência de Giardia spp. neste tipo de instalações, assim como as associações entre os parâmetros sexo, idade, raça, medicação, doenças e desparasitações. As amostras foram submetidas a 3 métodos de diagnóstico: teste imunocromatográfico rápido Speed Giardia (BVT, Virbac), flutuação passiva com ZnSO 4 e esfregaço fecal com coloração pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada. Entre os 2 canis estudados apenas um revelou a presença de Giardia e foi detectada uma prevalência final de 21,6% (11/51). De acordo com os 3 testes de diagnóstico obtivemos uma prevalência de 21,6% através do teste rápido Speed Giardia, 19,6% (10/51) pelo método de flutuação passiva com ZnSO 4 e de 17,6% (9/51) pela coloração com a técnica de Ziehl-Neelsen. No cômputo geral a prevalência média foi de 19,6% entre os 3 métodos. Com base na análise estatística pelo teste de qui-quadrado foi detectada apenas uma associação significativa (p<0,05) entre a prevalência de Giardia e os animais do sexo feminino. Neste estudo foi possível comparar os 3 métodos de diagnóstico e as suas vantagens do ponto de vista do utilizador com maior ou menor experiência. Foi analisado o impacto dos esquemas de desparasitação interna e externa e de limpeza e desinfecção das instalações tendo sido demonstrado um risco superior para a prevalência de Giardia, em canis com elevado número animais. Acima de tudo foi possível demonstrar que as elevadas prevalências de Giardia spp. em cães previamente descritas em canis municipais e abrigos para animais, também são detectadas em canis de criação pese o facto de existirem condições consideravelmente diferentes. Palavras-chave: Cães, Canis de Criação, Giardia, Teste Speed Giardia, testes coprológicos, prevalência, risco de infecção iii

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12 ABSTRACT Giardia spp. are protozoans parasites of worldwide distribution able to infect many types of hosts, including domestic and wild mammals, being able to survive in the environment for several weeks and is infective soon after its excretion. Capable of causing intermittent episodes of acute diarrhea in humans and animals alike, is a very common gastrointestinal parasite in places where inhabit various animals in higher density such as kennels, and their continuous high prevalence in dogs can potentiate zoonotic risk. Considering these aspects, a study was conducted at 2 different breeding kennels in the region of Viseu (Portugal), assessing a total of 51 dogs of various breeds. This study sought to evaluate the prevalence of Giardia in this type of animal facility, as well as the associations between Giardia spp. infection regarding the sex, age, breed, medication, pathologies and deworming protocols. The samples were subjected to 3 diagnostic methods: Immunochromatographic Speed Giardia test (BVT, Virbac), passive fluctuation with ZnSO4 and a fecal smear stained by a modified Ziehl- Neelsen technique. Between the 2 studied kennels, only one revealed the presence of Giardia spp. with a final prevalence of 21,6% (11/51). According to the 3 different diagnostic methods we obtained a prevalence of 21.6% according to the Speed Giardia test, 19.6% (10/51) by passive flotation method with ZnSO 4 and 17.6% (9/51) with Ziehl-Neelsen technique. On balance the average prevalence was 19,6% considering the 3 methods. Based on statistical analysis by Chi-square test it was detected only one significant association (p < 0.05) between the prevalence of Giardia spp. and female dogs. In this study it was possible to compare the 3 diagnostic methods and their advantages from the point of view of the user with greater or lesser experience. The impact of deworming schemes and internal and external cleaning and disinfection of the premises was analyzed, having been shown a higher risk for the prevalence of Giardia spp., in kennels with a higher number of animals. Above all, it was possible to demonstrate that the high prevalence of Giardia spp. previously described in dogs from municipal kennels and animal shelters is also detected in breeding kennels, which appear to have considerably different conditions. Keywords: Dogs, Breeding Kennels, Giardia, Speed Giardia, faecal tests, prevalence, infection risk v

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14 ÍNDICE GERAL DEDICATÓRIA... ii AGRADECIMENTOS... i RESUMO... iii ABSTRACT... v ÍNDICE GERAL... vii ÍNDICE DE FIGURAS... ix ÍNDICE DE TABELAS... x ÍNDICE DE GRÁFICOS... x I. INTRODUÇÃO... 1 II. ACTIVIDADES DESENVOLVIDAS NO ESTÁGIO CURRICULAR Actividades no SOSAnimal HVV Actividades no Laboratório de Doenças Parasitárias da FMV-UTL... 4 III. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Nota Histórica Taxonomia Género Giardia Biologia Celular Morfologia Diferenciação celular Transformação quisto/trofozoíto Ciclo biológico Epidemiologia Potencial e risco zoonótico Sinais clínicos Patogenia Prevalência Diagnóstico Análises coprológicas microscópicas Testes imunológicos para detecção de antigénios de Giardia Métodos moleculares para pesquisa de ADN de Giardia - PCR Tratamento Febendazol Febantel/Pirantel/Praziquantel Metronidazol Albendazol Outras opções de tratamento vii

15 11. Prevenção e controlo IV. Estudo Prático Parasitismo por Giardia spp. em canis de criação na região de Viseu, Portugal Objectivos Material e métodos Locais Canil/Criador nº1 (C1) Canil/Criador nº2 (C2) Amostras Análise estatística Análise e exames parasitológicos Resultados Caracterização da amostra no C Caracterização da amostra do C Prevalência de Giardia spp Prevalência por idade Prevalência por sexo Prevalência por raça Prevalência e medicação, doença e desparasitações Discussão Técnicas de diagnóstico Prevalência e parâmetros Idade Sexo Raça Desparasitações, medicação e doenças Prevalências e canis Conclusão Perspectivas futuras BIBLIOGRAFIA ANEXOS viii

16 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Imagem esquerda Demodex canis obtido após raspagem em Caniche. Objectiva 40x Imagem direita Cheyletiella yasguri obtido pelo método de fita-cola em Cocker Spaniel. Objectiva 10x. Fonte: Original... 3 Figura 2 Icterícia em canídeo de raça indeterminada por Babesia canis. Fonte: Imagem cedida pelo SOSAnimal - HVV... 3 Figura 3- Imagem esquerda Bolsa escrotal tumefacta e com zona de necrose. Imagem direita Testículos e bolsa escrotal após remoção cirúrgica (Torsão testicular). Fonte: Imagem cedida pelo SOSAnimal - HVV... 4 Figura 4 - Esquema de trofozoíto de G. duodenalis. Adaptado de Faubert (2000)... 9 Figura 5 Corte transversal de trofozoíto. Realce para a presença dos núcleos (N), flagelos (F), vacúolos (V) e retículo endoplasmático (ER). Fonte: Adam (2001) Figura 6 Vista ventral de trofozoíto de Giardia por foto electrónica de varrimento com coloração digital. Fonte: Erlandsen (2005b) Figura 7 Representação esquemática comparativa entre trofozoíto e quisto e suas estruturas chave. Fonte: Ankarklev et al (2010) Figura 8 Mitossomas de G. intestinalis em marcação imunofluorescente. Fonte: Tachezy & Dolezal (2011) Figura 9 Ciclo biológico de Giardia spp. Adaptado de Smith & Paget (2007) Figura 10 Desenquistamento (esq) e fissão binária (dir). Micrografia electrónica de varrimento colorida digitalmente. Fonte: (Erlandsen, 2005a) Figura 11 Diagrama dos ciclos de transmissão de Giardia. Adaptado: (Hunter & Thompson, 2005) Figura 12 Ciclo de vida de Giardia spp. e possíveis fontes de contaminação para humanos. Adaptado: (DPDx, 2010) Figura 13 Quistos de Giardia, centrifugação em ZnSO 4. Fonte: Dryden, Payne & Smith (2006) 24 Figura 14 Vista de uma das zonas com boxes individuais do C Figura 15 - Kits para exames fecais HenrySchein. Fonte: Original Figura 16 Quistos de Giardia. Flutuação passiva com ZnSO 4. Objectiva 40x Fonte: Original Figura 17 - Testes rápidos Speed Giardia da BVT, Virbac. Fonte: Original Figura 18 Reagentes e aspecto das preparações submetidas à técnica de Ziehl-Neelsen modificada. Fonte: Original Figura 19 Imagem esquerda: Kit para análise de amostras fecais. Imagem direita: Kits com solução e lamela. Imagem inferior: Lâminas e lamelas para observação microscópica. Fonte: Original Figura 20 Imagem superior: Suporte para lâminas e reagentes. Imagem esquerda: Lâminas após esfregaço. Imagem direita: Lâminas após coloração. Fonte: Original Figura 21 Imagem esquerda: Frasco com reagente e colher. Imagem direita: Fita de teste em solução. Fonte: Original Figura 22 Tira imunocromatográfica Speed Giardia Resultado negativo. Fonte: Original Figura 23 - Tira imunocromatográfica Speed Giardia Resultado positivo. Fonte: Original Figura 24 - Quisto de Giardia. Flutuação passiva com ZnSO 4, Objectiva 40x. Fonte: Original Figura 25 - Quisto de Giardia. Flutuação passiva com ZnSO 4, objectiva 10x. Fonte: Original Figura 26 - Quisto de Giardia. Flutuação passiva com ZnSO 4, objectiva 100x. Fonte: Original Figura 27 - Quisto de Giardia. Coloração com técnica de Ziehl-Neelsen modificada, objectiva 100x. Fonte: Original Figura 28 Toxascaris leonina, flutuação passiva com ZnSO 4, objectiva. 10x. Fonte:Original ix

17 ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1 Espécies de Giardia e seus hospedeiros. Adaptado de Tangtrongsup & Scorza, Tabela 2 Espécies de Giardia e características morfológicas. Adaptado de Adam (2001) Tabela 3 Principais factores de virulência de Giardia spp. Adaptado de Ankarklev et al (2010). 20 Tabela 4 Prevalência de Giardia em cães de acordo com a sua origem, na Europa Tabela 5 Distribuição por canil do número de amostras recolhidas Tabela 6 Prevalência de Giardia de acordo com os 3 métodos utilizados Tabela 7 Prevalência total de acordo com os 3 métodos utilizados Tabela 8 Prevalência por idade (C1) Tabela 9 Prevalência por sexo (C1) Tabela 10 Prevalência por raça (C1) Tabela 11 Relação de prevalência com desparasitação interna/externa (C1) Tabela 12 Relação de prevalência e medicação (C1) Tabela 13 Relação de prevalência e doenças pré-existentes (C1) ÍNDICE DE GRÁFICOS Gráfico 1 - Distribuição das actividades desenvolvidas no SOSAnimal HVV... 2 Gráfico 2 Distribuição da idade dos animais do C Gráfico 3 Distribuição das raças no C Gráfico 4 Distribuição das idades dos animais no C x

18 LISTA DE ABREVIATURAS ADN Ácido desoxirribonucleico ATP Adenosina Trifosfato BID Bis in die (duas vezes por dia) CDC Centers for Disease Control and Prevention ESCCAP European Scientific Counsel Companion Animal Parasites ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EUA Estados Unidos da América FCI Fédération Cynologique Internationale FMV-UTL Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Técnica de Lisboa HVV Hospital Veterinário de Viseu IFD Imunofluorescência Directa IgA Imunoglobulina A NaCl Cloreto de Sódio NUPA Não-União do Processo Ancóneo OMS Organização Mundial de Saúde PPP Período pré-patente PO Per os (por via oral) RLCA Ruptura do Ligamento Cruzado Anterior RER Retículo Endoplasmático Rugoso SID Semel in die (Uma vez por dia) SFC Síndrome de Fadiga Crónica VIH Vírus da Imunodeficiência Humana VSP Variant-specific protein ZnSO4 Sulfato de Zinco xi

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20 I. INTRODUÇÃO A ubiquidade deste protozoário, a manutenção das formas infectantes durante vários meses na natureza, a possibilidade de afectar vários tipos de hospedeiros agregada à capacidade dos mesmos exibirem sintomas graves ou simplesmente se tornarem assintomáticos faz dele um caso de estudo importante e interessante, tornando-o a base de trabalho e investigação para esta dissertação. O objecto deste estudo passou pela pesquisa de Giardia em canis de criação, sobretudo após a sugestão de alguns estudos epidemiológicos de que estes canis assim como as pet-shops possam ter um importante papel como fonte de infecção de Giardia em cachorros (Itoh, Muraoka, Saeki, Aoki, & Itagaki, 2005). Esta nossa dissertação consiste numa revisão da bibliografia referente à morfologia do parasita, seu ciclo biológico, prevalência, epidemiologia e potencial zoonótico, associada à pesquisa, análise e comparação dos resultados obtidos decorrentes das amostras recolhidas em cães de criadores na região de Viseu. II. ACTIVIDADES DESENVOLVIDAS NO ESTÁGIO CURRICULAR As actividades desenvolvidas no decurso do Estágio Curricular tiveram lugar no SOS Animal Hospital Veterinário de Viseu, servindo de base para a realização desta Tese de Mestrado Integrado sobretudo pelos conhecimentos adquiridos e exposição aos casos apresentados. As amostras recolhidas nos criadores de cães da zona de Viseu foram analisadas no Laboratório de Parasitologia da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Técnica de Lisboa (FMV-UTL), sendo sujeitas a testes parasitológicos resultando daí os dados indispensáveis para a realização deste estudo. 1. Actividades no SOSAnimal HVV No período compreendido entre o dia 1 de Setembro de 2011 e 31 de Março de 2012 as actividades referentes ao Estágio Curricular tiveram lugar no SOSAnimal Hospital Veterinário de Viseu, com um total de 1220 horas distribuídas em 6 áreas de actuação: Internamento (220h), Cirurgia (440h), Medicina Interna (410h), Domicílios (30h), Radiologia (50h) e Laboratório (70h). 1

21 Gráfico 1 - Distribuição das actividades desenvolvidas no SOSAnimal HVV Laboratório Radiologia Domicílios 30h 50h 70h Medicina Interna 410h Internamento 220h Cirurgia 440h Apesar da relevância evidenciada nas áreas de Medicina Interna e Cirurgia, com esta última a ser valorizada pela experiência na Ortopedia, as actividades assim como o tempo despendido em cada uma dessas mesmas áreas de actuação estiveram sempre dependentes do número de casos que surgiram à consulta ou foram referenciados. No que diz respeito à Medicina Interna, o tempo ocupado deveu-se ao acompanhamento de consultas com uma percentagem elevada de esquemas de vacinação e desparasitação, exames físicos gerais com vista ao checkup anual, o registo e movimentação animal. Entre outras, foram acompanhadas consultas referentes à área de Dermatologia, sendo os problemas de pele muitas vezes devidos aos efeitos da presença de parasitas externos (Figura 1), à Endocrinologia com o acompanhamento de diversos casos de Diabetes mellitus com especial atenção à estabilização médica e nutricional dos pacientes. 2

22 Figura 1 Imagem esquerda Demodex canis obtido após raspagem em Caniche. Objectiva 40x Imagem direita Cheyletiella yasguri obtido pelo método de fita-cola em Cocker Spaniel. Objectiva 10x. Fonte: Original As 220 horas dispensadas em Internamento serviram para acompanhar casos de infecções virais, com predominância para os casos de parvovirose em cães jovens; bacterianas resultando em alterações gastrointestinais em animais de várias idades e parasitárias com relevância para os hemoparasitas tal como Leishmania spp. ou Babesia spp. (Figura 2). Ainda dentro desta área, foram acompanhados vários casos para tratamentos de emergência e estabilização de epilepsia e status epilepticus em cães de raças diversas e de idades compreendidas entre os 2 e os 10 anos. Figura 2 Icterícia em canídeo de raça indeterminada por Babesia canis. Fonte: Imagem cedida pelo SOSAnimal - HVV No que se refere à área de Cirurgia, com a percentagem mais elevada de ocupação do tempo total do estágio, o estagiário teve a oportunidade de estar presente em todas as etapas do 3

23 processo cirúrgico particularmente na preparação do paciente, do campo cirúrgico e do material a ser utilizado, na anestesia, como auxiliar do cirurgião e no acompanhamento póscirúrgico. As intervenções mais comuns e por ordem foram as ovariohisterectomias, cesarianas, orquiectomias (Figura 3) e ortopedias particularmente as resoluções de fracturas, Não-União do Processo Ancóneo (NUPA) e Ruptura do Ligamento Cruzado Anterior (RLCA). Figura 3- Imagem esquerda Bolsa escrotal tumefacta e com zona de necrose. Imagem direita Testículos e bolsa escrotal após remoção cirúrgica (Torsão testicular). Fonte: Imagem cedida pelo SOSAnimal - HVV Na área de Imagiologia, o estagiário teve a possibilidade de auxiliar o médico veterinário responsável através da interpretação dos resultados e da contenção dos pacientes durante a realização de radiografias, ecografias abdominais, ecocardiografias e electrocardiogramas O estagiário teve sempre a possibilidade de fazer parte de todos os processos nas diferentes áreas de actuação, com o apoio e supervisão dos responsáveis quer da área clínica e cirúrgica como também da área de enfermagem que complementa positivamente as actuações dos médicos veterinários, revelando-se uma mais-valia no mecanismo hospitalar. 2. Actividades no Laboratório de Doenças Parasitárias da FMV-UTL As actividades realizadas no Laboratório de Doenças Parasitárias da FMV-UTL estiveram ligadas sobretudo aos processos de análise das amostras recolhidas. As amostras recolhidas 4

24 nos criadores foram posteriormente processadas com um máximo de 48 horas após a sua colheita. Neste laboratório tiveram lugar os exames de flutuação passiva, os esfregaços fecais e sua posterior coloração pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada e ainda os testes rápidos Speed Giardia da BVT, Virbac. 5

25 III. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1. Nota Histórica Em 1681, o Pai da Microbiologia Anton van Leeuwenhoek, observou um protozoário, presente nas suas próprias fezes, ao qual denominou de animalúnculo, ficando na história o registo da primeira classificação do que actualmente se refere a Giardia spp. Após esta descoberta, passaram quase 200 anos até Vilém Dušan Lambl ( ), um médico checo, escrever sobre a primeira descrição do flagelado intestinal que baptizou de Cercomonas intestinalis. Giardia foi um termo introduzido por Kunstler (1883) em homenagem ao referido médico e ao biólogo francês Alfred Mathieu Giard ( ), também ele responsável por uma descrição do protozoário flagelado. A denominação de Giardia duodenalis, surgiu com Charles Wardell Stiles ( ), zoologista americano. Em 1915 foi proposto o nome de Giardia lamblia resultante da pesquisa de Kofoid e Christiansen com base nas características morfológicas e fazendo uso das descrições de Blanchard e Kunstler. No entanto parecem surgir sempre algumas dúvidas sobre a designação correcta a utilizar pois este organismo, ao longo da história, foi encontrando novas expressões de acordo com a sua localização ou por simples decisão do observador, como é o exemplo de Megastoma entericum atribuída por Grassi, Lamblia intestinalis por Blanchard ou até mesmo a decisão de Davaine de o denominar Hexamitus duodenalis (Dobell, 1919). Desde a descoberta de Giardia spp. ao reconhecimento da crescente importância zoonótica nos dias de hoje passaram mais de três séculos, com estudos a revelarem prevalências elevadas em animais de companhia, de produção e até em mamíferos silvestres (Bednarska et al. 2006). 2. Taxonomia A classificação do género Giardia tem sido objecto de várias alterações ao longo do tempo, com os responsáveis das designações a serem deparados com inúmeros factores que a têm levado a sofrer tantos rearranjos e denominações. As primeiras classificações baseadas na morfologia entendiam que o género Giardia deveria ser incluído no reino Protista que compreende 11 Filos e 65 Classes segundo Cavalier-Smith (2003), ou melhor, no táxon Protista uma vez que este passou a ser assim considerado por entender tratar-se de um grupo parafilético do qual fazem parte vários descendentes de um ancestral comum, porém não estando todos presentes. Para além deste reino este género pertencia ao Filo Sarcomastigophora, Sub-Filo Mastigophora (flagelados), Classe Zoomastigophorea, Ordem Diplomonadida e Familia Hexamitidae (Plutzer et al, 2010) 6

26 Com a possibilidade de basear a sistemática em métodos científicos mais avançados com acesso a informação estrutural, morfológica, bioquímica e genética foi definido que Giardia pertence ao Sub-Reino Sarcomastigota, Infra-Reino Excavata (estruturas ciliares dos membros com sulco ventral), Filo Metamonada, Sub-Filo Trichozoa, Superclasse Eopharyngia, Classe Treponomadae, Sub-Classe Diplozoa, Ordem Giaardiida e Família Giardiidae (Cavalier-Smith, 2003) Género Giardia O consenso para a definição do número de espécies pertencentes ao género Giardia não tem sido fácil, assim como o esclarecimento para a correcta denominação de cada um deles. Em 1951, Filice definiu que se deveriam considerar 3 espécies das quais G. duodenalis, encontrada em várias espécies de mamíferos onde se incluem carnívoros, humanos e outros primatas, G. agilis em anfíbios e G. muris em roedores. É reconhecido actualmente que este género engloba seis espécies (Tabela 1), sendo que a concepção inicial de que G. lamblia apenas se encontraria em humanos é errada, passando a ser descrita como sinónimo de G. intestinalis ou G. duodenalis sendo caracterizada por um complexo de espécies que engloba sete grupos ou assemblages com poucas diferenças morfológicas mas que se dividem com base na análise genética (Cacciò & Ryan, 2008). As assemblages A e B são as que apresentam uma maior gama de hospedeiros susceptíveis, em particular humanos e outros primatas para além de animais domésticos e selvagens, o que as destaca devido à importância do seu potencial zoonótico. No que se refere aos animais de companhia, sobretudo as assemblages C e D foram encontradas em cães infectados e a assemblage F em gatos (Tangtrongsup & Scorza, 2010). 7

27 Tabela 1 Espécies de Giardia e seus hospedeiros. Adaptado de Tangtrongsup & Scorza, 2010 Espécies/Assemblages Nomenclatura Proposta Hospedeiros susceptíveis G. duodenalis Assemblage A Assemblage B G. duodenalis G. enterica Humanos e outros primatas, cães, gatos, gado, roedores e animais selvagens Humanos e primatas, cães e algumas espécies selvagens Assemblage C e D G. canis Cães e outros canídeos Assemblage E G. bovis Bovinos e outros ungulados domésticos Assemblage F G. felis Gatos Assemblage G G. simondi Ratos G. agilis G. agilis Anfíbios G. muris G. muris Roedores G. psittaci G. psittaci Aves G. ardeae G. ardeae Aves G. microti G. microti Roedores As assemblages A e B, por se tratarem de isolados obtidos em humanos, foram as primeiras a ser reconhecidas e podem ainda ser denominadas, respectivamente, como genótipo Polaco e Belga segundo Homan et al (1992), ou ainda como grupos I/II e III/IV com base no trabalho de Andrews et al (1998). Apesar das semelhanças no que toca a hospedeiros susceptíveis, as diferenças genómicas entre as assemblages A e B, com destaque para os genes envolvidos na sobrevivência do parasita durante a infecção, podem explicar algumas das diferenças biológicas e clinicas observadas, o que sugere a possibilidade de estas se tratarem de duas espécies distintas (Franzén, et al., 2009). 3. Biologia Celular Giardia e em particular G. duodenalis, é um típico organismo eucariota por apresentar um núcleo distinto e uma membrana nuclear, citoesqueleto e sistema endomembranar, mas carece de outros organelos que são praticamente universais nos eucariotas como é o caso dos peroxissomas e nucléolos, sendo ainda anaeróbia e não possui mitocôndria ou qualquer outro dos componentes da fosforilação oxidativa (Adam, 2001). Apesar de não possuir mitocôndria, tal não implica que este organismo seja um ancestral dos eucariotas e Archaebacterias que por processos de endossimbiose viriam a adquirir estes organelos numa fase evolutiva mais avançada, uma vez que com a descodificação do genoma, tal como refere Adam (2001), 8

28 foram reconhecidos os genes mitocondriais presentes nas espécies de Giardia, levando o autor a sugerir que estes protistas amitocondriais perderam o organelo mais tarde Morfologia Os trofozoítos de Giardia spp possuem uma estrutura característica em forma de lágrima, com algumas diferenças entre as espécies encontradas nos diferentes hospedeiros. Tomando como base G. duodenalis, os trofozoítos apresentam forma de lágrima ou de pêra com um comprimento de 12 a 15 µm e com 5 a 9 µm de largura, aproximadamente. O citoesqueleto deste parasita inclui um corpo mediano, 4 pares de flagelos (anterior, posterior, caudal e ventral) e um disco ventral (Figura 4). Os 2 núcleos presentes são simétricos em relação ao eixo central não apresentando nucléolo e no citoplasma estão presentes os vacúolos lisossomais (Figura 5) de acordo com Adam (2001). Figura 4 - Esquema de trofozoíto de G. duodenalis. Adaptado de Faubert (2000) Os corpos basais presentes na zona anterior do sulco ou eixo central são os locais de onde se originam os 4 pares de flagelos que conferem a mobilidade ao trofozoíto. No que se refere ao corpo mediano, encontra-se na linha média e dorsal aos flagelos caudais sendo constituido por microtúbulos num feixe justo, exclusivo no género Giardia, usado para ajudar na definição das espécies existentes com base nas características morfológicas, usando como referência o corpo mediano de G. lamblia, em forma de gancho de martelo (Tabela 2) de acordo com Adam (2001). Apesar de ser importante neste aspecto de classificação, a função do corpo mediano é ainda desconhecida (Ankarklev et al, 2010). 9

29 Figura 5 Corte transversal de trofozoíto. Realce para a presença dos núcleos (N), flagelos (F), vacúolos (V) e retículo endoplasmático (ER). Fonte: Adam (2001) Tabela 2 Espécies de Giardia e características morfológicas. Adaptado de Adam (2001) Espécie G. agilis Morfologia por M. O. M. E. Longa e esguia; corpos medianos em forma de lágrima - G. muris G. duodenalis Curta e arrendondada; Pequeno corpo mediano redondo Em forma de pêra; 1 ou 2 corpos medianos em forma de garra, transversos - - G. ardeae Idêntica a G.duodenalis G. psittaci Idêntica a G.duodenalis G. microti Idêntica a G.duodenalis Disco ventral e flagelo caudal idênticos a G. muris Rebordo ventrolateral incompleto, sem sulco marginal Quistos possuem 2 trofozoítos com discos ventrais maduros O disco ventral (Figura 6) é uma estrutura única apenas reconhecida dentro do género Giardia. É uma estrutura em forma de cúpula capaz de modular a sua concavidade aos locais de acoplamento e composta por uma matriz de microtúbulos (Elmendorf, Dawson, & McCafrey, 2003), representando uma grande proporção das proteínas encontradas neste organelo encontram-se as giardinas, importantes no processo de acoplamento do parasita ao 10

30 hospedeiro. São exclusivas do género Giardia o que as torna de interesse principal no estudo da resposta imune do hospedeiro ao parasita. A α1-giardina, α2-giardina e γ-giardina são antigénios de superfície e provavelmente os primeiros a serem detectados pelo sistema imunitário do hospedeiro após ligação à mucosa (Faubert, 2000). Figura 6 Vista ventral de trofozoíto de Giardia por foto electrónica de varrimento com coloração digital. Fonte: Erlandsen (2005b) Os quistos de Giardia spp são estruturas ovais sem motilidade, com 4 núcleos tetraplóides, um comprimento aproximado de 8-12 µm e uma largura de 7-10 µm. A parede do quisto tem uma espessura entre os 0,3 e os 0,5 µm é composta por uma camada externa filamentosa, cujo diâmetro dos próprios filamentos varia entre os 7 e os 20 nm, enquanto a camada mais interna é membranosa com 2 membranas (Adam, 2001). Em relação à camada externa do quisto é reconhecida a presença de várias proteínas estruturais sendo composta predominantemente por N-acetilgalactosamina, um açúcar, existindo no entanto uma certa discrepância no reconhecimento do número de proteínas que constituem a parede com Adam (2001) a referir a presença de 4 proteínas mas no seu trabalho Ankarklev et al (2010) apenas salientam 3 proteínas (CWP1, CWP2 e CWP3). Sendo a forma mais estável do ciclo de vida no ambiente, o quisto de Giardia spp apresenta uma taxa metabólica de apenas 10 a 20% daquela encontrada no trofozoíto (Paget et al, 1989). 11

31 Figura 7 Representação esquemática comparativa entre trofozoíto e quisto e suas estruturas chave. Fonte: Ankarklev et al (2010) Os mitossomas estão presentes nas duas formas do ciclo biológico, quisto e trofozoíto. São formas minimizadas de mitocôndria que perderam todo o genoma assim como a maioria das vias mitocondriais incluindo a respiração, o ciclo do ácido cítrico e a síntese de ATP. São organelos ovóides com um tamanho inferior a 0,2µm, com um número variável entre 25 a 100 por célula. Existem 2 tipos de mitossomas de acordo com a sua distribuição, centrais e periféricos (Figura 7 e 8). Até à data a única via metabólica contida e reconhecida aos mitossomas de G. intestinalis é a formação de centros de ferro-enxofre (FeS clusters) (Tachezy & Dolezal, 2011). Figura 8 Mitossomas de G. intestinalis em marcação imunofluorescente. Fonte: Tachezy & Dolezal (2011) 12

32 3.2. Diferenciação celular Transformação quisto/trofozoíto A passagem de trofozoíto a quisto após alteração das condições no hospedeiro é uma fase importante para a manutenção do parasita e a capacidade deste sobreviver no meio exterior até infectar um novo hospedeiro. A formação do quisto é marcada por uma expansão do Retículo Endoplasmático Rugoso (RER) e Complexo de Golgi necessários para uma rápida síntese e secreção das 2 principais proteínas da parede, CWP1 e CWP2. Os flagelos e o disco ventral tornam-se estruturas sem relevância sendo separadas em fragmentos que são armazenados no citoplasma. (Elmendorf, Dawson, & McCafrey, 2003). Na fase final do enquistamento, o processo de transformação do trofozoíto móvel no quisto infectante e sem motilidade, ocorre divisão nuclear dando origem ao quisto maduro com 4 núcleos (Ankarklev, Jerlstrom-Hultqvist, Ringqvist, Troell, & Svard, 2010). Os trofozoítos presentes no lúmen intestinal monitorizam e respondem constantemente ao ambiente que os rodeia, sendo que a exposição a ph alcalino e aumento dos sais biliares desencadeiam o processo de enquistamento (Lauwaet, Davids, Reiner, & Gillin, 2007). O processo de desenquistamento, passagem de quisto a trofozoíto, ocorre na zona proximal do intestino delgado, seguida da passagem através do ambiente ácido do estômago. Após exposição a estas condições o processo é rápido. O trofozoíto que emerge, apresenta 4 núcleos e 8 flagelos, sofre citocinese resultando deste processo 2 trofozoítos (Adam, 2001). 4. Ciclo biológico Como já foi referido Giardia spp. existe em duas formas com interesse para o seu ciclo biológico (Figura 9). O trofozoíto que se multiplica, alimenta e parasita o hospedeiro e o quisto, forma infectante e resistente no ambiente. A infecção é iniciada após a ingestão dos quistos infectantes e maduros. O desenquistamento ocorre no intestino delgado e um trofozoíto emerge do quisto, sofre rápida divisão citoplasmática, mas não nuclear, formando 2 trofozoítos binucleados. Os trofozoítos acoplam-se à superfície dos enterócitos do jejuno e duodeno e após ligação sofrem outra divisão por fissão binária (Figura 10) (Smith & Paget, 2007). Apesar de a reprodução ser considerada assexuada Meloni et al (1989) referem que um estado diplóide no ciclo de vida abre a possibilidade de existência de reprodução sexuada. 13

33 Figura 9 Ciclo biológico de Giardia spp. Adaptado de Smith & Paget (2007) A formação de quistos ocorre à medida que o parasita transita em direcção ao cólon, apesar de ambos trofozoítos e quistos poderem ser encontradas nas fezes, normalmente 5-7 dias pósinfecção. O período pré patente (ppp) de Giardia spp. em cães e gatos é 5 a 16 dias e a excreção dos quistos é muitas vezes intermitente (Thompson, Palmer, & O'Handley, 2008). Figura 10 Desenquistamento (esq) e fissão binária (dir). Micrografia electrónica de varrimento colorida digitalmente. Fonte: (Erlandsen, 2005a) 14

34 5. Epidemiologia As vias de transmissão ambientais incluem todos os meios ou veículos que contêm formas infectantes suficientes sendo os mais comuns a água e alimentos (Smith, Cacciò, Cook, Nichols, & Tait, 2007). A transmissão de Giardia pode ocorrer através de qualquer mecanismo pelo qual material contaminado com fezes contendo quistos infectantes de seres humanos ou animais possa ser ingerido por um hospedeiro susceptível (Smith & Paget, 2007). Os quistos de Giardia são transmitidos por via fecal-oral, directa ou indirectamente e ao contrário das coccídeas e helmintes não precisam de um período de maturação, pois imediatamente após excreção são capazes de infectar um novo hospedeiro (Plutzer, Ongerth, & Karanisc, 2010). Um pequeno número de quistos (10-100) pode iniciar a infecção (Ballweber, Xiao, Bowman, Kahn, & Cama, 2010). Os potenciais mecanismos de transmissão incluem pessoa a pessoa, animal a animal, animal a pessoa ou vice-versa (zoonótico), através da água, quer pelo consumo ou através de actividades de recreio, pelos alimentos e ainda por contacto sexual em grupos de risco (Plutzer, Ongerth, & Karanisc, 2010). As espécies de Giardia capazes de infectar vários hospedeiros, como é o caso de G. duodenalis, são mantidas numa variedade de ciclos de transmissão (Figura 11) que podem ser sustentados independentemente, sem interacção entre os mesmos (Hunter & Thompson, 2005). No entanto devemos considerar a forma como estes ciclos interagem entre si e tentar determinar a frequência de transmissão dos genótipos zoonóticos (Thompson, 2004). Figura 11 Diagrama dos ciclos de transmissão de Giardia. Adaptado: (Hunter & Thompson, 2005) Água Alimento Animais Silvestres Humanos Animais de Produção Cão/Gato 15

35 Os estudos epidemiológicos demonstram que as infecções por Giardia ocorrem mais frequentemente em canis ou estabelecimentos de criação intensiva que em cães mantidos isoladamente, como animais de companhia ou mesmo de pequenos criadores. Assim, mesmo as taxas de prevalência também variam de acordo com a composição da população canina em estudo, com a literatura a estimar taxas de infecção aproximadas de 10% para cães bem cuidados, 36 a 50% em cachorros e valores de até 100% em canis de criação. Os cães criados em canil são afectados, maioritariamente, por parasitas de ciclo de vida directo, quer por transmissão directa quer através de fomites. Isto acontece principalmente pelas fracas condições higiénicas presentes no canil, com a infecção a originar-se na ingestão de quistos durante a alimentação ou na água de bebida contaminadas por fezes de animais infectados, ou até pelo contacto directo com a pelagem contaminada desses mesmos animais (Papini, Gorini, Spaziani, & Cardini, 2005) Potencial e risco zoonótico G. duodenalis é o parasita gastrointestinal mais encontrado em todo o mundo. O seu maior impacto clínico está ligado a crianças nos seus primeiros anos de vida (Eligio-Garcia, Cortes- Campos, & Jimenez-Cardoso, 2005). A giardiose é também reconhecida mundialmente como a doença dos viajantes em particular nos países em desenvolvimento (Wolfe, 1992). É considerada a causa mais comum de surtos associados a água para consumo humano, com uma prevalência de 20 a 30% nos países em desenvolvimento, tendo sido sugerida uma relação com o atraso no crescimento em crianças (Júlio, et al., 2012). Contribui anualmente para 280 milhões de infecções sintomáticas em humanos e foi incluída como parte da Neglected Disease Initiative da OMS desde 2004 (Ankarklev, Jerlstrom-Hultqvist, Ringqvist, Troell, & Svard, 2010; Savioli, Smith, & Thompson, 2006). A giardiose trata-se de uma doença de notificação obrigatória em alguns países industrializados como é o caso do Canadá, Japão, Estados Unidos da América e Nova Zelândia (Ballweber, Xiao, Bowman, Kahn, & Cama, 2010). Na Europa no entanto, não é o caso. A notificação na Bélgica e em Espanha é voluntária e só é necessária no Reino Unido e no País de Gales se se relacionar com intoxicações alimentares. O Centers for Disease Control and Prevention (CDC) estima que ocorrem 2 milhões de casos por ano nos Estados Unidos da América, com o maior números de casos em crianças até aos 9 anos e em adultos entre os 35 e os 44 anos de idade (Figura 12). Estes casos surgem em regiões mais a norte do país e com o pico no início do verão até ao início do outono (Ballweber, Xiao, Bowman, Kahn, & Cama, 2010). 16

36 Figura 12 Ciclo de vida de Giardia spp. e possíveis fontes de contaminação para humanos. Adaptado: (DPDx, 2010) A giardiose humana apresenta-se com uma diversidade de manifestações clínicas, que variam de casos assintomáticos a agudos, intermitentes ou crónicos de diarreia não sanguinolenta. Outros sintomas podem incluir cãibras, náuseas, vómitos, esteatorreia, anorexia e perda de peso, sem que haja presença de sangue nas fezes (Ballweber, Xiao, Bowman, Kahn, & Cama, 2010). A enterite por Giardia pode ainda ser relacionada com a Síndrome de Fadiga Crónica (SFC), como revela o trabalho de Naess et al (2012), onde 60% dos 96 pacientes com fadiga pósinfecciosa de longa duração e com confirmação laboratorial de giardiose, foram diagnosticados com SFC. O potencial risco de saúde para os humanos de parasitas gastrointestinais de cães e gatos mantém-se como um problema significativo em todo o mundo. Estudos recentes nos Estados Unidos e na Austrália demonstraram valores de infecção por Giardia superiores aos esperados (Carlin, Bowman, & Scarlett, 2006). Para além de ser comumente descrito em humanos, este parasita é também frequentemente encontrado em animais domésticos, especialmente em animais de pecuária, cães, gatos e numerosas espécies de mamíferos silvestres e aves (Thompson, 2004b). No caso particular, os cães podem albergar espécies de Giardia potencialmente infectantes para os humanos em especial a indivíduos imunocomprometidos (Papini, Gorini, Spaziani, & Cardini, 2005). 17

37 Foram ainda encontrados isolados de diferentes espécies de Giardia em peixes, como pode ser visto no trabalho de Yang et al (2010) onde foi estudada a prevalência dos genótipos zoonóticos em alevins de cultura, de água doce e salgada. Cães e gatos têm sido mantidos na linha da frente como fontes regulares de infecção humana com G. duodenalis e como portadores deste agente zoonótico (Bowman & Lucio-Forster, 2010). No entanto e apesar da significância clínica de Giardia em cães e gatos parecer ser mínima, a importância em saúde pública da infecção nesses animais tem sido objecto de debate e é ainda uma questão que levanta alguma incerteza entre os veterinários (Thompson, 2004a). De um ponto de vista de saúde pública, os maiores e potenciais riscos advém dos genótipos das assemblages A e talvez numa menor dimensão das assemblages B. A epidemiologia molecular já demonstrou inequivocamente que as espécies de Giardia que infectam humanos também podem ser surgir em várias outras espécies de mamíferos. (Thompson, Hopkins, & Homan, 2000). Podemos tomar como exemplo o facto de ser comum a presença tanto da assemblage D (específica para o cão) como da assemblage A, nos cães em ambiente urbano e doméstico na Austrália, sendo assim de considerar a possibilidade da transmissão zoonótica da assemblage A entre os animais e os seus proprietários. A possibilidade de transmissão é salientada por ser mais comum a infecção nos cães que vivem em lares com mais do que um animal em relação aos que possuem apenas um animal. Apesar destas evidências, os estudos epidemiológicos moleculares em locais endémicos, onde a frequência de transmissão de genótipos zoonóticos e não zoonóticos é elevada, providenciará informação útil no que respeita à frequência de transmissão zoonótica (Thompson, 2004a). Considerando as assemblages A e B as de maior potencial zoonótico estão descritos vários casos e estudos onde se podem encontrar evidências da presença destes genótipos em diferentes espécies animais. Nos animais de produção e particularmente em vacas de leite e de carne, Mendonça et al (2007) referem a presença de assemblages A e B na zona norte de Portugal, salientando que a assemblage E é no entanto a mais prevalente. Os animais de companhia como o cão e o gato porém, mostram-se capazes de albergar as assemblages A e B para além das específicas da sua espécie como é o caso das C e D para o cão e F para o gato. Poucos estudos até agora compararam os isolados de Giardia de humanos e animais que partilham o mesmo local. Como exemplo de contraste os estudos nas comunidades aborígenes da Austrália demonstraram que o genótipo específico do cão (assemblage C e D) predominava nos animais infectados, enquanto nas regiões remotas de Assam, Índia, as infecções de humanos e animais vieram a demonstrar a presença dos genótipos zoonóticos nos cães infectados (Thompson, 2004a). No entanto, muitos estudos enaltecem o papel chave do 18

38 saneamento e higiene pessoal como o maior factor de risco para giardiose nos países em desenvolvimento sugerindo ainda que a transmissão zoonótica tem um papel, quando muito, menor (Hunter & Thompson, 2005). No entanto o trabalho de Eligio-Garcia et al (2005) demonstra o isolamento da assemblage A de G. duodenalis em fezes de humanos e de cão do mesmo ambiente, através de resultados genotípicos. Existem no entanto algumas discrepâncias sobre a relevância da transmissão zoonótica, com Thompson (2004b) a referir que o potencial zoonótico de Giardia não está mais em causa mas a informação relativa à frequência da transmissão é escassa., E em contraposição Ballweber et al (2010) salientam que o papel do cão e gato como fonte de giardiose humana continua por resolver, apesar de alguns estudos com limitado número de casos providenciarem pouca evidência da transmissão zoonótica, o potencial papel do cão e gato, provavelmente menor, não pode ser excluído de forma conclusiva. 6. Sinais clínicos A infecção por Giardia é comum mas o organismo nem sempre é um agente patogénico primário efectivo, porque muitos dos cães e gatos infectados são portadores subclínicos (Tangtrongsup & Scorza, 2010). A maioria das infecções por Giardia nos cães são assintomáticas, porém alguns dos animais infectados podem sofrer de diarreia aguda ou crónica, perda de peso, diminuição no ganho de peso apesar de manterem um apetite normal e ainda, mas menos comum, vómitos e letargia (Hamnes, Gjerde, & Robertson, 2007). A diarreia pode surgir logo aos 5 dias pós-infecção e o aparecimento de quistos após uma ou duas semanas (Bowman, 2009a). A perda de peso pode ocorrer nos casos de má absorção crónica, podendo o animal parecer aquém do seu desenvolvimento normal (Tangtrongsup & Scorza, 2010). Quando a diarreia está presente, esta é pastosa a líquida, frequentemente com muco e um odor forte, e esteatorreia também pode ocorrer. É normalmente auto-limitante em animais imunocompetentes (Tangtrongsup & Scorza, 2010). Os casos crónicos são caracterizados por episódios breves ou persistentes de diarreia recorrente, com a possibilidade da cronicidade desta infecção estar ligada ao fenómeno de variação antigénica do parasita (Muller & von Allmen, 2005). Geralmente controlada por um sistema imunitário saudável pode ser fatal em animais com uma imunidade comprometida (Rosa et al., 2007). 7. Patogenia Vários protozoários são sujeitos a variação antigénica, essencialmente um mecanismo de evasão da resposta humoral dos seus hospedeiros vertebrados. Nas espécies de Giardia tal é 19

39 atingido através dos mecanismos de expressão dos genes que codificam as VSP, que são proteínas de superfície (Ankarklev et al, 2010). As infecções por Giardia spp. em ratinhos mostraram danos na superfície da mucosa do intestino delgado por atrofia das criptas e das microvilosidades e ainda alteração da actividade de certas enzimas digestivas como as proteases, lipases e dissacaridases (Roxstrom-Lindquist, Palm, Reiner, Ringqvist, & Svard, 2006). No entanto os sintomas associados a giardiose podem surgir sem que haja atrofia das vilosidades ou qualquer outro sinal de dano da mucosa (Roxstrom-Lindquist et al, 2006; Buret, 2008) Os factores associados com a progressão da doença incluem o estado clinico e nutricional do hospedeiro, idade e resposta imunitária. Poucos factores de virulência foram identificados até à data mas os principais incluem o disco ventral, os flagelos e as VSP (Tabela 3) (Ankarklev et al, 2010). Giardia spp. têm de ser capazes de se acoplar ou ligar às células epiteliais para manter a infecção no intestino delgado do hospedeiro e assim prevenir a sua eliminação pelos movimentos peristálticos. Aqui se mostra a importância do disco ventral que vai permitir que o parasita se liberte e movimente (Elmendorf, Dawson, & McCafrey, 2003). Tabela 3 Principais factores de virulência de Giardia spp. Adaptado de Ankarklev et al (2010). Função Ligação Evasão dos factores naturais do lume intestinal Variação antigénica Alteração das defesas inatas do hospedeiro Modificações anti-inflamatórias Sobrevivência no ácido estomacal e no ambiente externo Factor de virulência O disco ventral e as lectinas permitem a ligação e colonização do endotélio intestinal Motilidade (flagelos) permite a relocalização para novo endotélio durante a colonização Alteração das VSP na superfície do trofozoíto evita a acção das IgA Libertação de produtos reguladores da diminuição da produção de óxido nítrico pelo epitélio Papel anti-inflamatório de produtos ainda desconhecidos dos trofozoítos Diferenciação em quistos Apesar do trofozoíto interferir com a integridade do epitélio do intestino delgado os mecanismos patogénicos específicos ainda não foram totalmente esclarecidos, nem o facto de alguns indivíduos permanecerem assintomáticos e outros mostrarem sinais graves da doença (Wolfe, 1992). No entanto o trofozoíto é encontrado na superfície do epitélio intestinal e como tal é pouco provável que a patogénese seja consequência de danos directos na célula. Os 20

40 mecanismos de patogenia propostos incluem produção de toxinas, disrupção da flora microbiana normal, indução de alterações inflamatórias intestinais, inibição da função enzimática normal, danos nas microvilosidades, indução de alterações da motilidade e da apoptose celular, tendo como resultado a diarreia por má absorção e hipersecreção intestinais (Tangtrongsup & Scorza, 2010). Através de modelos in vivo e in vitro foi estabelecido que os parasitas do género Giardia aumentam a permeabilidade intestinal sugerindo os dados disponíveis que tal é resultado da apoptose celular induzida pelo parasita, sendo também reconhecido que esta alteração estará na origem da má absorção de glucose, sódio e água, concorrendo todos estes factores para a síndrome diarreica associada a este protozoário (Buret, 2008). A maioria dos autores reconhece a importância do sistema imunitário e de uma resposta adequada do mesmo no mecanismo que levará à eliminação da infecção, de uma possível reinfecção e da dimensão dos danos causados pelo parasita. Faubert (2000) refere essa mesma importância dos linfócitos T na eliminação da infecção primária e na subsequente reinfecção. Os danos da bordadura em escova e das deficiências na actividade da dissacaridase são mediados por células T CD8+ e não apenas um resultado do acoplamento dos trofozoítos e dos factores de virulência, uma vez que tais alterações não são observáveis em hospedeiros privados de linfócitos T funcionais (Buret, 2008; Scott, Yu, & Buret, 2004). No entanto Scott, Meddings, Kirk, Lees-Miller, & Buret (2002) especulam que a perda da função de barreira epitelial exercida pelo intestino delgado na giardiose é induzida independentemente da presença de linfócitos T, demonstrando que o aumento da permeabilidade intestinal pode ser detectado tanto em animais atímicos como em animais imunocompetentes. 8. Prevalência As taxas de prevalência para infecção por Giardia em cães (Tabela 4) e mesmo em gatos variam de acordo com diversos factores nos quais se incluem a população em estudo, a área e as condições existentes no local onde os animais estão presentes, o método de diagnóstico usado e as condições higio-sanitárias dos animais. A prevalência de giardiose nos cães pode ser de 10% para cães de particulares e bem tratados, pode atingir os 50% em cachorros e eventualmente chegar aos 100% em animais pertencentes a abrigos ou canis (Rosa, et al., 2007). De destacar o trabalho efectuado em Portugal por Lebre (2011), em que mais de 60% (n= 54) das amostras fecais de cães foram positivas para este protozoário. 21

41 Tabela 4 Prevalência de Giardia em cães de acordo com a sua origem, na Europa País/Região Origem Amostra Prevalência (%) Referência Alemanha Dono % Epe et al, 2010 Bélgica Canil % Claerebout et al, 2009 Eslováquia Vários % Szabová et al, 2007 Espanha Dono % Epe et al, 2010 França/Paris Dono % Beugnet et al, 2000 Holanda Dono % Epe et al, 2010 Itália/Roma Dono % Papini et al, 2004 Noruega Dono/Canil % Hamnes et al 2007 Polónia Cães de trenó % Bajer et al, 2011 Portugal/Lisboa Canil % Lebre, 2011 Reino Unido/Londres Canil % Upjohn et al, 2010 Vários estudos têm sido realizados a nível mundial para a prevalência de Giardia (Anexo 2). Os animais jovens apresentam taxas de incidência superiores tomando como exemplo um estudo efectuado nos Estados Unidos da América onde a prevalência média situou-se nos 4,0% e a taxa para os animais com idades inferiores a 6 meses atingia os 13,1% e valores inferiores a 1% em animais com mais de 3 anos de idade. Parece não existir diferença significativa nas taxas de prevalência dos animais que apresentam diarreia ou outro sintoma dos animais assintomáticos. Quando comparados os parâmetros, o que mais evidencia diferenças é a origem ou o ambiente em que o animal se insere com a prevalência a mostrar-se superior nos animais de canil ou abrigos em relação aos animais de proprietários privados (Tangtrongsup & Scorza, 2010). No que se refere exclusivamente a canis de criação no trabalho realizado por Itoh et al (2005) em 14 diferentes canis no Japão, foi observada a presença de Giardia em todos sem excepção, com as prevalências a variarem entre 6,7% e 59,3%. 9. Diagnóstico A escolha de um método de diagnóstico eficaz tem sido algo bastante debatido ao longo dos anos sobretudo devido ao comportamento específico do parasita durante o seu ciclo biológico. A intermitência na excreção dos quistos é uma das principais barreiras no correcto diagnóstico 22

42 de giardiose, para além da sua reduzida dimensão, associada muitas vezes à falta de experiência necessária para uma correcta identificação destes parasitas por parte dos veterinários ou outros operadores (Epe, Rehkter, Shnieder, Lorentzen, & Kreienbrock, 2010). Se o animal tiver sido sujeito a medicação prévia ou eventualmente submetido a alguma intervenção tais acções podem levar a alterações na morfologia e/ou na quantidade de parasitas presentes, tornando mais árdua a tarefa de os identificar (Wolfe, 1992). Os cães jovens excretam em média 2000 quistos por grama de fezes, podendo os animais infectados excretar entre 26 e quistos por grama de fezes. Os picos de excreção são esporádicos e não cíclicos, sendo que a duração entre dois picos poderá ocorrer entre 2 a 7 dias e por esta razão não poderemos excluir uma infecção com base apenas num único resultado negativo (Tangtrongsup & Scorza, 2010). Um conjunto de 3 ou mais recolhas espaçadas num período de sete dias e recorrendo a mais do que um método de análise, aumentará a probabilidade de atingir um verdadeiro diagnóstico, porém numa clínica e numa abordagem mais prática esta recolha consecutiva pode, por vezes, mostrar-se pouco exequível (Dryden, Payne, & Smith, 2006) Análises coprológicas microscópicas A microscopia óptica continua a ser o método mais prático e económico para diagnóstico principalmente na prática veterinária clínica do dia-a-dia (Thompson, Palmer, & O'Handley, 2008). Tanto os quistos como os trofozoítos podem ser observados (Figura 13), quer por esfregaço directo ou seguidos de métodos de concentração com açúcar, sulfato de zinco ou formalina, sendo que para uma melhor observação dos trofozoítos e da sua motilidade deve ser usado um exame a fresco com fezes recentes (Geurden & Claerebout, 2010). A utilização de sulfato de zinco (ZnSO 4 ) como solução para técnicas de flutuação na pesquisa de Giardia parece ser a ideal, principalmente por não introduzir alterações morfológicas significativas nos quistos ao contrário de soluções com açúcar ou NaCl, que provocam distorções no citoplasma dos mesmos (Dryden, Payne, & Smith, 2006; Tangtrongsup & Scorza, 2010). Uma das outras desvantagens do uso de soluções de NaCl é a rápida cristalização que ocorre à temperatura ambiente, o que torna dificil em certos casos a visualização dos parasitas. A observação das lâminas deve ser feita 15 a 20 minutos após a preparação e se tal não for possivel podem ser armazenadas a 4ºC durante vários, dias mas não congeladas. Apesar de a sensibilidade ser menor quando comparada com outros testes, os métodos de flututação fecal mantêm-se como os principais testes de diagnóstico de Giardia devido também à possibilidade de identificação de outros potenciais parasitas (Tangtrongsup & Scorza, 2010). 23

43 Podem ser adicionados vários tipos de corantes para evidenciar estruturas facilitando a identificação de quistos e trofozoítos, sendo os mais utilizados a solução de Lugol, o azul de metileno e a coloração por Giemsa (Tangtrongsup & Scorza, 2010; Geurden & Claerebout, 2010). A microscopia óptica, no diagnóstico de Giardia, não necessita de reagentes específicos, é simples, apresenta elevada especificidade, mas no entanto depende de um operador treinado e experiente para obter melhores resultados (Sulaiman & Cama, 2006; Geurden & Claerebout, 2010). Figura 13 Quistos de Giardia, centrifugação em ZnSO 4. Fonte: Dryden, Payne & Smith (2006) 9.2. Testes imunológicos para detecção de antigénios de Giardia Existem comercialmente testes de imunofluorescência directa (IFD), ELISA e métodos de imunocromatografia qualitativa. Os testes de IFD e ELISA utilizam anticorpos monoclonais contra as proteínas presentes na parede do quisto. No entanto estes testes são objectivamente mais dispendiosos que o exame por microscopia óptica, para além de requererem técnicos especializados. No entanto existem testes de imunocromatografia que também utilizam anticorpos monoclonais direccionados contra proteínas específicas da parede dos quistos e trofozoítos, de rápida preparação e leitura tanto para animais de companhia como de pecuária (Geurden & Claerebout, 2010). É o caso do Speed Giardia da BVT (Virbac), um teste de imunocromatrografia que detecta coproantigénios dos quistos de Giardia e que de acordo com o fabricante apresenta uma sensibilidade de 95.6% e uma especificidade de 100%. É um teste qualitativo com um limiar de detecção de 80 quistos por grama de fezes. 24

44 É estimado um valor de 2% para falsos-positivos e falsos-negativos nos métodos de ELISA e IFD, com os primeiros a estarem provavelmente relacionados com o facto de outros coproantigénios se ligarem não-especificamente aos reagentes e os falsos-negativos estarem associados ao limiar de detecção do método em questão (Tangtrongsup & Scorza, 2010) Métodos moleculares para pesquisa de ADN de Giardia - PCR O método da Polimerase Chain Reaction (PCR) está sobretudo indicado para a identificação de diferentes espécies e genótipos de Giardia, particularmente na pesquisa epidemiológica e taxonómica. Em termos de diagnóstico tem elevado valor pois um quisto será suficiente para obter o resultado positivo e daí a sua elevada sensibilidade (Geurden & Claerebout, 2010). No entanto Tangtrongsup & Scorza (2010) referem que existe uma taxa de 20% de insucesso na amplificação do ADN através de PCR de Giardia em amostras positivas e que esse dado estará relacionado com a presença de factores de inibição nas fezes sendo que é um método dispendioso e só está aconselhado para pesquisa e identificação das assemblages de G. duodenalis no cão e no gato. 10. Tratamento Apesar da disponibilidade e uso de vários fármacos no tratamento de infecções por Giardia, nenhum deles se mostrou inteiramente satisfatório devido à incidência de efeitos adversos indesejados, frequentes reinfecções, actividade sobre a flora intestinal, potencial carcinogénico e resistência do próprio parasita (Eissa & Amer, 2012). A necessidade do tratamento tanto em animais assintomáticos como aqueles que apresentam sinais clínicos associados a giardiose, está ligada ao potencial zoonótico do parasita e ao facto da importância da infecção nos animais ainda não estar completamente esclarecida (Thompson, Palmer, & O'Handley, 2008). A European Scientific Counsel Companion Animal Parasites (ESCCAP) refere nas suas directrizes como opções de tratamento o febendazol, metronidazol, tinidazol e a combinação de fenbantel, pirantel e praziquantel (European Scientific Counsel Companion Animal Parasites, 2011) Febendazol Trata-se de um anti-helmíntico usado num grande número de espécies animais contra inúmeros parasitas, nos quais podemos incluir ascarídeos, nematodes e cestodes. Trata-se de um benzimidazol de largo espectro contra vários parasitas internos e a sua biodisponibilidade é superior quando ingerido com alimento. Apesar de ser bem tolerado em doses até 100 vezes 25

45 a recomendada os efeitos de toxicidade por febendazol podem incluir vómitos, salivação e diarreia podendo surgir reacções de hipersensibilidade resultantes da morte dos parasitas (Plumb, 2011). É considerado seguro para ser usado em cadelas gestantes e em cachorros a partir das 6 semanas de idade, sendo considerado o tratamento de eleição na giardose em animais gestantes ou em lactação (Thompson, et al, 2008; Plumb, 2011). Para o tratamento de giardiose a dose recomendada é 50 mg/kg PO, durante 3 dias consecutivos podendo prolongar-se até 7 dias se a infecção se mantiver (Thompson et al, 2008; Tangtrongsup & Scorza, 2010; Plumb, 2011) Febantel/Pirantel/Praziquantel Pirantel é um anti-helmíntico usado principalmente contra ascarídeos e em menor escala, outros nematodes, sendo fracamente absorvido no tracto gastrointestinal permitindo a sua acção na porção distal do tubo digestivo em cães. O praziquantel é também um antihelmíntico de acção contra cestodes como é o caso do Dipylidium caninum e da Taenia pisiformis (Plumb, 2011). O febantel é considerado um pro-benzimidazol e é metabolizado em febendazol e oxfendazol (moléculas com actividade farmacológica) e apresenta larga margem de segurança no uso em cães (Thompson, Palmer, & O'Handley, 2008). A combinação destes três produtos está disponível comercialmente (Drontal e Drontal Plus, Bayer) e apesar da acção anti-helmíntica dos componentes também é usado contra Giardia. A fórmula comercial existente na Europa contém 50 mg de praziquantel, 144 mg de pirantel (pamoato) e 150 mg de febantel e recomenda que o tratamento seja prolongado durante 3 a 5 dias, PO, que vai ao encontro das directrizes da ESCCAP ( Thompson et al, 2008; Bowman et al, 2009b; Tangtrongsup & Scorza, 2010; European Scientific Counsel Companion Animal Parasites, 2011) Metronidazol É um agente antibacteriano e antiprotozoário com actividade contra anaeróbios e age ainda como amebicida directo e tricomonicida, sendo usado contra Trichomonas, Giardia, Balantidium coli e Entamoeba histolytica. Está contra-indicado o seu uso em animais debilitados ou em recuperação, assim como em fêmeas gestantes e os seus efeitos secundários incluem alterações neurológicas, letargia, fraqueza, anorexia, vómito, diarreia, hepatotoxicidade, neutropenia e hematúria (Plumb, 2011). A sua utilização já foi indicada nos casos de infecção concomitante por Clostridium perfringens pela actividade antibiótica do fármaco e pelas suas propriedades anti-inflamatórias (Tangtrongsup & Scorza, 2010). A dose 26

46 de metronidazol recomendada é de 25 mg/kg BID, PO durante 5 dias (European Scientific Counsel Companion Animal Parasites, 2011). Têm sido descritos casos de resistência ao metronidazol e a consequente diminuição da sua eficácia sendo esta uma das causas apresentadas para a falha do tratamento (da Silva, et al., 2011; Eissa & Amer, 2012) Albendazol É um antiparasitário de largo espectro com acção contra nematodes, cestodes e protozoários, indicado sobretudo para espécies pecuárias, em particular bovinos e ovinos. Apesar da sua acção contra Giardia em animais de companhia devem ser tomadas precauções na administração deste medicamento devido aos seus efeitos teratogénicos e embriotóxicos podendo doses de 50 mg/kg em cães provocar anorexia (Plumb, 2011). O tratamento com albendazol em cães e gatos demonstrou a interrupção na excreção de quistos, mas esta terapia pode provocar supressão da medula óssea e pode ser considerada como causa de anemia aplástica em cães e gatos (Bowman, 2009ª; Plumb, 2011; Tangtrongsup & Scorza, 2010). As doses usadas no tratamento de giardiose, 25 mg/kg BID PO, não devem ultrapassar um total de 4 doses (Bowman, 2009a) Outras opções de tratamento Principalmente devido aos efeitos adversos e ao aumento dos casos de resistências reportados dos fármacos mais usados no tratamento de giardiose, novos fármacos poderão substituí-los. Temos como exemplo os nitroimidazóis, como o ronidazol e o tinidazol, sendo este último já usado no tratamento de giardiose em humanos nos EUA e o primeiro é a droga de eleição no tratamento de Tritrichomonas foetus em gatos. O uso de ronidazol é recomendado numa dose de 30 a 50 mg/kg, BID, PO durante 7 dias (Fiechter, Deplazes, & Schnyder, 2012) e o tinidazol numa dose de 44 mg/kg, SID, PO durante 6 dias (Bowman, 2009a). Também pode ser usada a quinacrina, um antiprotozoário que ajuda a melhorar os efeitos da infecção por Giardia, mas não a elimina (Plumb, 2011), na dose de 6,6 mg/kg BID durante 5 dias (Bowman, 2009a). O estudo realizado por Chon e Kim (2005) salienta a eficácia da combinação de silimarina, um colerético nutracêutico, com metronidazol, em comparação ao uso isolado deste último no tratamento de infecções por Giardia, em doses de 3,5 mg/kg de silimarina e de 50 mg/kg de metronidazol, SID, PO durante 7 dias. 27

47 O uso de miltefosina, um antiprotozoário usado no tratamento de leishmaniose, em infecções por Giardia também está descrito com boa actividade contra o parasita, tanto in vitro, como in vivo em ratinhos (Eissa & Amer, 2012). 11. Prevenção e controlo A adição de fibra à dieta (ou aumentando o teor desta), pode ajudar no controlo dos sinais clínicos de giardiose em alguns animais, nomeadamente no controlo do sobrecrescimento bacteriano ou na inibição da ligação do parasita às microvilosidades intestinais (Tangtrongsup & Scorza, 2010). A imunoterapia com vacina contra Giardia (GiardiaVax, Fort Dodge) mostrou diminuir a excreção de quistos e a diarreia em alguns cães (Tangtrongsup & Scorza, 2010). No entanto, a eficácia destas vacinas tem sido questionada pelos veterinários, com a maioria a considerar que possuem pouco valor terapêutico, com estudos realizados a demonstrar a incapacidade de eliminar os organismos das fezes de cães e gatos (Bowman, 2009a). Este modelo terapêutico parece não estar mais disponível para comercialização nos EUA (Tangtrongsup & Scorza, 2010). Apesar da possível eficácia da terapia medicamentosa na eliminação da infecção, os casos de reinfecção podem ocorrer por fontes de contaminação ambiental e se a frequência de transmissão se mantiver elevada. Este dado tem elevada importância nas comunidades ou nas instituições onde a higiene é negligenciada ou pode estar comprometida, como é o caso dos canis e gatis (Thompson A. R., 2004b). O controlo da infecção engloba a prevenção de contaminação fecal das fontes de água e alimento, adequado saneamento e desinfecção do ambiente com lisol (2% a 5%) ou hipoclorito de sódio (1%) (Bowman, 2009a). O estudo realizado por Fiechter et al (2012) refere a importância do banho dos animais no início e fim da terapêutica medicamentosa no sentido de eliminar os quistos presentes no pêlo dos animais, para além de outras medidas como desinfecção das jaulas também no início e fim do tratamento e a mudança de calçado do tratador de modo a prevenir a reinfecção com quistos provenientes do ambiente. Um exame fecal periódico e o tratamento com fármacos giardicidas apropriados contribuirão para prevenir a infecção por Giardia em cães de canis de criação, quer estes apresentem sintomas ou não (Itoh, Muraoka, Saeki, Aoki, & Itagaki, 2005). 28

48 IV. Estudo Prático Parasitismo por Giardia spp. em canis de criação na região de Viseu, Portugal 1. Objectivos A realização deste estudo teve como objectivo avaliar as diferenças entre 2 canis de criação de diferentes raças de cães na zona de Viseu e a sua relação com a prevalência de Giardia spp., tendo em conta o potencial zoonótico deste parasita, o risco ou impacto que o mesmo poderá ter para os agentes que lidam diariamente com os animais, o risco de infecção dos próprios animais e ainda com a comercialização dos canídeos infectados com o parasita. Dentro destes factores procurou-se analisar diferentes parâmetros como o sexo, idade, raça, doenças préexistentes, medicação e desparasitações relacionando-os com a prevalência de Giardia assim como a densidade populacional em cada um dos locais observados. Procurou-se ainda analisar as diferenças em relação à facilidade de execução e de interpretação dos 3 métodos seleccionados de diagnóstico, o teste rápido Speed Giardia, a flutuação passiva com ZnSO 4 e a coloração pela técnica de Ziehl-Neelsen. 2. Material e métodos 2.1. Locais Viseu, capital de distrito, é uma cidade localizada na Beira Alta, no denominado Planalto de Viseu, encerrada entre o norte e centro de Portugal. É atravessada por quatro rios, o Vouga, o Dão, o Paiva e o Pavia e apresenta um clima mediterrânico, com elevadas amplitudes térmicas, invernos rigorosos e húmidos e verões quentes e secos (Câmara Municipal de Viseu, 2012). Os 2 canis representados neste estudo encontram-se situados no concelho de Viseu, distanciados um do outro cerca de 30 km, sem existir ligação entre os animais presentes em cada um dos mesmos Canil/Criador nº1 (C1) O canil denominado nº1 (C1) situa-se afastado da cidade, numa zona mais rural, sem habitações circundantes e albergava cerca de 70 cães, de 12 raças diferentes. O canil está dividido em 3 zonas com boxes (Figura 14) que alojam normalmente apenas um cão, salvo algumas excepções como é o caso dos animais jovens da mesma ninhada. Uma das zonas do canil que podemos denominar de maternidade, é onde se encontra maior concentração de animais por albergarem as fêmeas e as respectivas ninhadas. Os animais interagem entre si 29

49 sobretudo na altura dos processos de limpeza das instalações, sendo-lhes dado acesso ao exterior. Figura 14 Vista de uma das zonas com boxes individuais do C Canil/Criador nº2 (C2) O canil C2 situa-se, rodeado por uma zona habitacional, perto do centro da cidade e albergava não mais de 10 animais de 3 raças, Boieiros de Berna (Bouvier Bernois), Doberman e Retriever do Labrador, que se encontravam alojados individualmente salvo rara excepção Amostras Foram recolhidas um total de 51 amostras divididas entre os canis C1 e C2, durante o mês de Março de 2012 (Tabela 5). Procedeu-se à recolha das fezes aquando da limpeza das instalações que permitia o acesso do animal ao exterior, e normalmente nessa altura ocorria a defecação. Algumas das amostras foram recolhidas ainda dentro da box logo após a defecação. As amostras eram mantidas em contentores refrigerados, em sacos plásticos devidamente identificados com o número e data da amostra. Simultaneamente à recolha era também pedido aos criadores o preenchimento de um inquérito relativo aos dados do animal, exemplar presente no Anexo Análise estatística Os dados resultantes da análise parasitológica das amostras e dos parâmetros recolhidos com base no preenchimento dos inquéritos, foram analisados para determinar as associações entre si, em particular as associações entre a prevalência de Giardia pelos 3 testes de diagnósticos e 30

50 o sexo, idade e raça dos animais, assim como a existência de medicação e a regularidade das desparasitações interna e externa. Foram utilizados os programas SPSS 17.0 e Microsoft Excel 2010 para a realização dos testes estatísticos e representações gráficas dos resultados obtidos. Foi usado o teste de qui-quadrado (χ 2 ) que permite avaliar a associação entre variáveis independentes e cujas observações são discretas, numa escala nominal e ordinal. Este teste foi realizado com um nível de significância de 0,05. Os intervalos de confiança (IC) foram calculados com auxílio da ferramenta EpiTools e com base nos valores de especificidade (Sp) e de sensibilidade (Se) já decritos. No caso do teste rápido Speed Giardia os valores de Sp e Se usados foram os fornecidos pelo fabricante, respectivamente 100% e 95.6%. Em relação aos 2 outros métodos foram usados como referência os valores de Sp (94%) e Se (49%) de microscopia óptica calculados no trabalho de Rishniw, Liotta, Bellosa, Bowman e Simpson (2010). Tabela 5 Distribuição por canil do número de amostras recolhidas N % C ,2% C2 6 11,8% Total % 2.6. Análise e exames parasitológicos Todas as amostras foram submetidas a análise num período máximo de 48 horas após recolha, no Laboratório de Doenças Parasitárias da FMV-UTL. Todas foram analisadas segundo 3 métodos distintos: Flutuação passiva pelo método de Willis com ZnSO 4 através dos kits para amostras fecais da HenrySchein (Anexo 3); coloração dos esfregaços fecais pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada (Anexo 4); teste rápido Speed Giardia (Anexo 5). A escolha destes métodos baseou-se nas recomendações da European Scientific Counsel Companion Animal Parasites (ESCCAP) e no trabalho realizado por Dryden, Payne e Smith (2006) onde é recomendado o uso de um teste de flutuação com ZnSO 4 e um teste de pesquisa de antigénios fecais para aumentar a probabilidade de atingir resultados positivos. Para além destes métodos decidimos utilizar um método de coloração em esfregaços fecais tal como descreve Bowman (2009a) para facilitar a observação de quistos e trofozoítos aumentando o contraste do núcleo dentro do organismo. No entanto decidimos aplicar a técnica de coloração por Ziehl-Neelsen modificada, já descrita na pesquisa de protozoários do género 31

51 Cryptosporidium, mas pouco referenciada no seu uso no diagnóstico de Giardia spp., permitindo assim avaliar a sua eficácia. 3. Resultados 3.1. Caracterização da amostra no C1 Os animais do C1 apresentam uma média de idades de 4,34 anos (desvio padrão ±2,92) e cuja distribuição pode ser vista no Gráfico 2. Os grupos etários compreendem os animais jovens, com menos de 1 ano, os adultos entre 1 e 7 anos e os seniores com mais de 7 anos. Todos os animais eram alimentados com ração seca distribuída em 2 refeições diárias e com água sempre à disposição. A limpeza dos canis era efectuada diariamente da parte da manhã, através da recolha das fezes e lavagem com água e compostos comerciais à base de lixívia. Pontualmente as instalações eram sujeitas a uma limpeza com Virkon, um produto desinfectante com monopersulfato de potássio com amplo espectro contra vírus, bactérias e fungos. A desparasitação e vacinação dos animais nem sempre eram realizadas em intervalos regulares. As fêmeas gestantes eram desparasitadas 10 dias antes e 10 dias após o parto. Os cachorros eram desparasitados ao mês de idade. Normalmente não eram usados os mesmos produtos repetidamente, sendo usadas associações anti-parasitárias sobretudo contra helmintes, nematodes e coccídeas. Gráfico 2 Distribuição da idade dos animais do C < >7 Idade em anos 32

52 Os animais deste canil pertenciam a 12 raças puras diferentes (as mais representadas eram Cocker Spaniel e Bulldog Francês (Gráfico 3)). Foram estudadas 45 amostras individuais no C1 das quais 26 (57,8%) correspondiam a machos e 19 (42,2%) a fêmeas Gráfico 3 Distribuição do número de cães por raça no C Caracterização da amostra do C2 A média de idades dos animais do C2 variava entre os 6 meses e os 5 anos com uma média de 2,41 anos (desvio padrão ±1,49) com a distribuição exemplificada no Gráfico 4. Os animais representados no C2 são 3 Boieiros de Berna, 2 Doberman e 1 Retriever do Labrador, dos quais 4 (66,7%) são machos e 2 (33,3%) fêmeas. Tal como no canil 1 os animais foram distribuídos em jovens (menos de 1 ano de idade) e adultos (entre 1 e 7 anos). Os animais eram vacinados anualmente contra as doenças infecciosas e raiva e as desparasitações eram efectuadas de forma regular de 4 em 4 meses com Milbemax (milbemicina oxima e praziquantel). As instalações eram limpas diariamente com a recolha das fezes e lavagem com água dos espaços, semanalmente era realizada uma desinfecção dos locais com produtos à base de lixívia e em algumas situações era usado Pecusanol (diazinão), um organofosforado para o controlo de vectores e ectoparasitas. 33

53 Gráfico 4 Distribuição das idades dos animais no C < Idade em anos A cada amostra, que correspondia a um animal, realizou-se o teste de flutuação passiva pelo método de Willis através dos kits de flutuação fecal HenrySchein (Figura 15), com ZnSO 4 pela sua especificidade para os quistos de Giardia (Figura 16) e de acordo com as especificações do fabricante. As lâminas e lamelas resultantes, correctamente identificadas com o número da amostra e respectiva origem, foram observadas num período não superior a 30 minutos após o término do exame coprológico, na objectiva de 40x. Figura 15 - Kits para exames fecais HenrySchein. Fonte: Original 34

54 Figura 16 Quistos de Giardia. Flutuação passiva com ZnSO 4. Objectiva 40x Fonte: Original De igual forma em todas as amostras foram pesquisados corpoantigénios de Giardia spp. através dos testes rápidos Speed Giardia da BVT, Virbac ( Figura 17) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados foram avaliados em positivos e negativos dependendo da presença ou não das bandas azul e vermelha na tira imunocromatográfica. Figura 17 - Testes rápidos Speed Giardia da BVT, Virbac. Fonte: Original De cada amostra foi realizado um esfregaço fecal posteriormente corado pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada (Figura 18), com posterior visualização microscópica com uma ampliação de 400x. 35

55 Figura 18 Reagentes e aspecto das preparações submetidas à técnica de Ziehl-Neelsen modificada. Fonte: Original Os resultados apresentados baseiam-se nas observações microscópicas das amostras pelo método de flutuação passiva com ZnSO 4 e coloração de Ziehl-Neelsen bem como pela análise dos testes rápidos Speed Giardia Prevalência de Giardia spp. No Canil/Criador 1 foram detectadas prevalências de 24,4% (11/45) através do teste rápido, 22,2% (10/45) pelo método de flutuação e 20,0% (9/45) pela coloração Ziehl-Neelsen, num total de 45 amostras. No Canil/Criador 2 não foi descrito detectado nenhum caso positivo nas 6 amostras recolhidas dos animais presentes nas instalações (Tabela 6).A prevalência total nos dois canis/criadores foi de 21,6% (11/51) com base no teste rápido, 19,6% (10/51) recorrendo ao método de flutuação com ZnSO 4 e de 17,6% (9/51) pela análise das amostras após coloração pela técnica de Ziehl-Neelsen (Tabela 7). C1 C2 Tabela 6 Prevalência de Giardia de acordo com os 3 métodos utilizados Canil/Criador Speed Giardia Flutuação ZnSO 4 Coloração Ziehl-Neelsen Frequência (Positivos/n) 11/45 10/45 9/45 Percentagem 24,4% 22,2% 20,0% I.C. 95% 14,5% - 40,5% 12,7% - 70,7% 10,5% - 65,4% Frequência (Positivos/n) 0/6 0/6 0/6 Percentagem I.C. 95%

56 Tabela 7 Prevalência total de acordo com os 3 métodos utilizados Método Frequência Percentagem I.C. 95% Speed Giardia 11/51 21,6% 12,6% - 36,6% Flutuação ZnSO 4 10/51 19,6% 9,5% - 62,9% Coloração Ziehl-Neelsen 9/51 17,6% 7,6% - 56% Prevalência por idade De acordo com o parâmetro idade foi detectado uma maior prevalência nos animais adultos, ou seja, com idades compreendidas entre os 1 e os 7 anos, seguidos pelos animais jovens (até 1 ano de idade) sem que fossem descritos quaisquer casos positivos em animais seniores (com idades superiores a 7 anos) (Tabela 8). Dos 11 animais positivos pelo teste rápido Speed Giardia 8 eram adultos (72,7%) e 3 eram jovens (27,3%). Entre as 10 amostras positivas pela flutuação com ZnSO 4 7 eram de animais adultos (70%) e 3 eram jovens (30%). Com a coloração pela técnica de Ziehl-Neelsen foram detectados 9 casos positivos entre os quais 7 de cães adultos (77,8%) e 2 de cães jovens (22,2%).Estes dados não evidenciaram associação entre a idade dos animais e a prevalência de Giardia quer para o teste rápido (p> 0,05; χ 2 =3,083), o método de flutuação (p> 0,05; χ 2 =3,102) e coloração Ziehl-Neelsen; (p> 0,05; χ 2 =3,083). No entanto, não podemos deixar de constatar que 70 a 78% das amostras positivas para Giardia foram assinaladas nos animais adultos. Tabela 8 Prevalência por idade (C1) Speed Giardia Flutuação ZnSO 4 Coloração Ziehl- Neelsen Jovens Adultos Seniores Total 3 (27,3%) 8 (72,7%) - 11 χ 2 =3,083; p>0,05 (100%) 3 (30%) 7 (70%) - 10 χ 2 =3,102; p>0,05 (100%) 2 (22,2%) 7 (77,8%) - 9 χ 2 =3,083; p>0,05 (100%) Prevalência por sexo Foi possível detectar uma maior prevalência de Giardia nas fêmeas em relação aos machos como podemos verificar na Tabela 9. Dos 11 animais positivos pelo teste rápido, 10 eram fêmeas (91%) a apenas um era macho (9%). De igual modo nas análises de flutuação e coloração apenas um dos positivos correspondeu a animais do sexo masculino, com 9 fêmeas 37

57 positivas para o primeiro teste (90%) e 8 para o segundo (88,9%). Foi evidenciada uma associação entre o sexo dos animais e a prevalência de Giardia relativamente ao teste rápido Speed Giardia (p< 0,05; χ 2 =4,450). O mesmo não se verificou em relação aos métodos de flutuação (p> 0,05; χ 2 =3,665) e coloração (p> 0,05; χ 2 =2,934). Tabela 9 Prevalência por sexo (C1) Speed Giardia Flutuação ZnSO 4 Coloração Ziehl-Neelsen Machos Fêmeas Total 1 (9%) 10 (91%) 11 (100%) χ 2 =4,450; p<0,05 1 (10%) 9 (90%) 10 (100%) χ 2 =3,665; p>0,05 1 (11,1%) 8 (88,9%) 9 (100%) χ 2 =2,934; p>0, Prevalência por raça Os dados em relação à raça não revelam diferenças significativas entre a prevalência do parasita e as diferentes raças dos cães utilizados no estudo. Dos 11 casos positivos pelo teste rápido 3 corresponderamm a cães da raça Pinscher (27,2%), 2 Bulldog Francês (18,2%) e os restantes apenas um para cada uma das seguintes raças: Bulldog Inglês, Carlin Pug, Shi Tzu, Yorkshire Terrier, Basset Hound e Cocker Spaniel (Tabela 10). De igual modo surgem as prevalências para o método de flutuação passiva em que 3 animais dos 10 positivos eram de raça Pinscher, 2 de raça Bulldog Francês e os restantes a representarem apenas um animal de cada raça, com o mesmo a verificar-se pelo método de coloração que apresentou apenas 9 animais positivos com 3 da raça Pinscher e 2 Bulldog Francês. Não foram detectadas associações entre a raça e a prevalência, através do teste de qui-quadrado, pelos 3 métodos de diagnóstico (p>0,05). 38

58 Tabela 10 Prevalência por raça (C1) Speed Giardia Pinscher 3 27,2% Bulldog Francês 2 18,2% Bulldog Inglês 1 9,1% Pug 1 9,1% Shi Tzu 1 9,1% χ 2 =9,832; p>0,05 Yorkshire Terrier 1 9,1% Basset Hound 1 9,1% Cocker Spaniel 1 9,1% Flutuação ZnSO % 2 20% 1 10% 1 10% 1 10% χ 2 =11,278; p>0, % % Coloração Ziehl- Neelsen 3 33,3% 2 22,3% 1 11,1% 1 11,1% 1 11,1% χ 2 =14,196; p>0, ,1% Prevalência e medicação, doença e desparasitações Para além dos parâmetros idade, sexo e raça já apresentados foram ainda recolhidos dados em relação a outros factores como a regularidade da desparasitação interna e externa, a administração de medicação e a presença de doenças pré-existentes. Em relação às desparasitações interna e externa a maior percentagem dos animais positivos para Giardia não se encontrava sob um esquema regular de profilaxia contra parasitas, sendo que um dos animais positivos era regularmente desparasitado para endo e ectoparasitas (Tabela 11). Tabela 11 Relação de prevalência com desparasitação interna/externa (C1) Desparasitação interna/externa Regular Não Regular Speed Giardia Flutuação ZnSO 4 Coloração Ziehl-Neelsen 1 (9,1%) 10 (90,9%) p >0,05 1 (10%) 9 (90%) p >0,05-9 (100%) p >0,05 Nenhuma das amostras positivas por qualquer um dos testes correspondia a animais sob algum protocolo terapêutico (Tabela 12). Entre os 11 positivos pelo teste rápido 2 animais apresentavam doença pré-existente, em concreto alterações do foro dermatológico (sarna), e 9 não possuíam qualquer doença diagnosticada. As doenças existentes nos restantes animais, negativos para Giardia, incluíam neoplasias, leishmaniose, sarna, protusão da glândula de 39

59 Harder, fractura óssea, parvovirose e insuficiência cardíaca como está descrito nos anexo 6 e 7. Pelo método de flutuação passiva dos 10 positivos, 8 apresentavam-se sem qualquer doença e em 2 tenha sido diagnosticada doença (Tabela 13). Semelhante situação ocorreu pelo método de coloração em que dos 9 animais positivos, apenas um apresentou uma doença préexistente. Não foram verificadas quaisquer associações entre estes 3 diferentes factores pesquisados nos animais da amostra e a prevalência de Giardia. Tabela 12 Relação de prevalência e medicação (C1) Sim Medicação Não Speed Giardia Flutuação ZnSO 4 Coloração Ziehl-Neelsen - 11 (100%) p >0,05-10 (90%) p >0,05-9 (100%) p >0,05 Tabela 13 Relação de prevalência e doenças pré-existentes (C1) Doenças Pré-Existentes Ausente Presente Speed Giardia Flutuação ZnSO 4 Coloração Ziehl-Neelsen 9 (81,8%) 2 (18,2) p >0,05 8 (80%) 2 (20%) p >0,05 8 (88,9%) 1 (11,1%) p >0,05 Os dados são referentes ao Canil/Criador 1 pelos quais se pesquisou a possível associação entre a prevalência de Giardia com os factores idade, sexo, raça, desparasitação interna/externa, medicação e doenças. Não foram detectados casos positivos para Giardia no Canil/Criador 2 e por isso não foi possível aplicar os testes estatísticos e pesquisar as possíveis associações já descritas. 40

60 4. Discussão 4.1. Técnicas de diagnóstico Numa perspectiva global do número de amostras e animais analisados a taxa de prevalência foi de 21,6%. Em particular e em relação aos 3 métodos de diagnóstico obtivemos uma taxa de prevalência de 21,6% quando usado o teste rápido Speed Giardia (BVT, Virbac), 19,6% determinado por microscopia óptica pelo método de flutuação passiva (Anexo 8 Figuras 24, 25 e 26) e de 17,6% também por microscopia após coloração pela técnica de Ziehl-Neelsen. Estes valores vão ao encontro dos valores descritos por Epe et al (2010) em países europeus como Alemanha (23,75%), Espanha (25,1%), Holanda (24,62%) e Itália (25,89%) mas longe das prevalências descritas por Ferreira et al (2011) em Évora (47%) e por Lebre (2011) na região de Lisboa (61,1%). As principais diferenças entre os valores de prevalência de acordo com o teste usado dependem da sensibilidade dos mesmos e da capacidade e experiência do operador em aplicar as técnicas descritas e identificar as formas biológicas do parasita em questão, devido ao facto destas serem de dimensões consideravelmente inferiores em relação aos restantes parasitas gastrintestinais. Apesar de a análise por flutuação com ZnSO 4 ser o gold standard na pesquisa de Giardia, a eficácia deste tipo de teste requer um técnico treinado e com alguma experiência muitas vezes indisponível num ambiente mais prático de clinica ou até mesmo de hospital veterinário. O trabalho realizado por Dryden, Payne e Smith (2006) aborda esta problemática comparando a eficácia das observações efectuadas por técnicos especializados e por alunos de medicina veterinária resultando numa diferença significativa de 11 amostras determinadas negativas pelos estudantes, amostras essas que haviam sido classificadas como positivas para Giardia previamente. O uso da microscopia óptica, quer nos métodos de flutuação/centrifugação com ZnSO 4 ou outra solução quer nas técnicas de coloração, na classificação das amostras suspeitas para Giardia, não só traz vantagens em termos de diagnóstico através da visualização do parasita como também permite a identificação de outros parasitas (Anexo 8 Figura 28) que poderão não fazer parte da lista de diagnósticos diferenciais ou do objectivo da pesquisa inicial. A possibilidade de observar outro tipo de parasitas vai permitir um diagnóstico mais preciso levando o médico veterinário a implementar uma terapêutica mais adequada. No entanto, o uso da solução de ZnSO 4 apesar de ser o mais indicado para as formas de Giardia revela alguns problemas na evidenciação de outros parasitas como é o caso dos ovos de Taenia spp, pois estes apresentam uma densidade superior. Com base neste achado alguns autores 41

61 sugerem o uso de uma solução com açúcar de Sheather ou soluções de ZnSO 4 com densidades diferentes permitindo alargar as possibilidades de pesquisa de parasitas (Dryden, Payne, & Smith, 2006). No que se refere às técnicas de coloração usadas na pesquisa de Giardia estão descritas várias e com diferentes resultados. O esfregaço fecal directo numa solução salina, até 20 minutos após recolha vai permitir visualizar os trofozoítos e a sua motilidade apesar de não permitir evidenciar as suas estruturas (Conboy, 1997). A coloração do esfregaço vai possibilitar um melhor contraste e visualização de estruturas como o corpo mediano e disco ventral característicos deste parasita, embora ao matar o protozoário não permita avaliar a sua motilidade. Colorações como Giemsa, solução de Lugol ou o Tricrómio de Mason, têm sido usadas para evidenciar trofozoítos e quistos. A técnica de Ziehl-Neelsen nos esfregaços fecais, pouco referenciada em amostras de Giardia (Anexo 8 Figura 27), foi escolhida para este estudo pese a sua especificidade para Cryptosporidium. No entanto procurámos determinar se seria também uma opção viável noutros protozoários aliado ao facto de as pesquisas de Giardia e Cryptosporidium normalmente se encontrarem associadas. O teste rápido Speed Giardia demonstrou ser um método simples de aplicar, de clara interpretação dos resultados e acima de tudo rápido quando comparado com os restantes métodos usados, tendo em conta o número de amostras e a janela temporal disponível para a sua análise. Aliada à vantagem de rápida execução a simplicidade de aplicação permite reduzir a possibilidade de erros por parte do operador e consequentemente menos erros nos resultados apresentados. Parece tratar-se de um teste suficientemente sensível para detectar casos de giardiose quando são excretados níveis razoavelmente elevados de antigénios nas fezes (Mosallanejad, Reza, Razi Jalali, & Alborzi, 2010). Os resultados descritos por Eduardo (2008) referem uma concordância estatística entre os métodos imunocromatográficos e o exame microscópico quando analisadas amostras caninas. O teste rápido Speed Giardia foi também usado no estudo levado a cabo por Mosallanejad et al (2010) na província de Ahvaz no Irão, levando os autores a concluir que a sensibilidade deste teste é superior e mais precisa quando comparado com o método microscópico. No nosso estudo e apesar de o número de amostras ser consideravelmente inferior aos estudos referenciados, foi também revelado uma concordância estatística entre os métodos de diagnóstico utilizados (k 1 =0,933; k 2 =0,938; k 3 =0,872). Teremos de ter ainda em consideração o facto de neste presente estudo não ter sido possível recolher amostras seriadas num mínimo de 3 num espaço entre 3 a 5 dias como é recomendado pela ESCCAP para se atingir um diagnóstico mais aproximado do correcto 42

62 tendo em conta a excreção intermitente dos quistos de Giardia. Neste estudo, as amostras representam uma colheita única em cada um dos canis/criadores estudados e assim sendo a ausência de amostras negativas para o C2 não pode excluir por completo a possibilidade de existência de Giardia, mesmo se tratando de animais que não apresentavam qualquer sintomatologia à data das recolhas Prevalência e parâmetros Idade A associação entre a idade dos animais e a prevalência de Giardia tem sido descrita por vários estudos com a maioria a referir um maior risco de infecção nos animais jovens, com idades inferiores a 12 meses. O estudo europeu realizado por Epe et al (2010) demonstra um risco elevado nos animais com menos de 6 meses com 42,86% das amostras positivas. No mesmo sentido também Mircean, Gyorke e Cozma (2012) no seu estudo realizado na Roménia em 614 animais de idades compreendidas entre os 1 e 16 anos de idade, identificaram os cães com menos de 12 meses que vivem em comunidades como um grupo de risco. A maior sensibilidade dos animais jovens para a infecção por Giardia pode estar relacionada com a falta de maturidade do seu sistema imunitário e também com comportamentos característicos de animais jovens como o lamber ou morder objectos ou até a coprofagia (Mundim, Rosa, Hortêncio, Faria, Rodrigues, & Cury, 2007). Apesar destas referências o nosso estudo não revelou qualquer associação entre a idade dos animais e a prevalência de Giardia, tendo até sido observado uma maior percentagem de cães adultos positivos o que podemos relacionar com o número de animais com idades inferiores a 12 meses (5/45) e o de animais adultos (33/45) tal como o encontrado por Lebre (2011) Sexo Com base em resultados recentes não parece existir uma relação sustentável entre a prevalência de Giardia e o sexo do animal. Os estudos realizados por Epe et al (2010) e Mosallanejad et al (2010) referem uma maior prevalência de animais do sexo masculino sem que seja observável uma associação estatística entre estes factores. No entanto no trabalho realizado em Portugal, Lebre (2011) não observa qualquer associação estatística entre a prevalência do parasita e o sexo dos animais presentes no canil. Considerando os resultados apresentados no presente estudo, foi observada uma maior percentagem de fêmeas susceptíveis à infecção salientando a existência de um número de machos (26/45) superior em relação às fêmeas (19/45) no C1. A razão para este facto poderá estar relacionada com os 43

63 comportamentos adoptados pelas fêmeas sobretudo durante o período de gestação e pós-parto. As acções de higiene por parte da cadela em relação aos cachorros tais como a coprofagia, característica nas primeiras semanas de idade podem aumentar o risco de infecção mantendo o ciclo de transmissão entre mãe e filhos. O estudo realizado no Japão em canis de criação (Itoh, Muraoka, Saeki, Aoki, & Itagaki, 2005) determinou não existir relação entre a infecção por Giardia e a co-habitação de mães e filhos, levando a considerar que a transmissão vertical terá pouco efeito na infecção em comparação com a transmissão horizontal por quistos presentes no ambiente em que os animais se encontram. Numa comparação de género e origem dos animais (Meireles, Montiani-Ferreira, & Thomaz-Soccol, 2008) foram observadas prevalências superiores em machos para os animais presentes num abrigo/canil mas o contrário também foi detectado num ambiente doméstico onde as fêmeas apresentavam mais casos positivos Raça Estão representadas neste estudo várias raças de vários grupos reconhecidos pela FCI, porém não foram detectadas associações entre as raças e a prevalência de Giardia, considerando também que não podemos tirar uma conclusão apropriada com valores de n=1. O estudo de Upjohn et al (2010) revela uma associação entre os animais da raça Rottweiler e o risco de infecção por Giardia levando os autores a mostrarem alguma surpresa face a este resultado e deixarem indicações para estudos futuros. Num estudo recente com 64 amostras de cães de raça pura e 64 de cães raça cruzada (Katagiri & Oliveira-Sequeira, 2007) não foi evidenciada nenhuma relação entre estes factores. No entanto o trabalho de Fontanarrosa, Vezzani, Basabe e Eiras, (2006) salienta que apesar de não terem sido encontradas nas prevalências globais dos parasitas pesquisados, 3 das espécies de protozoários nas quais se inclui Giardia duodenalis, foram mais frequentes em raças puras Desparasitações, medicação e doenças Apesar das elevadas prevalências de Giardia detectadas tanto em canis como em animais presentes à consulta, muitos dos casos referem-se a portadores assintomáticos. Estudos como os de Tangtrongsup e Scorza (2010) destacam a importância de doenças imunossupressoras, tanto em animais como em humanos, e a potencialidade de desenvolverem sinais clínicos de giardiose. No nosso estudo não se evidenciou nenhuma relação entre a presença de doença pré-existente e a infecção por Giardia, salientando que os casos positivos e com doença se tratavam de animais com alterações dermatológicas devido a ectoparasitas. 44

64 No que se refere à medicação e à sua influência sobre a giardiose também não parece existir associação evidente, o que está de acordo com o evidenciado por Scaramozzino et al (2009). Do mesmo modo que doenças imunossupressoras podem potencializar os efeitos da infecção também fármacos com o mesmo efeito tais como corticosteróides, poderão influenciar os mecanismos de resposta do organismo permitindo a progressão do parasita. Os protocolos de desparasitação interna/externa são um passo importante no controlo da infecção e sua transmissão, procurando sempre atingir níveis elevados de eficácia apenas possíveis se aplicados os compostos adequados e cumpridos os prazos estipulados. A manutenção do ciclo de vida e as prevalências elevadas de Giardia, podem estar relacionadas com o uso rotineiro de anti-helmínticos e das suas doses, nos animais jovens (grupo de risco), que apesar de elevada eficácia contra parasitas como Toxocara spp não afectam os protozoários entéricos (Thompson A. R., 2000). Aliás o estudo realizado por Bugg, Robertson, Elliot e Thompson (1999) reconheceu que a prevalência de Giardia se encontra directamente associada com o número de doses de anti-helmínticos por ano, aumentando 1,2 vezes por cada dose administrada. No nosso estudo o canil C1 não aplicava intervalos de desparasitação regulares, o que pode pôr em causa a eficácia dos compostos usados, levando a eventuais casos de resistência. No entanto, não foram observadas associações entre a regularidade das desparasitações internas/externas e a prevalência de Giardia Prevalências e canis Neste estudo foram escolhidos 2 canis/criadores com diferenças em vários aspectos procurando estudar os seus efeitos na presença/ausência de infecção por Giardia. O C1 como já foi referido albergava um número consideravelmente superior de animais sem que isso interfira no espaço disponível para cada animal sendo equitativamente comparável ao que é verificado no C2. Um elevado número de animais num espaço de habitabilidade limitado pode promover a contaminação, consequentemente elevando o risco de infecção (Mundim, Rosa, Hortêncio, Faria, Rodrigues, & Cury, 2007). A interacção dos animais ocorre em C1 e C2, sobretudo na altura dos processos de limpeza, o que apesar da sua importância em termos de sociabilização se revê como mais um factor de risco na transmissão do parasita e manutenção do seu ciclo de vida. Os esquemas de limpeza diferiam ligeiramente entre C1 e C2 com o número de animais a ser também aqui um factor a ter em conta. As limpezas diárias no C1 baseavam-se na recolha dos dejectos e lavagem das instalações com água e detergentes comerciais com o pontual uso de 45

65 uma solução de monopersulfato de potássio. No C2 o esquema é semelhante em termos de limpezas diárias, mas os responsáveis pelo C2 realizam uma limpeza semanal com produtos à base de lixívia e em certas situações organofosforados como o diazinão. Na prevenção de Giardia está descrito que a inactivação dos quistos no ambiente pode ser atingida com a desinfecção através de vapor ou recorrendo ao uso de compostos de amónio quaternário (Tangtrongsup & Scorza, 2010). O estudo realizado por Fiechter, Deplazes e Schnyder (2012) assume que a reinfecção por quistos no ambiente será melhor controlada com a implementação de medidas de higiene intensivas tais como desinfecções antes e após o tratamento, reconhecendo que o uso de detergentes e água quente com espuma não foram eficazes no controlo das reinfecções. Para além das desinfecções das instalações e banhos dos animais outras possíveis fontes de contaminação como a água e a comida podem ser responsáveis pela transmissão de quistos e trofozoítos tal como referem Papini et al (2005) salientando que num ambiente de canil é possível que a alimentação húmida comercial possa ser mais facilmente contaminada por quistos de Giardia permitindo a sua sobrevivência quando comparadas com ração seca. Há no entanto diferenças consideráveis no que se refere aos esquemas de desparasitação dos animais com o C2 a apresentar intervalos regulares de 4 meses em comparação com o C1 em que os esquemas de desparasitação, de uma forma geral, nem sempre cumprem os intervalos pretendidos, considerando que provavelmente nenhum dos canis de criação estará a usar o mais eficaz composto ou associações de compostos no combate a Giardia, uma vez que parece não existir consenso sobre a eficácia dos antiparasitários disponíveis na prevenção da infecção, uma teoria que pode ser apoiada pela contínua elevada prevalência deste parasita em cães de diferentes origens. O reduzido número de animais presentes no C2 permite aos seus donos e tratadores uma atenção mais cuidada em particular no que se refere a banhos e escovagem do pêlo, um factor relevante no processo de transmissão de Giardia como descreve o trabalho realizado por Fiechter, Deplazes e Schnyder (2012). Considerando sobretudo as diferenças ao nível da densidade populacional, dos esquemas de limpeza e de desparasitações poderemos assumir estes factores como importantes na transmissão e manutenção da infecção com base nos resultados positivos apresentados para o C1 e a ausência dos mesmos no C2. Existem, ainda nos dias de hoje, dúvidas sobre o potencial zoonótico de Giardia. Como já foi referido os cães possuem assemblages específicas, C e D (Giardia canis), assim como os humanos têm o seu grupo antroponótico que engloba as assemblages A e B. Na verdade os cães são infectados com uma mais ampla variedade de assemblages com estudos a revelarem 46

66 uma prevalência moderada a elevada de assemblage A (Xiao & Fayer, 2008). Os dados porém continuam a demonstrar casos de ausência de assemblages zoonóticas nos cães como é visto no estudo realizado por Paz e Silva e Monobe (2012) em que apenas foram isoladas assemblages C e D, surgindo no entanto evidências da presença das assemblages zoonóticas A e B como refere o estudo realizado por Eduardo (2008) em Portugal identificando o genótipo A1 em 64,5 % das amostras caninas recolhidas. O estudo realizado em clinicas veterinárias na Alemanha (Barutzki, Thompson, Wielinga, Parka, & Schaper, 2007) detectou num total de 58 amostras positivas para Giardia que 7% correspondiam a assemblages A. Upjohn et al (2010) através da análise aos animais em canil na zona de Londres obteve uma maior prevalência para as assemblages específicas para os cães (C e D) e apenas uma amostra positiva relativa à assemblage zoonótica A. Bowman e Lucio-Forster (2010) mencionam que o risco de os humanos contraírem a infecção através dos seus animais de companhia é basicamente zero comparando com outras fontes de contaminação, exceptuando os casos de imunossupressão severa. Um estudo mais aprofundado em termos genéticos (Cacciò & Ryan, 2008) demonstra que os subtipos das assemblages A e B encontradas nos cães não são geneticamente idênticas às presentes nos humanos. Foi sugerido por Thompson e Monis (2004) que podem ocorrer 2 ciclos de transmissão nos cães com o favorecimento do ciclo que engloba as assemblages específicas do cão a ocorrer pelo contacto intensivo entre um elevado número de animais a habitar em conjunto (canis) permitindo a estas assemblages dominar as restantes; em cães domésticos a frequência de transmissão entre cães será consideravelmente inferior criando condições para as infecções por assemblages A persistirem. Considerando importante ou menos relevante o risco de contágio entre humanos e cães, não estará em causa a necessidade de tratar os animais infectados quer estes apresentem sintomatologia ou não, tanto em termos da saúde do individuo mas também analisando o caso numa perspectiva global procurando impedir o contágio de outros animais. O papel do veterinário junto dos donos será de extrema relevância alertando para a importância do tratamento, dependendo do mesmo aplicar os seus conhecimentos de modo a atingir níveis elevados de eficácia na eliminação do parasita. 47

67 5. Conclusão Finalizando este estudo devemos acima de tudo considerar estes resultados assim como os métodos escolhidos, um ponto de partida para futuras pesquisas de Giardia em outras áreas das populações caninas e não só, tentando estabelecer uma associação entre as prevalências reportadas e a linha temporal observando os resultados dos tratamentos e estratégias de prevenção postos em prática. Os resultados apresentados, com especial atenção para a prevalência global de 21,6%, vão de encontro a uma variedade de estudos realizados a nível mundial, permitem-nos avaliar outras populações caninas que em Portugal não têm sido estudadas. A importância dos canis de criação no mercado nacional tem sido crescente no número de animais e raças movimentados. Considerando que se trata de animais que poderão fazer parte de um agregado familiar, terá de ser dada especial atenção ao grau de parasitismo que os mesmos apresentam na altura da compra/adopção. Este estudo veio demonstrar que a elevada prevalência de Giardia já demonstrada em canis municipais e centros de acolhimento e de adopção de animais, também pode ser encontrada em canis de criação tal como é visível na conclusão do trabalho realizado por Itoh et al (2005) onde se pode ler que G.intestinalis invadiu largamente os canis de criação no Japão. A prevalência total de 21,6% detectada no nosso estudo apesar de relativamente inferior da encontrada no Japão (37,4%) através dos testes de pesquisa de coproantigénios, demonstra resultados elevados nesta população canina. Apesar da inexistência de associações estatísticas significativas destaca-se a importância dos factores como a desparasitação, os esquemas de limpeza e desinfecção mas sobretudo o número de animais na manutenção das infecções por Giardia e no seu ciclo de transmissão. Torna-se visivelmente mais eficaz o controlo e aplicação das medidas preventivas assim como dos tratamentos numa população com menor número de animais com elevada importância na disrupção do ciclo biológico do parasita. Não podemos negligenciar factores como a idade e o sexo e o seu papel na manutenção da infecção. Apesar de não termos detectado significância entre a idade e a existência de infecção, salientamos que entre 70 a 78% dos animais eram adultos, dados que se afastam de outros estudos que referem uma relação entre os animais jovens e a infecção. A associação significativa detectada em fêmeas traz uma novidade em relação ao já descrito e pode tratar-se de um dado importante nos animais presentes neste tipo de instalações. Em relação aos métodos de diagnóstico salienta-se a facilidade e rapidez na apresentação dos resultados do teste rápido Speed Giardia e da sua mais-valia na clinica ou hospital 48

68 veterinário como forma de rastreio dos animais presentes à consulta, sobretudo aqueles que se apresentam assintomáticos. As prevalências de 21,6%. 19,6% e 17,6% observadas nos 3 métodos apesar não apresentarem diferenças muito significativas salientam uma percentagem superior detectada pelo teste rápido. Este facto reforça a necessidade de realizar mais do que um teste de diagnóstico com o objectivo de obter um diagnóstico mais correcto e na tentativa de diminuir as possibilidades de falsos negativos. Apesar de não ter sido efectuada a genotipagem das amostras positivas de Giardia não podemos descurar o potencial zoonótico deste protozoário que deve ser considerado e reconhecido pelos responsáveis e tratadores do canil assim como dos futuros donos dos animais. 49

69 6. Perspectivas futuras Durante a realização deste trabalho foram surgindo ideias sobre como melhorar um possível futuro estudo nesta área. O estudo parasitológico em canis de criação não tem sido muito explorado em Portugal, pelo menos quando comparado com os estudos em canis municipais e instituições de adopção animal. Consideramos ser importante um estudo mais aprofundado nos canis de criação, não só para Giardia mas uma pesquisa mais vasta em espécies de parasitas gastrointestinais, ou pelo menos aquelas que poderão apresentar um risco zoonótico. Seria interessante realizar uma pesquisa nacional ou pelo menos regional neste tipo instalações, adoptando um modelo científico um pouco diferente daquele que aqui foi apresentado, apostando sobretudo num maior número de amostras por animal com a possibilidade de agregar à pesquisa dos parâmetros descritos neste estudo a pesquisa do efeito dos tratamentos convencionais para Giardia nos animais presentes em canis de criação. Outro aspecto igualmente interessante a analisar seria o real potencial zoonótico, realizando para isso um estudo parasitológico dos donos e membros da família, assim como a caracterização genética dos agentes encontrados. 50

70 BIBLIOGRAFIA Adam, R. D. (2001). Biology of Giardia lamblia. Clinical Microbiology Reviews Vol 14 (3), pp Andrews, R., Monis, P. T., Ey, P. L., & Mayrhofer, G. (1998). Comparison of the levels of intra-specific genetic variation within Giardia muris and Giardia intestinalis. International Journal of Parasitology, pp Ankarklev, J., Jerlstrom-Hultqvist, J., Ringqvist, E., Troell, K., & Svard, S. G. (2010). Behind the smile: Cell biology and disease mechanisms of Giardia species. Nature Reviews Microbiology Vol 8, pp Bajer, A., Bednarska, M., & Rodo, A. (2011). Risk factors and control of intestinal parasite infections in sled dogs in Poland. Veterinary Parasitology 175, pp Ballweber, L. R., Xiao, L., Bowman, D. D., Kahn, G., & Cama, V. A. (2010). Giardiasis in dogs and cats: Update on epidemiology and public health significance. Trends in Parasitology 26 (4), pp Barutzki, D., Thompson, R., Wielinga, C., Parka, U., & Schaper, R. (2007). Observations on giardia infection in dogs from veterinary clinics in Germany. Parasitology Research 101, pp Bednarska, M., Bajer, A., Sinski, E., Girouard, A. S., Tamang, L., & Graczyk, T. K. (2006). Fluorescent in situ hybridization as a tool to retrospectively identify Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia in samples from terrestrial mammalian wildlife. Beugnet, F., Guillot, J., Polack, B., & Chermette, R. (2000). Enquête sur le parasitisme digestif des chiens et des chats de particuliers de la région parisienne. Revue de Medicine Veterinaire 151 (5), pp Bowman, D. D. (2009a). Georgis' Parasitology for Veterinarians. St Louis, Missouri: Saunders Elsevier. Bowman, D. D., & Lucio-Forster, A. (2010). Cryptosporidiosis and giardiasis in dogs and cats: Veterinary and public health importance. Experimental Parasitology 124, pp Bowman, D. D., Liotta, J. L., Ulrich, M., Charles, S. D., Heine, J., & Schaper, R. (2009b). Treatment of naturally occurring, asymptomatic Giardia spp. in dogs Drontal Plus flavour tablets. Parasitology Research 105, pp Bugg, R., Robertson, I., Elliot, A., & Thompson, R. (1999). Gastrointestinal parasites of urban dogs in Perth, western Australia. The Veterinary Journal 157, pp

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78 ANEXOS 59

79 Anexo 1 Inquérito relativo aos dados gerais do canil/criador e individuais do animal Inquérito Tese de Mestrado FMV-UTL 2011/ Giardia em canis de criação Identificação Nº da amostra: Data: / / Nome do animal: Idade Sexo: Espécie: Raça: Tipo de amostra (consistência): Normal Mole Diarreia Tipo de Recolha: Nº de recolhas: Zaragatoa Directa Outro Obs: Anamnese: Alimentação Ração Fisiológica Comida caseira Ração Terapêutica Tipo: Habitat Interior Exterior Misto Contacto com outros animais: Sim Não Origem Criador Petshop Centro de acolhimento Outro: Interacção com donos e membros da família: Desparasitação interna: Intervalo de administrações: 3 meses 4 meses Outro: Principios activos: 60

80 Vacinação: Sim Não Qual: Desparasitação externa: Sim Substâncias activas: Não Doenças e condições médicas pré-existentes: Medicação: Sim Quais: Não Análise: Exame directo Flutuação fecal Coprocultura Teste rápido (Speed Giardia) IFD Outro: Resultados: Anexo 2 61

81 Anexo 2 Estudos de prevalência de Giardia em animais de canil e privados. País/Região Origem Amostra Prevalência (%) Referência Austrália Canil/Dono ,3% Palmer et al 2007 Bélgica Dono % Epe et al, 2010 Brasil/Uberlândia Canil ,7% Mundim et al 2006 Brasil/São Paulo Canil ,8% Katagiri & Oliveira- Sequeira, 2007 Espanha/Madrid Canil % Miró et al, 2007 EUA Canil/Dono ,6% Carlin, Bowman, & Scarlett, 2006 India Ind % Traub et al 2002 Itália/Roma Canil ,5% Scaramozzino et al, 2009 Itália Dono ,89% Epe et al, 2010 Polónia Dono/Canil 148 1,9% Solarczyk et al, 2010 Reino Unido Dono ,62% Epe et al, 2010 Rep. Checa/Praga Canil % Dubná et al, 2006 Roménia Vários 614 8,5% Mircean et al

82 Anexo 3 Método de flutuação passiva pelo método de Willis, através dos kits de amostras fecais da HenrySchein Os kits para análise fecal da HenrySchein são compostos de 2 peças (Figura 19 Imagem esquerda), uma interna (verde) que serve para a recolha da amostra e o recipiente externo (branco) onde a primeira se insere. 1. Após a recolha da amostra com a peça interna esta volta a ser encaixada no recipiente, adicionar a solução de ZnSO 4 até ao limite assinalado na parte lateral. 2. Homogeneizar os dois componentes através da rotação repetida da peça interna. 3. Adicionar solução de ZnSO 4 para preencher o recipiente até formar um menisco e colocar uma lamela no topo (Figura 19 Imagem direita) 4. Após 15 minutos retirar a lamela, colocar numa lâmina e observar ao microscópio (Figura 19 Imagem inferior) Figura 19 Imagem esquerda: Kit para análise de amostras fecais. Imagem direita: Kits com solução e lamela. Imagem inferior: Lâminas e lamelas para observação microscópica. Fonte: Original 63

83 Anexo 4 Esfregaço fecal e coloração pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada I. Esfregaço fecal Com o auxílio de uma vareta, retirar uma pequena amostra de fezes, distribuir ao longo de uma lâmina e deixar secar (Figura 20 Imagem direita). II. Técnica de Ziehl-Neelsen modificada (adaptado de Casemore, 1991) Reagentes : Metanol Fucsina Álcool Clorídrico 1% Verde Malaquite 0,4% I. Fixar com metanol durante 1 minuto II. Cobrir a lâmina fucsina durante 10 minutos III. Lavar com água IV. Descolorar com álcool clorídrico a 1% até à eliminação do corante em excesso V. Lavar com água VI. Cobrir a lâmina com Verde Malaquite a 0,4% durante 30 segundos (Figura 20 Imagem direita) VII. Deixar secar e observar ao microscópio na objectiva de 100x com óleo de imersão 64

84 Figura 20 Imagem superior: Suporte para lâminas e reagentes. Imagem esquerda: Lâminas após esfregaço. Imagem direita: Lâminas após coloração. Fonte: Original 65

85 Anexo 5 Kit teste rápido Speed Giardia O teste rápido Speed Giardia, de acordo com as indicações do fabricante (BVT, Virbac), baseia-se numa tira imunocromatográfica capaz de detectar antigénios dos quistos de Giardia duodenalis com uma sensibilidade de 95,6% e especificidade de 100% num limiar de detecção de 80 quistos por grama de fezes. Pode ser armazenado até 16 meses a temperatura ambiente e a sua preparação e leitura demora apenas 10 minutos. I. Protocolo de procedimento: 1. Identificar o frasco contendo o reagente e recolher a matéria fecal com o auxílio da colher de colheita (Figura 21 Imagem esquerda). Adicionar à solução reagente o equivalente a 1 colher cheia. Fechar o frasco e homogeneizar o seu conteúdo. 2. Deixar sedimentar durante 3 min 3. Mergulhar cuidadosamente no frasco uma fita teste seguindo o sentido da seta e evitando o contacto com a sua zona central reagente. Deixar repousar 1 minuto na solução (Figura 21 Imagem direita). 4. Retirar a fita e colocá-la sobre uma superfície horizontal limpa. 5. Após a migração fazer a leitura. Figura 21 Imagem esquerda: Frasco com reagente e colher. Imagem direita: Fita de teste em solução. Fonte: Original 66

86 II. Leitura e interpretação dos resultados Ler o resultado após 5 minutos de migração: Uma banda azul resultado negativo (Figura 22); Uma banda azul e uma banda vermelha resultado positivo (Figura 23). Uma ligeira coloração rosada da banda teste é considerada como resultado positivo. O resultado deste teste biológico deve ter sempre em consideração o contexto clínico e epidemiológico do animal em questão. Figura 22 Tira imunocromatográfica Speed Giardia Resultado negativo. Fonte: Original Figura 23 - Tira imunocromatográfica Speed Giardia Resultado positivo. Fonte: Original 67

87 Anexo 6 Dados do canil 1 recolhidos através dos inquéritos Amostra Grupo Ziehl- Sexo Raça Vacinação Medicação Doença D. int D. ext Fezes Speed Willis Etário Neelsen 1 Jovens F Pinscher N N - NR NR Normal Adultos F Pinscher N N - NR NR Normal Adultos F Pinscher N N - NR NR Normal Adultos F Bulldog Francês N N - NR NR Normal Adultos M Pinscher N N - NR NR Normal Adultos F Pug N N - NR NR Normal Jovens M Bulldog Inglês N N - NR NR Normal Adultos F Pug N N - NR NR Normal Adultos F Bulldog Francês N N - NR NR Normal Adultos F Bulldog Francês N N - NR NR Normal Adultos F Bulldog Francês N N - NR NR Normal Adultos F Pug N N Sarna (ind) NR NR Normal Adultos M Bulldog Francês N N - NR NR Diarreia Adultos F Bulldog Inglês N N Leishmaniose NR NR Normal Adultos F ShiTzu N N - NR NR Normal Adultos M Pug N N - NR NR Normal Seniores F Golden Retriever N N - NR NR Normal

88 18 Adultos M Cocker Spaniel N N - NR NR Normal Adultos F Golden Retriever N N - NR NR Normal Adultos M Basset Hound N N - NR NR Normal Adultos F Basset Hound N N - NR NR Normal Adultos F Basset Hound N N - NR NR Normal Seniores F Yorkshire Terrier N N - NR NR Normal Adultos F Yorkshire Terrier N N - NR NR Normal Adultos M Yorkshire Terrier N N - NR NR Normal Adultos F Yorkshire Terrier N N - NR NR Normal Adultos F Bulldog Inglês N N - NR NR Normal Jovens F Bulldog Inglês N N - NR NR Normal Jovens F Bulldog Inglês N N - NR NR Normal Adultos F Pinscher N N - NR NR Normal Adultos M Cocker Spaniel N N - NR NR Normal Adultos M Bulldog Francês N N - NR NR Normal Adultos F Cocker Spaniel N N - NR NR Normal Adultos F Cocker Spaniel N N - NR NR Normal Seniores M Cocker Spaniel N N - NR NR Normal Seniores M Cocker Spaniel N N - NR NR Normal Seniores M Cocker Spaniel N N - NR NR Normal

89 38 Seniores M Golden Retriever N N Insuf cardíaca/tumor NR NR Normal perianal 39 Adultos F Cocker Spaniel N N - NR NR Normal Jovens M Pastor Alemão N N Parvovirose NR NR Mole Seniores F Cocker Spaniel S S Tumor hepático R R Normal Jovens M Retriver do Fractura proximal S S Labrador do rádio NR NR Normal Jovens M Caniche S S - NR NR Diarreia Adultos F Bulldog Francês S N - NR NR Normal Jovens F Cocker Spaniel S N Queileteliose R R Mole Legenda N não; S-sim; NR não regular; R - regular 70

90 Anexo 8 - Dados do canil 2 recolhidos através dos inquéritos Amostra Grupo D. D. Ziehl- Sexo Raça Vacinação Medicação Doença Fezes Speed Willis Etário Interna Externa Neelsen 1 Adulto F Bouvier Bernois Regular - - Regular Regular Normal Adulto F Bouvier Bernois Regular - - Regular Regular Normal Adulto F Retriever do Labrador Regular - - Regular Regular Normal Jovem F Doberman Regular - - Regular Regular Normal Adulto M Bouvier Bernois Regular - - Regular Regular Normal Adulto M Doberman Regular - - Regular Regular Normal

91 Anexo 8 - Imagens recolhidas no estudo prático Figura 24 - Quisto de Giardia. Flutuação passiva com ZnSO 4, Objectiva 40x. Fonte: Original Figura 25 - Quisto de Giardia. Flutuação passiva com ZnSO 4, objectiva 10x. Fonte: Original 72

92 Figura 26 - Quisto de Giardia. Flutuação passiva com ZnSO 4, objectiva 100x. Fonte: Original Figura 27 - Quisto de Giardia. Coloração com técnica de Ziehl-Neelsen modificada, objectiva 100x. Fonte: Original 73

93 Figura 28 Toxascaris leonina, flutuação passiva com ZnSO 4, objectiva. 10x. Fonte:Original 74