CÓDIGO DE BARRA DE DNA NA IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE CUPINS COABITANTES DE NINHOS EPÍGEOS

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1 CÓDIGO DE BARRA DE DNA NA IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE CUPINS COABITANTES DE NINHOS EPÍGEOS Amanda Ferreira David Faculdade de Ciências Biológicas Centro de Ciências da Vida Edmilson Ricardo Gonçalves Grupo de Pesquisa: Ecologia, Biologia Molecular e Filogenia de cupins e formigas Centro de Ciências da vida erg@puc-campinas.edu.br Resumo: A importância dos cupins na aeração e ciclagem de nutrientes do solo é bem conhecida, no entanto, pouco se sabe sobre os hábitos e interações entre espécies que coabitam ninhos epígeos. Assim, este trabalho teve por objetivo identificar através do código de barra de DNA as espécies que coabitam termiteiros epígeos em áreas de pastagem. A hipótese deste trabalho é que dados moleculares das espécies de cupins brasileiros, em especial os que coabitam ninhos epígeos, não estão representados no GenBank (NCBI). Os cupins foram coletados em 24 ninhos e identificados através de chaves taxonômicas, e sete deles confirmados com dados moleculares (gene mitocondrial da citocromo oxidase subunidade I, gene coi). DNA das amostras de cupins foi extraído e o gene coi foi amplificado por PCR e, posteriormente, sequenciado para comparação com o GenBank. Foram encontrados cupins representantes de duas famílias, três subfamílias e onze gêneros. Com base nos dados moleculares, apenas duas amostras, Procornitermes araujoi e Silvestritermes holmgreni, já haviam sido depositadas no GenBank e puderam ser confirmadas com 98% e 99% de similaridade, respectivamente. Cinco amostras só tiveram a confirmação da subfamília ou do gênero, uma vez que estamos descrevendo pela primeira vez a sequência de seus genes coi e não encontramos no banco nenhuma amostra similar, confirmando nossa hipótese. Curiosamente, uma de nossas amostras identificadas por taxonomia clássica como S. euamignathus apresentou 99% de identidade com S. holmgreni indicando a possibilidade de se tratar de uma mesma espécie. Estudos estão sendo conduzidos para revisar a taxonomia dessas duas espécies. Palavras-chave: térmita; taxonomia molecular; cupim Área do Conhecimento: Ciências Biológicas Biologia Molecular 1. INTRODUÇÃO Segundo a taxonomia, térmitas são classificados na Classe Insecta, Ordem Isoptera. Possuem nove Famílias: Archotermopsidae, Hodotermitidae, Kalotermitidae, Mastotermitidae, Rhinotermitidae, Serritermitidae, Stolotermitidae, Stylotermitidae e Termitidae. Somente a Família Termitidae possui divisão em Subfamílias, o restante é classificado diretamente em gêneros e espécies. Existem aproximadamente 2882 espécies de cupins distribuídas principalmente nas regiões zoogeográficas neártica, neotropical e australiana [1]. Destas espécies, mais de 200 são encontradas no Brasil [2]. Cupins são um dos insetos em maior quantidade no mundo sendo classificados como insetos sociais, os quais, juntamente com a Ordem Hymenoptera (formigas, vespas e abelhas), possuem uma organização social, contribuindo para seu sucesso evolutivo. A divisão da organização social recebe o nome de castas e, nos cupins, há quatro: operários e soldados (ambos os sexos, inférteis), rei e rainha (férteis). Existe apenas uma rainha na colônia e ela é responsável pela reprodução no ninho inteiro. [3]. Há também a família Apicotermitinae que é caracterizada por não possuir a casta dos soldados, por isso é vantajosa a coabitação com espécies que possuam soldados que possam proteger ambas espécies [4]. Os soldados, responsáveis pela proteção do ninho, normalmente são maiores que os operários e com mandíbulas reforçadas. Os operários são responsáveis pelas tarefas a mais que restam, como o cuidado dos ovos, reconstrução do ninho após um ataque de predador e busca de alimento para a colônia. O rei e a rainha são responsáveis pela reprodução e consequente reposição de indivíduos na colônia. A rainha é quem

2 define a casta de cada ninfa por meio de seus ferormônios [4]. Sua importância ecológica está, principalmente, na ciclagem de biomassa (que corresponde a maior quantidade) nos locais em que são encontrados. O papel na manutenção do Cerrado brasileiro é de extrema importância, já que é o meio de sobrevivência de muitas espécies que habitam este bioma. A construção de galerias ajuda na ciclagem de nutrientes e possibilita, em algumas espécies, o acesso a fungos, além de realizar papel semelhante ao das minhocas na aeração do solo [4]. O sistema de código de barra vem sendo usado há onze anos e revolucionou a catalogação de espécies em todo o mundo [5]. Porém, há uma deficiência de sequências depositadas no banco de dados utilizado (Blatsn, do NCBI) quando se trata de térmitas. Estudos permitiram concluir que o uso da taxonomia molecular auxilia e complementa a taxonomia clássica e outros tipos de identificação, como o cariótipo [6]. Para a identificação, o gene mitocondrial citocromo oxidase subunidade I é utilizado em vários estudos como padrão de vários Filos, entre eles, o Arthropoda [7]. 2. Material e Métodos 2.1 Coleta e armazenamento das amostras de cupim As coletas dos cupins foram previamente realizadas por alunos de Iniciação Científica em projetos passados. As amostras foram identificadas em vidrarias com o número do ninho e em que região foi encontrado. Os cupins foram mantidos em álcool 80% no freezer para conservação do tecido até que fosse realizada a extração de DNA. Os cupins que foram selecionados seguiram o critério de que provavelmente sua sequência não estaria depositada no banco de dados. A região de Campinas/SP foi escolhida para o estudo e os locais de coleta foram georreferenciados a fim de estabelecer um panorama da distribuição dessas espécies (figura 1). Figura 1. Localização geográfica da região em que os cupins foram coletados Extração e purificação de DNA A extração de DNA foi realizada a partir do tecido macerado de um único cupim em tubo de microcentrífuga na presença de tampão de extração [8]: 10 mm de Tris HCl (ph 7,5), 100 mm de EDTA, 0.6% de SDS, 400 mm de NaCl e 60 µg de Proteinase K. Depois de homogeneizado o tecido do inseto em tampão de extração, a solução foi incubada em banho-maria a 55ºC durante 8 horas e transferidas para o freezer até o momento de purificar o DNA. A purificação do DNA foi realizada com o kit GE Healthcare illustra tissue & cells genomicprep Mini Spin, de acordo com as especificações do Fabricante (General Electric Company, 2007) Amplificação do gene coi e sequenciamento de DNA O gene mitocondrial COI (Citocromo oxidase, subunidade I) de cupins foi obtido por amplificação com o método de PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando primers conforme quadro I. As condições para amplificações na utilização de todos os primers (COIR e COIL, HCO e LCO, LepR1 e LepF1) foram realizadas em volume final de 25µL e colocadas em tubo coletor de 0,5mL, sendo esse volume composto por 2,5µL de tampão 10x, 18,4µL de água para PCR, 1µL de MgCl2 a 25mM, 1µL de DNA da amostra (aproximadamente 20ng), 1µL de dntp 5mM, 0,3µL dos primers já citados anteriormente, todos com concentração final

3 de 2,0pmoles cada, e, por fim, a adição de 0,5µL de taq polimerase (5 unidades por microlitro). As condições de amplificação foram: um ciclo de dois minutos a 94ºC; cinco repetições de ciclos a quarenta segundos a 94ºC, quarenta segundos a 45ºC e um minuto a 72ºC; trinta e seis ciclos de quarenta segundos a 94ºC, quarenta segundos a 53ºC e um minuto a 72ºC; e por fim um único ciclo de cinco minutos a 72ºC. Esse protocolo foi determinado como padrão para todos os primers por unificar todos os protocolos em um só, economizando tempo.. Quadro I Sequência dos primers para amplificação por PCR dos genes mitocondriais coi (Citocromo Oxidase subunidade I). Gene Primer Sequências Fonte COI HCO 5' ATA CCT CGA CGW TAT TCA [9] GA 3' COI LCO 5' GGT CAA CAA ATC ATA AAG [9] ATA TTG G 3' COI CO1R 5 ACT TSA GGG TGY CCR AAG 3 [7] COI CO1L 5 ACW AAY CAY AAR GAY ATT GG [7] 3 COI LepF 5 ATT CAA CCA ATC ATA AAG [10] ATA TTG G 3 COI LepR 5 TAA ACT TCT GGA TGT CCA [10] AAA AAT CA 3 Sendo: W = T ou A; Y = T ou C; S = C ou G; R = G ou A Os resultados das amostras foram corados com BlueGreen de acordo com as especificações de fabricante (LGC Biotecnologia) e submetidos a eletroforese em gel de agarose com tampão T.A.E. 1x (Tris-Acetato-EDTA). Inicialmente, é aplicada uma corrente de 50V por 15 minutos para que o DNA entre no gel uniformemente, depois disso a corrente é aumentada para 100V por mais 15 minutos para que os fragmentos de DNA fiquem organizados separadamente. Os produtos de amplificação bem-sucedidos foram extraídos do gel de agarose, isolando o fragmento que contenha o DNA amplificado, e purificados de acordo com o protocolo do kit GE Healthcare illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit. Algumas amostras foram tratadas com ExoSAP-IT PCR Product Cleanup, fabricado pela Affymetrix, o qual prepara o DNA para sequenciamento sem o processo de purificação pelo kit, mas remove os primers e nucleotídeos inutilizados da amostra, preservando-a. As condições utilizadas foram determinadas acordo com as especificações do fabricante Affymetrix. Após as purificações de fragmento, o DNA foi quantificado em aparelho nanovue (GE Healthcare) ou por comparação com amostras conhecidas em gel de agarose. Amostras de DNA entre 10 a 20ng/µL foram enviadas para sequenciamento pelo método de Sanger no laboratório LACTAD (UNICAMP). As amostras foram sequenciadas pelo menos duas vezes, tanto a fita reversa quanto a direta, para uma análise final mais precisa Análise das sequencias de DNA Os resultados do sequenciamento foram analisados com o Software Sequence Scanner, versão 1.0 (Affymetrix) para verificar a qualidade das leituras da sequência do DNA. Para o alinhamento de ambas as sequências (direta e reversa) e como resultado obter uma única sequência final, foi utilizado o software Geneious 6.0 e essa sequência foi comparada com sequências depositadas no banco de dados GenBank com o software BLASTn ( 3. Resultados e discussão 3.1. Amostras de cupins

4 Após identificação por taxonomia clássica (dados da Professora Luciane Kern Junqueira), foram selecionadas amostras representando diferentes grupos taxonomicos, sendo que as espécies só eram repetidas quando coletadas de áreas diferentes da região de Campinas, dentre elas, o aeroporto de Viracopos e Souzas. No total foram escolhidas 24 espécies coabitantes, todas de cupins construtores de ninhos em pastagens. A maioria das amostras estava em bom estado de conservação, porém, algumas amostras não obtiveram sucesso na amplificação por PCR. Para esse problema, foram escolhidas outras amostras da mesma espécie e da mesma área. Dentre as amostras sequenciadas com sucesso para as duas fitas, todas são da Família Termitidae, sendo que apenas uma espécie (Orthognathotermes mirin) pertence à subfamília Termitinae. As outras 4 espécies (Rynchotermes nasutissimus, Silvestriermes euamignathus, Procornitermes araujoi e Cyrilliotermes strictinasus) são da subfamília Syntermitinae, já relatada como uma subfamília com poucos representantes em comparação com outras subfamílias, como por exemplo Nasutitermitinae e Termitinae [1]. A sequência completa e corrigida, chamada de contig, foi colocada no site do NCBI para comparação com outras sequências já contidas no banco de dados. Os resultados do BLASTn (NCBI) estão representados no Quadro 3. Quadro 3. Classificação por taxonomia clássica e molecular e grau de similaridade com espécies descritas no GenBank Extração de DNA e amplificação por PCR Amostra taxonomia clássica Taxonomia molecular de acordo com GenBank e As extrações de DNA foram efetuadas de acordo com o protocolo descrito em literatura [8] e as purificações foram realizadas com o kit GE Healthcare illustra tissue & cells genomicprep Mini Spin, de acordo com as especificações do Fabricante (General Electric Company, 2007). CH165 CH171 Orthognathitermes mirin Rynchotermes nasutissimus grau de similaridade Orthognathotermes adunctus, 90% Cornitermes cumulans, 87% As amplificações necessitaram de ajustes de condições nas concentrações e quantidades dos reagentes desde o começo do projeto até serem adequadas para que os três tipos de primers amplificassem o maior número possível de amostras. Também foi utilizado um programa com condições padrões para todos os primers (Quadro II). CH194 CH215 CH298 Silvestritermes euamignathus Procornitermes araujoi Cyrilliotermes strictinasus Silvestritermes holmgreni, 98% Procornitermes araujoi, 99% Embiratermes neotenicus, 97% 3.3. Sequenciamento de DNA e comparação com o banco de dados. Das 24 amostras trabalhadas, apenas 5 obtiveram sucesso no sequenciamento de ambos os lados do DNA (reverso e direto). Algumas amostras obtiveram a sequência completa de um lado apenas, porém, não apresentavam resultado satisfatório na sequência que compõe o outro lado, necessitando, portanto, de novas reações de sequenciamento. De acordo com a literatura científica, apesar da porcentagem de similaridade entre as sequências ser alta em todos os casos (Quadro 3), só podemos assumir que seja a mesma espécie depositada no banco quando o valor de similaridade estiver entre 98 e 99% [11]. No caso da espécie P. araujoi, podemos constatar que se trata da mesma espécie por obter 99% de similaridade no banco de dados. Já as outras espécies não podemos assumir que seja a mesma espécie, pois valores abaixo de 98% indicam que sejam do mesmo gênero, subfamília ou família. No caso da amostra CH194, identificada por taxonomia clássica como Silvestritermes euamignathusi e confirmado por comparação com a coleção de

5 térmitas no museu da USP, a taxonomia molecular apresentou dados divegentes. De acordo com os dados moleculares, a amostra CH194 seria Silvestritermes holmgreni e não s. Euamignatus. De acordo com o curador do museu da USP essas duas espécies apresentam como única diferença a localização do ninho, sendo que S. Euamignatus constrói ninhos no solo enquanto S. Holmgreni constrói ninho arborícola. Segundo os especialistas em cupins desse museu, tais dados ainda necessitam de melhores estudos. Para verificar se realmente são duas espécies diferentes, o pesquisador do museu da USP, que também é o curador da coleção, nos cedeu algumas amostras para que pudéssemos sequenciar e concluir se são duas ou apenas uma espécie com hábitos diferentes a partir da taxonomia molecular. Foram realizados sequenciamentos com o gene coi e com o espaçador de genes ribossomais ITS. Os dados com a região ITS (cerca de 600 pares de bases) revelaram 99,8% de similaridade entre as espécies S. Euamigantus e S. Holmgreni indicando tratar-se de uma mesma espécie. Novos estudos, envolvendo novas amostras, serão conduzidos para comprovar esses dados e clarear a taxonomia desses grupos. Os resultados encontrados confirmaram nossa hipótese inicial de que poucas amostras brasileiras encontram-se depositadas no GenBank e a necessidade de novos trabalhos descrevendo sequencias de DNA de cupins da nossa fauna, permitindo a identificação dos térmitas de maneira precisa. Os resultados também apontaram erros na classificação atual envolvendo o gênero Silvestritermes, onde hoje as espécies S. Euamigantus e S. Holmgreni, tidas como duas espécies diferentes, tratam-se, provavelmente de uma única espécie. 5. REFERÊNCIAS [1] Constantino, R. Termite Catalog Disponível em: < Acesso em: 07 maio [2] Eleotério, E. S. R. Levantamento e identificação de cupins (insecta: isoptera) em área urbana de Piracicaba, sp f. Tese (Mestrado) - Curso de Ciências, Tecnologia de Madeiras, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiróz", Piracicaba, Cap. 1. [3] Ruppert, E. E.; Barnes, R. D.; Fox, R.S. Zoologia dos invertebrados: uma abordagem funcional-evolutiva. 7. ed. São Paulo, SP: Roca, [4] Cancello, E. M.; Schlemmermeyer, T. Isoptera. Biodiversidade do Estado de São Paulo, Brasil: Síntese do conhecimento ao final do século XX. Invertebrados Terrestres, p , [5] Bergsten, J., Bilton, D. T., Fujisawa, T., Elliott, M., Monaghan, M. T., Balke, M., Vogler, A. P. (2012). The effect of geographical scale of sampling on DNA barcoding. Systematic biology, 61(5), [6] Bergamaschi, S., Dawes-Gromadzki, T. Z., Luchetti, A., Marini, M., & Mantovani, B. (2007). Molecular taxonomy and phylogenetic relationships among Australian Nasutitermes and Tumulitermes genera (Isoptera, Nasutitermitinae) inferred from mitochondrial COII and 16S sequences. Molecular phylogenetics and evolution, 45(3), [7] Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., & Vrijenhoek, R. (1994). DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular marine biology and biotechnology, 3(5), [8] Donnan laboratories, Extraction of DNA from tissue High salt method. Disponível em: Acessado em: 18/02/2014. [10] Booth, W., Brent, C. S., Calleri, D. V., Rosengaus, R. B., Traniello, J. F. a., & Vargo, E. L. (2011). Population genetic structure and colony breeding system in dampwood termites (Zootermopsis angusticollis and Z. nevadensis nuttingi). Insectes Sociaux, 59(1), [11] HEBERT, P.D.N.; CYWINSKA, A.; BALL, S.L. & DE WAARD, J.R. (2003a).Biological identifications through DNA barcodes. Philosophical Transactions of The Royal Society B 270: pp , 2003.

6 Quadro II Resultado das amplificações realizadas com primers HCO/LCO, CO1L/CO1R e LF/LepR. Quadro II. Resultado dos testes com os três primers utilizados. As espécies foram identificadas pela pesquisadora Dra. Luciane Kern Junqueira com o auxilio de chaves de classificação de cupins com base em características morfológicas. Amostra Taxonomia Clássica Resultado da am- plificação com HCO LCO Resultado da amplifi- cação com Co1R Co1L 4 Cornitermes cumulans 53 Labiotermes longilabius 83 Cornitermes cumulans 124 Labiotermes longilabius 138 Labiotermes longilabius 152 Labiotermes longilabius 155 Grigiotermes sp Orthognathotermes mirim 171 Rynchotermes nasutissimus 194 Silvestritermes euamignathus 205 Embiratermes festivelus 215 Procornitermes araujoi 298 Cyrilliotermes strictnasus 302 Dentispicotermes conjunctus 312 Embiratermes heterotypus 328 Orthognathotermes insignis 413 Embiratermes festivelus 466 Cornitermes cumulans 534 Procornitermes triacifer 553 Heterotermes sulcatus 564 Rynchotermes nasutissimus 567 Grigiotermes sp Heterotermes longiceps Resultado da amplifi- cação com LepR 1 LepF 1