Biossegurança na manipulação de microrganismos patogênicos ao homem e animais. Erna Geessien Kroon Laboratório de Vírus ICB UFMG

Transcrição

1 Biossegurança na manipulação de microrganismos patogênicos ao homem e animais Erna Geessien Kroon Laboratório de Vírus ICB UFMG

2 Como evitar a cadeia? Perigo Acidente Dano pessoal e material Plantas, animais, homem, meio ambiente

3 Biossegurança A construção do conceito de biossegurança, teve seu inicio na década de 70, quando a comunidade científica iniciou a discussão sobre os impactos da engenharia genética na sociedade.

4 Riscos Agentes Infecciosos Probabilidade de dano ou doença Patogenicidade Via de transmissão Estabilidade do agente Dose infectante Concentração Origem Profilaxia Determinação dos níveis de Biossegurança para impedir o escape ao meio ambiente

5 Níveis de Biossegurança NB-1 normas de biossegurança nível 1 = normas para a manipulação de agentes biológicos que representam baixo risco individual e para a comunidade (microrganismos que normalmente não causam doença em seres humanos ou animais de laboratório sadios).

6 NB-1 Equipamento de Segurança ( Barreira Primária) Roupa protetora - avental e luvas Podem ser necessários: proteção facial proteção de ouvidos Instalações (Barreiras Secundárias) Pia para lavar as mãos Superficies de fácil limpeza Bancadas Mobiliário robusto Janelas teladas

7 NB-1 Práticas microbiológicas Uso de pipetadores mecânicos (automáticos) Lavar as mãos Acesso restrito ou limitado quando estiver trabalhando Proibição de comer, beber e fumar Minimizar gotas e aerossóis Descontaminar áreas de serviço diariamente Descontaminar resíduos Manutenção de programa de controle de insetos & roedores

8 Níveis de Biossegurança NB-2 = normas de biossegurança nível 2 = normas para a manipulação de agentes biológicos que representam risco individual moderado e risco limitado para a comunidade (microrganismos capazes de causar doenças em seres humanos ou animais de laboratório sem apresentar risco grave ao trabalhador, comunidade ou ambiente. Tratamento efetivo e medidas preventivas disponíveis, risco de disseminação pequeno).

9 Como em NB-1 + NB-2 Práticas Microbiológicas Luvas Pipetas automáticas Cuidados com objetos cortantes Equipamento ( Barreira Primária) Uso de capela classe II para agentes infecciosos que formam aerossóis ou gotas grandes volumes altas concentrações Instalação (Barreiras Secundárias) Autoclave Estação Lava Olho

10 NB-2 Práticas Especiais Descontaminar área de serviço Relatar liberações e acidentes Não ter animais no laboratório Programas de imunização Amostras de soro base Precauções com agulhas e objetos cortantes Usar plásticos quando possível Não tocar em vidro cortado com as mãos

11 Equipamento de Segurança ( Barreiras Primárias) Capelas biológicas [NB-2/3] Roupa protetora pessoal Luvas Gorros Pipetadores automáticos Proteção para olhos e face Proteção respiratória [NB-3]

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13 Cabine Segurança Biológica Classe II Proteção para indíviduo e ambiente Suprimento e exaustão de ar por filtro HEPA IIA entrada de 75 lfpm e recircula 70% do ar IIB entrada de 100 lfpm e exaustão de 70% (B1) ou 100% ( B2)

14 HEPA - High Efficiency Particulate Air

15 Fluxo laminar

16 Níveis de Biossegurança NB-3 = normas de biossegurança nível 3 = normas para a manipulação de agentes biológicos que representam elevado risco individual e risco limitado para a comunidade (normas para o trabalho com microrganismos que geralmente causam doenças em seres humanos e/ou animais, ou ainda resultam em sérias consequências econômicas, com risco pequeno de disseminação por contatos individuais, existindo tratamento antimicrobiano ou antiparasitário).

17 NB-3

18 NB-3

19 Níveis de Biossegurança NB-4 = normas de biossegurança nível 4 = normas para a manipulação de agentes biológicos que representam elevado risco individual e elevado risco para a comunidade (normas para o trabalho com microrganismos que causam doenças graves ou são letais para seres humanos e animais, de transmissão fácil por contatos individuais casuais).

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21 Desinfecção e esterilização Antisséptico- inativa microrganismos ou inibe sua multiplicação. Aplicado em superfície de organismos. Desinfetante - inativa microrganismos ou inibe sua multiplicação. Não inativa os esporos. Aplicado em superfícies inertes Esterilização destrói todos os microrganismos

22 Germicidas químicos Hipoclorito de sódio 1a 5 g/l cloro 1:50 a 1:10 Formaldeído -5% carcinogênico Glutaraldeído -20 g/l -2% (alcalino) Compostos fenólicos Amônio quaternário cloreto benzalcônio Alcool etanol ou 2 -propanol Iodo Peróxido de hidrogenio 3%

23 Esterilização Calor Seco 1600C de 2 a 4 h Calor úmido 15 minutos a 1210C 25 minutos a 1150C Deslocamento por gravidade Pré-vacuo Incineração

24 AUTOCLAVE

25 Principais falhas humanas limpeza incorreta ou deficiente dos materiais; utilização de invólucros inadequados para os artigos a serem esterilizados; confecção de pacotes muito grandes, pesados ou apertados; disposição inadequada dos pacotes na câmara; abertura muito rápida da porta ao término da esterilização; tempo de esterilização insuficiente; utilização de pacotes que saíram úmidos da autoclave; mistura de pacotes esterilizados e não esterilizados; não identificação da data de esterilização e data-limite de validade nos pacotes; desconhecimento ou despreparo da equipe para usar o equipamento.

26 Substituir o bico de Bunsen Calor infra-vermelho 5-7 segundos a 815.6oC

27 Ou Bico de Bunsen protegido ou alças descartáveis

28 Transporte Embalagem primária e secundária a prova de derramamento Absorvente entre primário e secundário Cada embalagem primária é embalada individualmente Identificação depois da embalagem secundária Identificação de gelo seco

29 Transporte

30 Transporte de agente infeccioso

31 Recipientes para recolher lixo

32 Depósito de vidro e plástico

33 Recipientes para objetos cortantes e vidro

34 Circulação de agentes infecciosos no meio ambiente

35 Doenças Emergentes e reemergentes em humanos 75% de origem animal Fatores predisponentes Alterações demográficas Produção animal intensiva Turismo Comércio Guerras Degradação Ambiental

36 Tecnologia do DNA recombinante Métodos usados para construção e caracterização de moléculas de DNA recombinante. DNA Recombinante : DNA quimera de 2 espécies diferentes, usualmente a bacteriana, plasmidial ou viral contendo um gene de outra espécie. Engenharia Genética : Aplicação de técnicas de DNA recombinante

37 Plasmídeos

38 Produção de ovelha transgênica Produção de proteínas de uso farmacêutico Imunização de animais por meio da expressão transgênica de antígenos virais

39 Transferência de genes para seres humanos Ex-vivo vetores vetor Células humanas Gene terapêutico In vivo Transferência in vivo (seta em laraja) Nesta estratégia os vetores contendo o gene "terapêutico" são colocados diretamente no tecido alvo. Transferência ex vivo (seta em azul) As células do paciente são removidas pelo médico. No laboratório, o gene "terapêutico" é adicionado às células que, em seguida, retornam para o paciente geneticamente corrigidas. Células alteradas

40 No Brasil - Lei de Biossegurança , 24 de março de 2005 Art. 1 Esta Lei estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização sobre a construção, o cultivo, a produção, a manipulação, o transporte, a transferência, a importação, a exportação, o armazenamento, a pesquisa, a comercialização, o consumo, a liberação no meio ambiente e o descarte de organismos geneticamente modificados OGM e seus derivados...

41 Da classificação de risco do OGM Para a classificação de risco, deve-se também considerar: a) a possibilidade de recombinação de seqüências inseridas no OGM, levando à reconstituição completa e funcional de genomas de agentes infecciosos; b) outros processos que gerem um genoma infecciosos; c) genes que codifiquem substâncias tóxicas aos homens, aos animais, aos vegetais ou que causem efeitos adversos ao meio ambiente; d) genes de resistência a antibióticos de amplo uso clínico.

42 Resolução Normativa Nº 02 Os OGM serão classificados em quatro classes de risco, adotando-se como critérios o potencial patogênico dos organismos doador e receptor, a(s) seqüência(s) nucleotídica(s) transferida(s), a expressão desta(s) no organismo receptor, o OGM resultante e seus efeitos adversos à saúde humana e animal, aos vegetais e ao meio ambiente. Para genes que codificam produtos nocivos para a saúde humana e animal, aos vegetais e ao meio ambiente, o vetor utilizado deverá ter capacidade limitada para sobreviver fora do ambiente de contenção. Todo organismo geneticamente modificado deverá possuir um marcador capaz de identificá-lo dentre uma população da mesma espécie.

43 Resolução Normativa Nº 5, de 12 de março de 2008 Dispõe sobre normas para liberação comercial de Organismos Geneticamente Modificados e seus derivados.

44 SISTEMA DE BIOSSEGURANÇA DE OGM CTNBio Sócio-econômica e interesse nacional Normas de Biossegurança e avaliação de risco CNBS CIBio Manutenção da Biossegurança OERF Registro e Fiscalização

45 Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho De 2006 Art. 3º. A instituição que se dedique ao ensino, à pesquisa científica, ao desenvolvimento tecnológico e à produção industrial que utilize técnicas e métodos de engenharia genética ou realize pesquisas com Organismos Geneticamente Modificados (OGM) e seus derivados deverá criar uma Comissão Interna de Biossegurança (CIBio). 1º. A instituição de que trata o caput deste artigo indicará um técnico principal responsável para cada projeto específico. 2º. A instituição que pretender importar OGM e seus derivados para uso em atividades de pesquisa deverá instalar sua CIBio. 3º. As instituições devem reconhecer o papel legal das CIBios e sua autoridade e assegurar o suporte necessário para o cumprimento de suas obrigações, promover sua capacitação em biossegurança e implementar suas recomendações, garantindo que elas possam supervisionar as atividades com OGM e seus derivados.

46 Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho De 2006 Art. 12. A instituição de direito público ou privado que pretender realizar pesquisa em laboratório, regime de contenção ou campo, como parte do processo de obtenção de OGM ou de avaliação da biossegurança de OGM, o que engloba, no âmbito experimental, a construção, o cultivo, a manipulação, o transporte, a transferência, a importação, a exportação, o armazenamento, a liberação no meio ambiente e o descarte de OGM, deverá requerer, junto à CTNBio, a emissão do CQB.

47 Resolução Normativa Nº 01, De 20 De Junho De 2006 Art. 13. As organizações públicas e privadas, nacionais e estrangeiras, financiadoras ou patrocinadoras de atividades ou ao ensino com manipulação de organismos vivos, à pesquisa científica e ao desenvolvimento tecnológico e à produção industrial, devem exigir a apresentação de CQB, sob pena de se tornarem co-responsáveis pelos eventuais efeitos decorrentes do descumprimento do Decreto nº 5.591, de 22 de novembro de Parágrafo único. A instituição que pretender importar OGM e seus derivados para uso em atividades de pesquisa deverá requerer CQB.

48 Resolução Normativa Nº 01, de 20 de Junho de 2006 Art. 14. O CQB será emitido pela CTNBio mediante requerimento da CIBio da instituição interessada, o qual deverá estar acompanhado da documentação que consta do Anexo desta Resolução Normativa.

49 Resolução Normativa Nº 01, de 20 de Junho de 2006 V. para a emissão do CQB, a CTNBio considerará a competência e adequação do quadro funcional e a infra-estrutura disponível para os trabalhos com OGM e seus derivados.

50 Resolução Normativa Nº 01, de 20 de Junho de 2006 Art. 15. O CQB será emitido para uma unidade operativa dentro de uma instituição, podendo ser esta unidade constituída por um ou mais laboratórios ou outro tipo de infra-estrutura de funcionamento. Parágrafo único. A instituição, de acordo com suas necessidades, poderá requerer um ou mais CQBs.

51 Resolução Normativa Nº 01, de 20 de Junho de 2006 Art. 16. Sempre que uma instituição detentora de CQB pretender alterar qualquer componente que possa modificar as condições aprovadas na emissão do CQB, sua CIBio deverá requerer revisão ou extensão de seu CQB junto à CTNBio.

52 Resolução Normativa Nº 01, de 20 de Junho de 2006 Art. 19. A CTNBio poderá, conjuntamente com um ou mais órgãos e entidades de registro e fiscalização, realizar vistorias às instituições detentoras de CQB, devendo, com base nos seus resultados, manter, suspender ou cancelar o CQB da instituição vistoriada. Parágrafo único. A critério da CTNBio e considerando as classes de risco do OGM e seus derivados, a emissão, revisão extensão, suspensão e cancelamento de CQB poderá depender de vistoria às instalações.

53 Liberações comerciais Vacinas animais Vacina Inativada Contra Circovirose Suína Ingelvac Circoflex - Processo / Vacina Inativada Contra Circovirose Suína Suvaxyn PCV2 One Dose - Processo / Vacina RECOMBITEK - vacina contra cinomose, hepatite, adenovirose, parvovirose, parainfluenza, coronavirose e leptospirose caninas - Processo / Vacina VAXXITEK MD/IBD - uma vacina viva recombinante contra a doença de Marek e doença de Gumboro - Processo /

54 Fluxo para OGM Indicação CIBio CQB Aprovação CQB Submissão Projeto NB-1 pode ser CIBio NB-2 CTNBio Aprovação Identificação das áreas no Laboratório Trabalho seguindo as normas

55 Impacto da tecnologia DNA recombinante Genética Humana Mapeamento e clonagem de genes de doenças humanas Diagnóstico de doenças genéticas Determinação de paternidade Terapia genética Estudo dos genomas inteiros Biotecnologia Medicina Indústria Agricultura e Pecuária Produção de plantas e animais transgênicos

56 CRONOLOGIA DAS INOVAÇÕES NO DESENVOLVIMENTO DE NOVAS DROGAS * Fonte: Lehman Brothers Pharmaceutical Research

57 Promotor bacteriano Produção da insulina humana em E.coli AmpR β gal β gal Cadeia A da insulina Cadeia B da insulina Transformação em E.coli Cultura de células Purificação da proteína de fusão β gal-insulina β gal Cadeia A Região aminoterminal da cadeia B madura Cadeia B Tratamento com BrCN Peptídeos da β gal Cadeia A Primeira proteína recombinante licenciada para uso terapêutico Purificação das cadeias A e B Cadeia B Re-enovelamento e oxidação das cisteínas Insulina ativa Ponte dissulfeto

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59 Biotecnologia Verde Plantas produzindo antígenos para vacinas: Raiva E. coli enterotoxigênica Vibrio cholerae Hepatite B HIV Malaria

60 Biotecnologia Branca - Industrial desenvolvimento sustentado % da indústria química aplicará biotecnologia 300 bilhões de dólares Hoje apenas 2% Exemplo de integração interdisciplinar biocatálise, nanobiotecnologia, bioprocessamento e bioinformática

61 Biotecnologia branca -exemplo Remoção de óleos e graxas das fibras de algodão solução alcalina quente Uso de enzimas reduz em 60% de emissão de resíduos na água, 20% de redução de energia e 20% de redução de custos.

62 Biotecnologia branca Requer desenvolvimento de novas enzimas, processos, produtos e aplicações. Metagenomica promete fornecer novas moléculas Mas... Sistemas de expressão são necessários para que cada nova enzima e molécula bioativa seja um sucesso econômico

63 O cupim é capaz de gerar 2 litros de hidrogenio da fermentação de uma folha de papel, sendo um dos reatores mais eficientes do mundo.tem mais de 200 espécies de bactérias em seu intestino ajudando a explorar os potenciais metabolitos da lignocelulose.

64 Metagenômica Metagenômica é a estratégia para isolar, sequenciar e caracterizar DNA extraidos de amostras do meio ambiente. Esses dados com as assinaturas de RNA 16S ribosomal é utilizado para determinar o perfil da comunidade microbiana

65 Biotecnologia Azul Tecnologias que envolvam aplicação de métodos de biologia molecular a organaismos marinhos e de água doce

66 Antibióticos gerados de diatomáceas marinhas

67 Oceanos Oceanos ocupam 70 % da superfície da terra Produz metade do oxigênio da terra Microrganismos constituem 90 % da biomassa viva dos oceanos Vírus matam 20% dessa biomassa por dia Reservatórios inexplorados de diversidade genética da Terra

68 Oceanos 1 ml de água contem milhões de partículas virais A abundancia é 15 vezes maior que de bactérias e archaebactérias 55% da biomassa procariota

69 Biotecnologia Vermelha Envolve uso de biotecnologia para processos biomédicos

70 Produção de ovelha transgênica Produção de proteínas de uso farmacêutico Imunização de animais por meio da expressão transgênica de antígenos virais

71 Biotecnologia Vermelha Finalidades Médicas