AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA ANGIOTENSINA-(1-7) E DO SEU RECEPTOR MAS NO CONTROLE DA FUNÇÃO CARDÍACA UTILIZANDO ANIMAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e Farmacologia AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA ANGIOTENSINA-(1-7) E DO SEU RECEPTOR MAS NO CONTROLE DA FUNÇÃO CARDÍACA UTILIZANDO ANIMAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS Carlos Henrique de Castro Belo Horizonte Agosto 2008

2 3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e Farmacologia AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA ANGIOTENSINA-(1-7) E DO SEU RECEPTOR MAS NO CONTROLE DA FUNÇÃO CARDÍACA UTILIZANDO ANIMAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Fisiologia e Farmacologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências, área de concentração Fisiologia Orientador: Prof. Dr. Robson Augusto Souza dos Santos Co-Orientador: Prof. Dr. Alvair Pinto de Almeida Belo Horizonte Agosto 2008

3 4 DEDICATÓRIAS À Deus, Por estar sempre ao meu lado, abençoando e iluminando minhas decisões. À minha esposa Elisandra, Me acompanhou e me apoiou incondicionalmente desde o início desta jornada. Amor, compreensão e cumplicidade foram fundamentais para chegarmos juntos até aqui. Aos meus pais e minha irmã, Com dignidade, humildade e respeito me ensinaram o caminho do crescimento intelectual e professional. Ao meu sogro e à minha sogra, Luiz e Fátima, Pelos preciosos conselhos, pessoais e profissionais.

4 5 AGRADECIMENTOS Ao meu orientador, professor Dr. Robson Augusto Souza dos Santos, os mais sinceros agradecimentos. Sua confiança e orientação foi capaz de me trilhar para um imenso crescimento professional. Ao meu co-orientador, professor Dr. Alvair Pinto de Almeida, foi um grande responsável por esta conquista. Um grande incentivador e conselheiro. Ao Departamento de Fisiologia e Biofísica, ICB-UFMG, por ter possibilitado a realização deste trabalho. Ao professor Dr. Anderson José Ferreira, pelos conselhos e colaborações que foram importantes para a realização deste trabalho. Agradeço também pela grande amizade. Aos técnicos Elizabeth Dias Bomtempo e José Roberto, pelo empenho, disposição e amizade. Aos professores e colegas dos laboratórios de Hipertensão e de Fisiologia Cardiovascular do Departamento de Fisiologia, ICB, UFMG. Aos professores e colegas dos laboratórios de Biologia do Desenvolvimento e de Matriz Extracelular e Desenvolvimento do Coração do Departamento de Morfologia, ICB, UFMG.

5 6 RESUMO INTRODUÇÃO: O Sistema Renina-angiotensina (SRA) é um sistema essencial para a regulação das funções cardiovasculares, além de estar envolvido na patogênese de várias doenças cardiovasculares. Um importante avanço na compreensão do SRA foi o reconhecimento da Ang-(1-7) como um peptídeo biologicamente ativo. A identificação da proteína Mas como receptor da Ang-(1-7) forneceu uma base molecular importante para a significância biológica deste peptídeo. OBJETIVOS: O objetivo deste trabalho foi investigar o papel da Ang-(1-7) e do seu receptor Mas na função e remodelamento cardíaco e na resistência vascular coronariana. MATERIAIS E MÉTODOS: Para avaliar diretamente o papel do receptor Mas e o efeito do Ang-(1-7) especificamente no coração, nós utilizamos camundongos com deleção genética para o receptor Mas (KO-Mas) e ratos transgênicos [TG(hA1-7)L7301] (TG) que superexpressam uma proteína de fusão produtora de Ang-(1-7) especificamente no coração. A função cardíaca foi avaliada usando a preparação de coração isolado. Os corações dos camundongos KO-Mas e de seus controles selvagens [Wild Type (WT)], foram submetidos a 20 minutos de isquemia global após 30 minutos de estabilização. O fluxo foi reiniciado e os corações foram reperfundidos por 30 minutos. Em um grupo adicional de camundongos WT, o antagonista do receptor Mas, A-779, foi acrescentado na solução de perfusão. Além disso, foi avaliada a participação do receptor Mas no efeito vasodilatador coronariando da acetilcolina. Após um período de 30 min de estabilização, os corações foram submetidos à estimulação elétrica (450 bpm) e perfundidos por 20 min com acetilcolina (10-7 M). Nos corações dos ratos TG e SD, após um período basal de 20 min, a artéria coronária descendente esquerda foi ocluída por 15 minutos induzindo uma isquemia regional. A ligadura foi liberada e os corações foram reperfundidos por mais 30 minutos. Os níveis de Ang-(1-7) no plasma e coração dos ratos TG e SD foram determinados por Radioimunoensaio. Hipertrofia e fibrose cardíaca foram induzidas pelo tratamento com isoproterenol (3 mg/kg i.p. por 7 dias nos ratos e 20 mg/kg s.c. por 5 dias nos camundongos). A quantificação dos colágenos I e III e fibronectina foi realizada utilizando a técnica de imunofluorescência e microscopia confocal. Cortes dos ventrículos esquerdos foram corados com hematoxilina e eosina para análise morfométrica. RESULTADOS: Os corações isolados dos camundongos KO-Mas e WT perfundidos com A-779 apresentaram menor tensão sistólica, +dt/dt, - dt/dt e frequência cardíaca. Durante a isquemia, os corações WT apresentaram diminuição na tensão sistólica e aumento da tensão diastólica. Na reperfusão foi observado um aumento na tensão sistólica e diastólica nos corações WT. A deleção genética ou o bloqueio do receptor Mas atenuou estas alterações. Os corações TG apresentaram níveis aumentados de Ang-(1-7) no coração sem diferenças significativas no plasma. Em condições basais, a tensão sistólica, +dt/dt e -dt/dt foram maiores nos corações dos ratos TG. Já a frequência cardíaca foi menor nestes animais. Além disso, os corações isolados dos ratos TG mostraram menor incidência e duração das arritmias de reperfusão comparado com SD. O aumento na área de secção transversa dos cardiomiócitos

6 induzido pelo isoproterenol foi significativamente maior nos corações dos camundongos KO-Mas. Além disso, a deposição de colágeno III induzida por este mesmo tratamento também foi maior nos corações KO-Mas. O efeito hipertrófico induzido pelo isoproterenol não foi bloqueado pela superexpressão da Ang-(1-7) nos ratos TG. Entretanto, os corações destes animais apresentaram menor deposição de colágeno III e fibronectina. A pressão de perfusão foi maior nos corações dos camundongos KO-Mas e WT perfundidos com A-779. Surpreendentemente, o efeito da acetilcolina na resistência coronariana foi completamente ausente nos corações KO-Mas. A vasodilatação coronariana induzida pela acetilcolina não foi alterada nos animais KO-AT 1, mas foi maior nos corações KO-AT 2. O fluxo coronariano foi menor nos ratos TG, mas aumentou significativamente durante a reperfusão quando comparado aos ratos SD. CONCLUSÃO: Estes resultados indicam que o eixo Ang-(1-7)-Mas exerce um papel essencial na função cardíaca durante a isquemia/reperfusão e na modulação da função endotelial dos vasos coronarianos. Além disso, este estudo mostra uma participação cardioprotetora da Ang-(1-7) e do seu receptor Mas no remodelamento cardíaco. 7

7 8 ABSTRACT BACKGROUND: The renin angiotensin system (RAS), an important regulator of cardiovascular functions, plays a major role in the pathogenesis of cardiovascular diseases. One important advance in the understanding of the RAS was the recognition that Angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)] is a biologically-active product of the RAS. The recent identification of the G-protein-coupled receptor Mas as an Ang- (1-7) receptor has provided evidence for its biological significance. AIM: The aim of this study was to investigate the role of Ang-(1-7) and its receptor Mas on cardiac function, remodeling and coronary vascular resistance. MATERIALS AND METHODS: To directly investigate the role of receptor Mas and the effects of Ang-(1-7) specifically in the heart we used Mas knockout mice and transgenic rats [TG(hA1-7)L7301] (TG) which express an Ang-(1-7)-producing fusion protein in the heart. Cardiac function was examined using isolated heart preparations. Hearts from Wild Type (WT) and Mas knockout mice (KO-Mas) were subjected to 20 min of global ischemia after 30 min of stabilization. The flow was restarted and the hearts were reperfused for 30 min. An additional group of WT mice was perfused with Ang-(1-7) receptor Mas antagonist A-779. In addition, we evaluate the influence of receptor Mas on the effect of acetylcholine in the coronary resistance. Following a stabilization period of 30 min, hearts were subjected to pacing (450 bpm) and perfused for 20 minutes with acetylcholine (10-7 M). In hearts from SD and transgenic rats, after a basal period of 20 min, local ischemia was induced by left anterior descending coronary artery occlusion for 15 minutes. The ligature was released and reperfusion was performed for an additional 30 minutes. Ang-(1-7) level was determined by radioimmunoassay (RIA) in plasma and heart from transgenic and SD rats. Heart hypertrophy and fibrosis were induced by isoproterenol (3 mg/kg i.p./day for 7 days in rats and 20 mg/kg s.c./day for 5 days in mice). Quantification of collagen types I and III, plus fibronectin was performed using immunofluorescence-labeling techniques and confocal microscopy. Tissue sections from left ventricle were stained with hematoxylin eosin for cell morphometry. RESULTS: Isolated hearts of KO-Mas and WT treated with A-779 presented a decreased systolic tension, +dt/dt, -dt/dt, and heart rate. Upon global ischemia WT hearts showed a significant decrease in systolic tension and an increase in diastolic tension. During reperfusion an increase in systolic and diastolic tension was observed in WT mice. Deletion or blockade of Mas markedly attenuated these changes in isolated hearts. Heterozygous TG presented a significant increase in cardiac Ang-(1-7) concentration compared with control rats without any significant change in plasma Ang-(1-7) levels. At basal conditions, hearts from TG rats showed a higher systolic tension, + dt/dt, and - dt/dt and a lower heart rate. In addition, isolated hearts from TG rats showed reduced incidence and duration of reperfusion arrhythmias in comparison with SD rats. Cardiomyocyte crosssectional area was significantly higher in isoproterenol-treated KO-Mas mice when compared with isoproterenol-treated WT mice. Moreover, KO-Mas mice presented a significant increase of isoproterenol-induced collagen type III deposition. The hypertrophic effect induced by isoproterenol treatment was not blocked by the overexpression of Ang-(1-7) in the heart transgenic rats. However hearts from TG rats showed a less pronounced deposition of collagen type III and fibronectin

8 induced by isoproterenol treatment than in corresponding controls. Isolated hearts from Mas-KO and WT treated with A-779 presented an increase in the perfusion pressure in the baseline period. Strikingly, the effect of acetylcholine on coronary resistance was blunted in KO-Mas. However, acetylcholine-induced coronary vasodilation was actually increased in KO-AT 2 when compared with WT mice. Acetylcholine induced a similar coronary vasodilation in KO-AT 1 and its control mice hearts. The coronary flow was decreased in TG rats at basal conditions. However, it significantly increased during the reperfusion after ischemia when compared with normal rats. CONCLUSION: These results indicate that Ang-(1-7)-Mas axis plays a key role in the cardiac function during ischemia/reperfusion and in the modulation of endothelial function of coronary vessels. Moreover, this study shows a marked cardioprotective role of Ang-(1-7) and its receptor Mas in cardiac remodeling. 9

9 10 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Ilustração do Sistema renina-angiotensina mostrando as vias de formação de angiotensinas e seus recepores. AP, Aminopeptidases; ECA, Enzima Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; NEP, Endopeptidase Neutra; PCP, Prolil-carboxipeptidase; PEP, Prolil-endopeptidase, AT, Receptor de Angiotensina. Figura 2. Vias contra-regulatórias do Sistema renina-angiotensina. ECA, Enzima Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; AT, Receptor de Angiotensina. Figura 3. Diagrama esquematizando os protocolos experimentais. Figura 4. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na tensão sistólica (A) e diastólica (B) de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; # WT vs WT perfundidos com K- R contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). Figura 5. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na +dt/dt (A) e -dt/dt (B) de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). Figura 6. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na freqüência cardíaca de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). Figura 7. Avaliação dos níveis de Ang-(1-7) nos corações (A) e plasma (B) de ratos SD e TG. *p<0.05 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). Figura 8. Avaliação da tensão sistólica (A) e diastólica (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. * p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). Figura 9. Avaliação da +dt/dt (A) e dt/dt (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O

10 11 valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. *p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t- student). Figura 10. Avaliação da freqüência cardíaca (A) e do trabalho cardíaco (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. * p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). Figura 11. Avaliação do índice de severidade de arritmias (ISA) (A) e incidências das arritmias de reperfusão irreversíveis (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301 submetidos a oclusão da coronária descendente esquerda. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. * p<0.05 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). Figura 12. Efeito da deleção genética do receptor Mas na resposta hipertrófica induzida por isoproterenol. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls). Figura 13. (A) Imunolocalização de colágeno III em ventrículo esquerdo de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. A imagem inserida no canto superior direito representa o nível de marcação obtido quando o anticorpo primário não foi usado na incubação (controle negativo). (B) Quantificação da marcação do colágeno III nos ventrículos esquerdos de camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 14. (A) Imunolocalização de colágeno I em ventrículo esquerdo de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da marcação do colágeno I nos ventrículos esquerdos de camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 15. (A) Imunolocalização de fibronectina em ventrículo esquerdo de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da marcação de fibronectina nos ventrículos esquerdos de camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 16. Avaliação da resposta hipertrófica em ratos TG(hA1-7)L7301 induzida por isoproterenol. *p<0,01. Os valores estão expressos como média ± EPM (Oneway Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls).

11 12 Figura 17. (A) Imunolocalização de colágeno III em ventrículo esquerdo de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. A imagem inserida no canto superior direito representa o nível de marcação obtido quando o anticorpo primário não foi usado na incubação (controle negativo). (B) Quantificação da marcação de colágeno III nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 18. (A) Imunolocalização de fibronectina em ventrículo esquerdo de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da marcação de fibronectina nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 19. (A) Imunolocalização de colágeno I em ventrículo esquerdo de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da marcação de colágeno I nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 20. (A) Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na pressão de perfusão coronariana de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. (B) Curva da pressão de perfusão no período da reperfusão utilizada para análise do t 1/2. As linhas pontilhadas representam os valores do t 1/2 dos animais indicados. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; # p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). Figura 21. Avaliação do efeito vasodilatador da acetilcolina 10-7 mol/l em corações isolados de camundongos KO-Mas (A), KO-AT2 (B) e KO-AT 1 (C). Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05 comparado ao grupo controle. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). Figura 22. Avaliação do fluxo coronariano em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301 em condições basais (A) e durante isquemia/reperfusão (B). Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. * p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student).

12 13 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Composição da solução de Krebs-Ringer. Tabela 2. Índice de Severidade de Arritmias. Tabela 3. Coquetel de Inibidores de Proteases. Tabela 4. Soluções e volumes utilizados para RIE de Ang-(1-7). Tabela 5. Curva padrão para dosagem de proteína. Tabela 6. Descrição dos procedimentos realizados para o processo de inclusão dos tecidos. Tabela 7. Especificação dos anticorpos utilizados na técnica de imunofluorescência indireta. Tabela 8. Descrição dos procedimentos para a realização da técnica de imunofluorescência. Tabela 9. Descrição dos procedimentos para a realização da coloração dos cortes histológicos com hematoxilina e eosina.

13 14 LISTA DE ABREVIATURAS A-779, antagonista do receptor Mas ACN, acetonitrila Ang I, Angiotensina I Ang II, Angiotensina II Ang IV, Angiotensina IV Ang-(1-7), Angiotensina-(1-7) AP, Aminopeptidases; AT 1, subtipo 1 do receptor de angiotensina II AT 2, subtipo 2 do receptor de angiotensina II BSA, albumina de soro bovino DMSO, dimetilsulfóxido ECA, Enzima Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; EPM, erro pardrão da média HFBA, ácido heptafluorobutírico KO-AT 1, camundongos com deleção genética do receptor AT 1 KO-AT 2, camundongos com deleção genética do receptor AT 2 KO-Mas, camundongos com deleção genética do receptor Mas MEC, matriz extracelular NEP, Endopeptidase Neutra; PCP, Prolil-carboxipeptidase; PD , antagonista do receptor AT 2 PEP, Prolil-endopeptidase,

14 15 SD, Sprague Dawley SRA, Sistema renina-angiotensina TFA, ácido trifluoracético TG, rato transgênico WT, Wild Type, camundongos controles

15 16 SUMÁRIO RESUMO... ABSTRACT... LISTA DE FIGURAS... LISTA DE TABELAS... LISTA DE ABREVEATURAS... SUMÁRIO INTRODUÇÃO Sistema renina-angiotensina Receptores do sistema renina-angiotensina SRA e a estrutura cardíaca OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAIS E MÉTODOS Animais Preparação dos corações isolados Protocolos... A. Isquemia/Reperfusão... B. Avaliação do efeito vasodilatador da Acetilcolina Radioimunoensaio... IV VI VIII XI XII XIV Coleta do Coração e Plasma dos Ratos Transgênicos TG(hA1-7)L7301 e SD... 43

16 Homogeneização de tecidos, extração das amostras e dosagens dos peptídeos... A. Homogeneização do ventrículo esquerdo B. Extração da Ang-(1-7) do plasma e ventrículo esquerdo em colunas Bond Elut - C C. Radioimunoensaio para Angiotensina-(1-7) Dosagem de Proteínas Tratamento com isoproterenol Processamento do material para análises de morfometria e imunofluorescência Análise dos colágenos I e III e fibronectina por Imunofluorescência Análise quantitativa de colágenos I e III e fibronectina Análise Morfométrica ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS Efeito da deleção genética do receptor Mas na Contratilidade Cardíaca Avaliação da função cardíaca em ratos transgêncios TG(hA1-7)L7301 que superexpressam Angiotensina-(1-7) no coração Avaliação da incidência de arritmias de reperfusão em corações isolados de ratos que superexpressam Ang-(1-7) no coração Avaliação da resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em animais com deleção genética do receptor Mas Avaliação da resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em animais TG(hA1-7)L7301 que superexpressam Angiotensina-(1-7) no coração... 72

17 Avaliação da participação do receptor Mas e da Angiotensina-(1-7) nos vasos coronarianos em condições basais e pós-isquêmicas DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

18 19 1. INTRODUÇÃO 1.1. Sistema renina-angiotensina O Sistema Renina-angiotensina (SRA) é um importante sistema envolovido na regulação de diferentes funções, especialmente a regulação central e periférica da pressão arterial e do equilíbrio hidro-eletrolítico, além de estar envolvido na patogênese de várias doenças cardiovasculares (Morishita et al., 2000; Oudit et al., 2003). Após as primeiras descobertas sobre o SRA, há mais de um século, muito se avançou na compreensão de sua fisiologia e fisiopatologia. Os primeiros estudos relacionados ao SRA foram realizados por Tiegerstedt e Bergman em 1898, os quais observaram que extratos de rim não purificados causavam um aumento prolongado na pressão arterial de animais anestesiados (Tiegerstedt and Bergman, 1898; Inagami, 1998). Eles chamaram a substância responsável pelo aumento da pressão arterial de renina. Já em 1940, Braun- Mendes e colaboradores e Page & Helmer, relataram que o peptídeo pressórico não era a renina, e sim um produto da ação enzimática dessa substância sobre uma proteína plasmática (Braun-Menendez et al., 1940; Page and Helmer, 1940). Este produto foi posteriormente denominado angiotensina, resultado da agregação entre os termos hipertensina, originado na Argentina e angiotonina, nos Estados Unidos (Braun-Menendez and Page, 1958). Aproximadamente dez anos após os trabalhos desses dois grupos de pesquisadores foram identificadas duas formas de angiotensina, a angiotensina I (Ang I) e a angiotensina II (Ang II), sendo que a segunda é o resultado da quebra enzimática da primeira. Skeggs e colaboradores (1956) elucidaram a cascata de formação da angiotensina II,

19 20 demonstrando tratar-se de um octapeptídeo formado pela enzima conversora de angiotensina (ECA) (Skeggs et al., 1956). A importância da Ang II e todo o SRA no controle da homeostasia cardiovascular se tornou ainda mais relevante quando o grupo de pesquisadores formado por Inagami, Goodfriend e colaboradores descreveram os receptores da Ang II (apud Inagami, 1998). Desde então inúmeros estudos utilizando uma série de novos recursos experimentais permitiram a ampliação dos conhecimentos sobre esse complexo sistema. O SRA continua a ser amplamente estudado. Nas últimas décadas foram identificados novos componentes do sistema incluindo o receptor para Ang-(1-7) (Mas) (Santos et al., 2003), o receptor para pró-renina (Nguyen, 2007) e a Enzima Conversora de Angiotensina 2 (Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000). Basicamente, a formação dos peptídeos angiotensinérgicos ocorre por meio de um processo de proteólise limitada, iniciada pela hidrólise do angiotensinogênio pela aspartil-protease renina. Tanto o decapeptídeo Ang I quanto o octapeptídeo Ang II, podem sofrer processo de biotransformação dando origem a outros peptídeos bioativos menores, como por exemplo, a Ang III, Ang IV e importantemente a Ang-(1-7), a qual será foco deste estudo. Além da enzima conversora de angiotensina, outras enzimas são capazes formar Ang II, tanto a partir da Ang I como diretamente do angiotensinogênio (Santos et al., 2000). No entanto, a real importância dessas diferentes vias para a formação da Ang II ainda não está totalmente estabelecida. A clivagem da Ang I e Ang II em outras angiotensinas depende de vias enzimáticas diversas, entre elas, a endopeptidase neutra, prolil-endopeptidase, prolil-carboxipeptidase e finalmente a ECA2 (Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000), sendo esta última amplamente estudada a partir dos anos 2000.

20 21 Outro grande passo para os estudos do SRA ocorreu com o desenvolvimento de novas técnicas de biologia molecular e bioquímica, onde diversos componentes do SRA foram identificados em diferentes tecidos. Isto levou à confirmação da existência do SRA tecidual, exercendo importantes funções regulatórias parácrinas e/ou autócrinas. Sendo assim, o SRA não é mais visto somente como um sistema endócrino, mas também como um modulador de funções teciduais (Dzau, 1988; Lindpaintner et al., 1990; Dzau, 1993; Ruzicka and Leenen, 1997; Wollert and Drexler, 1999). O angiotensinogênio é o único precursor conhecido da angiotensina e é codificado por um único gene. Esta α 2 -globulina é secretada constitutivamente pelo fígado, embora possa ser também secretada em baixas concentrações por outros tecidos (Atlas, 1998). Algumas enzimas clivam o angiotensinogênio para gerar diretamente a Ang I, mas a principal enzima responsável por esta clivagem é a renina (Campbell, 2003). Renina é uma aspartil protease, inicialmente sintetizada como pró-renina. A renina ativa, uma glicoproteína de 340 aminoácidos, é secretada principalmente por células mieloepitelióides da arteríola glomerular aferente, sendo responsável pela quebra do angiotensinogênio formando a Ang I. Tanto a pró-renina quanto o angiotensinogênio são expressos em vários tecidos, mas a queda nos níveis de renina ativa observada após nefrectomia, mostra que o rim é um dos principais sítios de conversão de prórenina em renina ativa (Atlas, 1998; Campbell, 2003). A ECA, uma dipeptidil carboxipeptidase, cliva a ligação Phe 8 His 9 da Ang II para formar Ang I (Peach, 1977). Duas formas distintas da ECA são encontradas em humanos: a forma somática, que é encontrada em vários tecidos e uma isoenzima menor, a forma germinal, encontrada exclusivamente em testículos, a qual apresenta um

21 22 importante papel na fertilidade. Ambas as formas existem nas superfícies celulares como ectoenzimas, hidrolisando alguns peptídeos circulantes. A forma somática é particularmente abundante na superfície endotelial dos pulmões, rins, intestino, placenta e plexo coróide. Além de atuar sobre a Ang I para formar a Ang II, ela participa também da degradação de outros peptídeos, como a bradicinina (Turner and Hooper, 2002). Uma outra importante enzima, a ECA 2, recentemente caracterizada em humanos e roedores (Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000), é uma enzima importante na regulação da função cardíaca e também está implicada em doenças cardiovasculares e renais (Crackower et al., 2002; Burrell et al., 2004; Danilczyk and Penninger, 2006). Esta enzima é composta de 805 aminoácidos que tem 42 % de homologia com o domínio catalítico N-terminal da ECA e uma região hidrofóbica próxima ao C-terminal. Diferentemente da ECA, ECA2 tem somente um sítio enzimático ativo e funciona mais como carboxipeptidase que dipeptidil carboxipeptidase. Assim, ela remove um único resíduo (Leu) da Ang I para gerar Ang-(1-9), um peptídeo com funções ainda desconhecidas. Embora a ECA2 tenha sido originariamente descrita por sua capacidade de gerar Ang-(1-9) a partir da Ang I (Donoghue et al., 2000), esta enzima também degrada Ang II formando Ang-(1-7), atualmente considerado seu principal papel, pois sua afinidade catalítica para a Ang II é 400 vezes maior que para Ang I (Vickers et al., 2002). Isto mostra seu papel fundamental na síntese de Ang-(1-7). Funcionalmente, a ECA2 é distinta da ECA por ser uma carboxipeptidase com atividade não afetada por inibidores específicos da ECA e possuir diferentes espectros de substratos, uma vez que a Ang II é um substrato da ECA2, ao contrário da bradicinina (Coates, 2003). Outras enzimas, como ilustrado na figura