UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS ANA CAROLINE MOURA RODRIGUES QUANTIFICAÇÃO DE Leishmania infantum chagasi EM Lutzomyia longipalpis CAPTURADOS NO PERÍODO DE FEVEREIRO DE 2009 A JANEIRO DE 2010 NO MUNICÍPIO DE FORTALEZA, CEARÁ, BRASIL FORTALEZA 2012

2 ANA CAROLINE MOURA RODRIGUES QUANTIFICAÇÃO DE Leishmania infantum chagasi EM Lutzomyia longipalpis CAPTURADOS NO PERÍODO DE FEVEREIRO DE 2009 A JANEIRO DE 2010 NO MUNICÍPIO DE FORTALEZA, CEARÁ, BRASIL Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves. Orientadora: Profa. Dra.: Claudia Maria Leal Bevilaqua FORTALEZA

3 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho R696q Rodrigues, Ana Caroline Moura Quantificação de Leishmania infantum chagasi em Lutzomyia longipalpis capturados no período de fevereiro de 2009 a janeiro de 2010 no município de Fortaleza, Ceará, Brasil. / Ana Caroline Moura Rodrigues. Fortaleza, p. ; il. Orientadora: Prof a. Dr a. Claudia Maria Leal Bevilaqua. Co-orientadora: Dr a. Luciana Magalhães Melo. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Área de Concentração: Sanidade e Reprodução de Carnívoros, Onívoros e Aves. ANA CAROLINE MOURA RODRIGUES 1. Leishmania infantum chagasi. 2. Lutzomyia longipalpis. 3. qpcr. 4. Taxa de infecção. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. CDD:

4 QUANTIFICAÇÃO DE Leishmania infantum chagasi EM Lutzomyia longipalpis CAPTURADOS NO PERÍODO DE FEVEREIRO DE 2009 A JANEIRO DE 2010 NO MUNICÍPIO DE FORTALEZA, CEARÁ, BRASIL Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Aprovada em: / / BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua Universidade Estadual do Ceará Orientadora Dra. Luciana Magalhães Melo Universidade Estadual do Ceará Co-Orientadora Profa. Dra. Maria Jania Teixeira Universidade Federal do Ceará Examinadora Dra. Fernanda Cristina Macedo Rondon ADAGRI-CE Examinadora 4

5 AGRADECIMENTOS Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias por disponibilizar a infraestrutura necessária para o desenvolvimento do projeto. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro. A Deus por me guiar nos caminhos certos e abençoar os meus planos. Por ser a minha rocha e fortaleza onde busco refúgio nas horas de aflição e angustia. Agradeço por permitir a realização de mais uma conquista. Obrigada Senhor. Aos meus pais, Ana Eclésia e Bernardo, exemplos de luta, perseverança e honestidade. Obrigada pelo amor, força e incentivo independente das circunstâncias. Todos os esforços valeram a pena!amo vocês. As minhas irmãs Camila e Clarissa pela amizade eterna, pelos momentos de alegria e companheirismo. Ao meu namorado, Igor Ciríaco Barroso, pelo amor e apoio nos momentos mais difíces e pela alegria que deixou tudo mais fácil. Aos ICs, mestrandos e doutorandas do LABODOPAR pela cooperação mútua. Em especial Dra Fernanda Cristina Macedo Rondon, Dra Ana Lurdes Camurça Vasconcelos e Eudson Maia de Queiroz Júnior pela amizade e auxilio pessoal e profissional nas horas difíceis. A Dra Claudia Maria Leal Bevilaqua, minha orientadora, pela dedicação e confiança demonstrada desde a iniciação científica. Pelos ensinamentos e estímulo, imprescindíveis para conclusão deste trabalho. A Dra Luciana Magalhães Melo, minha co- orientadora, pelo exemplo profissional, pela simplicidade e por estar sempre disposta a ajudar. A Cruiff Emerson Pinto da Silva pela análise estatística do presente trabalho. 5

6 A toda equipe do LFCR que me recebeu com muita hospitalidade, destacando o auxílio de importância indescritível da aluna Maria Claudia dos Santos Luciano. Obrigada pela amizade, paciência e incansável disposição durante a realização deste projeto. 6

7 RESUMO A leishmaníase visceral (LV) é uma doença parasitária causada pelo protozoário flagelado Leishmania infantum chagasi. A transmissão ocorre através da picada do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, díptero da família Psychodidae e principal vetor da LV no novo mundo. A detecção e identificação de espécies de Leishmania spp infectando flebotomíneos são de grande importância, pois auxiliam no monitoramento da expansão da doença em áreas endêmicas e adjacentes. Isso normalmente é feito por exame microscópico, após dissecação do trato digestivo do vetor, contudo é um método laborioso e pouco sensível. Atualmente métodos moleculares como a reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido utilizada em estudos epidemiológicos para mensurar a taxa de infecção de flebotomíneos coletados a campo. A PCR em tempo real (qpcr) é capaz de detectar baixa carga parasitária, reduzindo a quantidade de falso negativo e quantificando o número de parasitos nos flebotomíneos. Este trabalho teve como objetivo detectar e quantificar L.infantum chagasi em L. longipalpis coletados durante levantamento entomológico no município de Fortaleza, por meio da qpcr. A captura dos flebotomíneos foi realizada de fevereiro de 2009 a janeiro de 2010, em 22 pontos distribuídos em quatro regiões do município de Fortaleza. Duas armadilhas do tipo CDC foram utilizadas em cada ponto de coleta, no intra e peridomicilio. Para extração de DNA foram utilizados pools contendo 10 fêmeas de flebotomíneos separados de acordo com a região, período de coleta, local da armadilha. Para amplificação do DNA de L. infantum chagasi, foram usados primers direcionados para o gene que codifica o DNA do cinetoplasto (kdna) e o gene que codifica a enzima metilenotetrahidrofolato desidrogenase (MTHD). Para a amplificação do DNA de L. braziliensis, foram usados primers direcionados para o genes que codifica a RNase III. A especificidade foi determinada pela análise da curva de melting após cada qpcr. A carga parasitária foi mensurada por quantificação absoluta. Para análise estatística foi utilizado distribuição de frequência e teste qui-quadrado ou exato de Fischer. O nível de significância adotado foi de 5% e utilizou-se o software SPSS V19. Dos 123 pools, 45 apresentaramse positivos para L.infantum chagasi, sendo a taxa de 36,5%. A carga parasitária variou de 2,583 ± 0,908 a ± ,3 parasitos por pool de flebotomíneos. Não foi observada diferença estatística com relação a frequência de flebotomíneos infectados entre as regiões (P=0,3014), período de coleta (P=0,3906) ou local da armadilha(p=0,8486). Somente na região Oeste foram observadas diferenças estatísticas com relação a frequência de flebotomíneos infectados entre os dois períodos de coleta (P=0,0152). A utilização da qpcr é uma técnica de alta sensibilidade e especificidade para detecção, identificação e quantificação de parasitos em flebotomíneos naturalmente infectados. Palavras-chave: Leishmania infantum chagasi. Lutzomyia longipalpis. qpcr. Taxa de infecção 7

8 ABSTRACT The visceral leishmaniasis (VL) is a parasitic disease caused by the flagellate protozoan Leishmania infantum chagasi. Transmission occurs through the bite of the sandfly Lutzomyia longipalpis, Diptera family Psychodidae and the main vector of VL in the new world. The detection and identification of Leishmania species infecting sandflies are great importance, as they help in monitoring the spread of the disease in endemic areas and adjacent. This is usually done by microscopic examination after dissection of the digestive tract of the vector, however, is a laborious method. A currently molecular method such as polymerase chain reaction (PCR) has been used in epidemiological studies to measure the rate of infection of sand flies collected in the field. The real-time PCR (qpcr) is a technique capable of detecting lower parasite load, reducing the amount of false negative and quantifying the number of parasites in sandflies. This work aims to detect and quantify L.infantum chagasi in L. longipalpis collected during an entomological survey in the city of Fortaleza, by qpcr. The capture of sandflies was conducted from February 2009 to January 2010 in 22 sites in four regions. Two CDC traps were used in each collection point, inside and outside homes. The females were grouped in pools of 10 specimens based on region of capture (North, South, East and West), the trap location (indoors or in the vicinity of households) and the season of year (dry or wet). For the amplification of L. infantum chagasi DNA, primers targeting kdna and Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (MTDH) were employed. For the amplification of L. braziliensis DNA, primers targeting RNase III domain gene were employed. Specificity was determined by analysis of melting curves after each qpcr. The parasite load was measured by absolute quantification. For statistical analysis, frequency distribution and chi-square or Fisher exact. The significance level was 5% and used the software SPSS V19. Of the 123 pools, 45 were positive for L.infantum chagasi, and the infection rate was 36.5%. The parasite load in the samples ranged from ± to 2,820,246 ± 129,911.3 parasites per pool. No statistical differences were found with respect to the frequence of sandfly infection between the regions (P=0.3014), season (P=0.3906) or trap location (P=0.8486). Statistical differences were found with respect to the frequence of sandfly infection between the two seasons only at the region West (P=0.0152). The use of qpcr is a technique with high sensitivity and specificity for the detection, identification and quantification of parasites in naturally infected sandflies. Keywords: Leishmania infantum chagasi. Lutzomyia longipalpis. qpcr. Infection rate 8

9 LISTA DE FIGURAS DISSERTAÇÃO Figura 1 Promastigotas e amastigotas (A) de Leishmania spp (B). A seta preta mostra a localização de amastigotas parasitando o macrófago...17 Figura 2 - Ciclo biológico dos flebotomíneos. (A) Ovo. (B) Larva. (C) Pupa...19 Figura 3 - Adesão de formas promastigotas de Leishmania sp. nas microvilosidades do intestino médio de flebotomíneo...22 Figura 4 Ciclo de Leishmania spp. em vetor competente...23 ARTIGO Figure 1 - Location of the city of Fortaleza, Ceará State (CE), Brazil. Dotted lines mark the regions with the neighborhoods (gray areas) from which the sandflies were collected...53 Figure 2 - Specificity of real-time qpcr amplifications to detect and quantify Leishmania parasites in sand flies. Derivative melting curves of kdna (A), V-ATP (B), MTHD (C) and RNase III (D) amplicons produced with L. infantum chagasi (A and C), Lutzomyia longipalpis (B) or L. braziliensis (D) DNA templates. Negative controls (arrows) were reactions performed with L. braziliensis (C), L. infantum chagasi (D) or without DNA template (A and B) 54 Figure 3 - Real-time qpcr amplifications used to quantify Leishmania infantum chagasi parasites in L. longipalpis pools. Standard curves for amplification of kdna (A) and V-ATP (B) genes were prepared through tenfold serial dilutions of stock DNA solutions of L. infantum chagasi and L. longipalpis, respectively. Linearity (R 2 ), efficiency (E) and curve slopes were shown for each curve...55 Figure 4 - Distribution of Lutzomyia longipalpis pools analyzed for Leishmania infantum chagasi infection in Fortaleza, Brazil. Positive pools were shown by region (A), season (B) and trap location (C). No statistical differences were found with respect to the frequence of sandfly infection between the regions (P=0.3014), season (P=0.3906) or trap location (P=0.8486) Figure 5 - Presence of Leishmania infantum chagasi in Lutzomyia longipalpis captured by traps placed inside (indoors) and outside (outdoors) homes localized at each 9

10 Fortaleza region. No statistical differences were found with respect to the frequence of sandfly infection between the two trap locations at the regions North (P=0.2007), South (P=0.3107), East (P=0.6267) and West (P=1.0000) 57 Figure 6 - Presence of Leishmania infantum chagasi in Lutzomyia longipalpis captured during the rainy and the dry seasons from February 2009 to January 2010 in Fortaleza region. Statistical differences were found with respect to the frequence of sandfly infection between the two seasons only at the region West (a,b: P=0.0152)

11 LISTA DE TABELAS ARTIGO Table 1 - Oligonucleotides used to amplify Leishmania infantum chagasi, Leishmania braziliensis and Lutzomyia longipalpis genes in real-time PCR assays..52 Table 2 - Leishmania infantum chagasi quantification in high burden sand fly pools. 53 Table 3 - Leishmania infantum chagasi quantification in low burden sand fly pools

12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS C t Ciclo do limiar de detecção da fluorescência DNA Ácido desoxiribonucléico E Eficiência Fg Fentograma kdna DNA de cinetoplasto L. chagasi Leishmania chagasi L. cruzi Lutzomyia cruzi L. infantum Leishmania infantum L. longipalpis Lutzomyia longipalpis LPG - Lipofosfoglicano LV Leishmaníase Visceral MP Matriz Peritrófica MS Ministério da Saúde MTHD - Metilenotetrahidrofolato desidrogenase Ng - Nanograma NUVEP Núcleo de Vigilância Epidemiológica PCR Reação em Cadeia da Polimerase Pg Picograma qpcr PCR em Tempo Real Quantitativo R 2 Coeficiente de correlação ou linearidade RNA Ácido ribonucléico S Coeficiente angular SESA-CE Secretaria de Saúde do Estado do Ceará SINAN Sistema de Informação de Agravos de Notificação SVS Secretaria de Vigilância em Saúde V-ATP ATPase vacuolar WHO World Health Organization 12

13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Distribuição geográfica Etiologia Reservatórios Vetores Biologia dos Flebotomíneos Capacidade Vetorial Ciclo de Transmissão Medidas de controle Biologia molecular como ferramenta epidemiológica Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) PCR em tempo real (qpcr) JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS CAPÍTULO I CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

14 1 INTRODUÇÃO As Leishmaníases são doenças parasitárias causadas por protozoários flagelados do gênero Leishmania e apresentam diversas manifestações clínicas (BRYCESON, 1996). A Leishmaníase Visceral (LV) é a forma mais severa caracterizando-se por ser uma doença crônica e potencialmente letal quando não tratada a tempo (WHO, 2004). Estima-se que novos casos e mais de óbitos da doença ocorram a cada ano. Cerca de 90% dos casos de LV ocorrem em apenas cinco países: Bangladesh, Índia, Nepal, Sudão e Brasil (DESJEUX, 2004; CHAPPUIS et al., 2007). A transmissão da LV ocorre através da picada do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, díptero da família Psychodidae e principal vetor da LV no novo mundo (YOUNG & DUNCAN, 1994). No Brasil, até o momento duas espécies estão comprovadamente relacionadas com a transmissão da LV, L. longipalpis e Lutzomyia cruzi, sendo a primeira considerada a principal espécie vetora de Leishmania infantum chagasi e a segunda aparecendo apenas em alguns municípios do Mato Grosso do Sul (GALATI et al., 1997; RIBEIRO, 2007; ALMEIDA et al., 2010). Estudos recentes levantaram suspeita de que Lutzomyia migonei também seja vetor de LV em locais onde a doença estava presente na ausência de L. longipalpis (CARVALHO et al., 2010; SALOMÓN et al., 2010). Modelos matemáticos sugerem que o controle de vetores e a vacinação de cães são medidas mais eficazes do que a eutanásia do cão. Assim, devido à falta de vacinas comprovadamente eficazes e ao pequeno número de drogas utilizadas para tratamento da doença, o estudo e controle do vetor continua sendo um importante componente no controle das Leishmaníases (DYE, 1996; GRAMICCIA, 2011). A detecção e identificação de espécies de Leishmania infectando flebotomíneos são de grande importância, pois auxiliam no monitoramento da expansão da doença em áreas endêmicas e adjacentes (DESJEUX, 2001; CHOI & LERNER, 2001). Isso normalmente é feito por exame microscópico, após dissecação do trato digestivo do vetor. O método é pouco sensível e a distinção entre as formas flageladas para identificação da espécie do parasito é impossível (PAIVA et al., 2006). 14

15 Atualmente métodos moleculares como a reação em cadeia da polimerase (PCR) estão sendo usados em estudos epidemiológicos para determinação da taxa de infecção em flebotomíneos (OLIVEIRA-PEREIRA et al., 2006; PAIVA, 2009), entretanto os achados dos estudos com PCR convencional mostram baixas taxas de infecção variando de 0,4% a 3,9% (MARTÍNS-SÁNCHEZ et al., 2006; OLIVEIRA-PEREIRA et al., 2006; PAIVA et al., 2006; SILVA et al., 2008). A partir da PCR convencional surgiu a PCR em tempo real (qpcr), uma técnica inovadora capaz de promover a quantificação acurada e o monitoramento, em tempo real, do produto amplificado. A qpcr consegue detectar cargas parasitárias muito baixas, reduzindo a quantidade de falsos negativos e quantificando o número de leishmânias nos flebotomíneos, consequentemente, permitindo maior precisão na determinação da taxa de infecção natural em flebotomíneos (BEZERRA- VASCONCELOS, 2010; RANASINGHE et al., 2008). As principais vantagens dos métodos moleculares são a sensibilidade e especificidade, independente do número, estágio e localização dos parasitos no inseto (PEREZ et al., 1994). Além da rapidez na obtenção dos resultados, reprodutibilidade e capacidade quantitativa, no caso da qpcr (CAVALCANTI, 2008). 15

16 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Distribuição geográfica A LV foi considerada primariamente uma zoonose de caráter eminentemente rural, mas recentemente vem se expandindo para áreas urbanas de médio e grande porte e se tornou crescente problema de saúde pública no país e em outras áreas do continente americano, sendo uma endemia em franca expansão geográfica (BRASIL, 2006). Além disso, é considerada uma doença dinâmica e as circunstâncias de transmissão estão mudando continuamente devido aos impactos ambientais e demográficos provocados pelo homem (GRAMICCIA, 2011). O Brasil é o principal responsável pelos casos registrados de LV humana na América Latina. Casos autóctones de LV humana são notificados em todas as regiões do país, inclusive na região sul, antes considerada área livre da doença (RIO GRANDE DO SUL, 2009). Contudo, a maior incidência encontra-se na região Nordeste, responsável por 54% do total de casos. Na região Nordeste, a doença pode apresentar letalidade de até 10% quando não se institui o tratamento adequado (ALEXANDRINO, 2001). Transformações ambientais associadas a movimentos migratórios e ao processo de urbanização podem explicar, em parte, porque a LV, restrita a áreas rurais do país até a década de 1970, a partir de então, passou a ocorrer de forma endêmica e epidêmica em grandes cidades do Nordeste brasileiro e, subsequentemente, disseminou-se para outras macrorregiões do país (BRASIL, 2006). Especificamente no Estado do Ceará, os municípios de Fortaleza, Caucaia, Juazeiro do Norte, Sobral e Barbalha apresentam a maior incidência da LV humana (CEARÁ, 2008). No cenário epidemiológico da LV no Brasil, o município de Fortaleza tem destaque pela transmissão urbana com elevado número de casos humanos e caninos da doença, sendo considerada área de transmissão intensa alta e prioritária para o desenvolvimento das ações de controle. De acordo com informações obtidas na Secretaria de Saúde, nos anos de 2009 e 2010, casos autóctones de LV foram notificados no Ceará (SINAN/SVS/MS, 2011). No que diz respeito à população canina um levantamento realizado em Fortaleza demonstrou prevalência da LV de 26,2% (196/750) em cães domiciliados e de 21,4% (135/631) em cães de rua (RONDON et al., 2008). Cães infectados têm sido encontrados em todos os focos onde há doença 16

17 humana, deste modo, representam o principal elo na cadeia de transmissão (MOREIRA Jr. et al., 2004). 2.2 Etiologia A LV é causada por protozoários da ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e gênero Leishmania, pertencentes ao complexo Leishmania (Leishmania) donovani. Apresentam dois estágios no seu ciclo de vida: promastigota com motilidade flagelar, que vive no trato digestivo dos flebotomíneos, e amastigota, não móvel, que resiste dentro de macrófagos de hospedeiros vertebrados (Figura 1) (GRIMALDI Jr. et al., 1991; CUPOLILLO et al., 2000). A Figura 1. Promastigotas (A) e amastigotas (B) de Leishmania spp. A seta preta mostra a localização de amastigotas parasitando macrófago. Fontes: No Brasil, o agente etiológico é Leishmania chagasi, sinonímia de Leishmania infantum, encontrada em alguns países do Mediterrâneo e da Ásia (MAURICIO et al., 2000). Existe uma grande polêmica em torno da origem da LV no novo mundo, se foi introduzida recentemente, durante a época da colonização europeia e sendo assim o agente seria L. infantum; ou há vários milhões de anos, juntamente com a introdução dos canídeos, devendo ser classificada como L. chagasi (GONTIJO & MELO, 2004). Os achados de altas taxas de infecção em canídeos originários da Amazônia sugerem a origem autóctone (LAINSON et al., 1987). Estudos recentes baseados em métodos enzimáticos e moleculares demonstraram que as diferenças entre cepas de L. infantum e L. chagasi são tão restritas que acredita-se tratar de uma mesma espécie (MAURICIO et al., 2000; DANTAS-TORRES, 2006), outros pesquisadores consideram B 17

18 como subespécies (LAINSON & RANGEL, 2005) e aceitam a hipótese de origem recente nas Américas. Maurício et al. (2000), afirmaram que os resultados destes estudos são irrefutáveis e evidenciaram que L. infantum e L. chagasi, devem ser consideradas sinônimos, tendo prioridade a nomenclatura mais antiga. 2.3 Reservatórios Na área urbana o cão é a principal fonte de infecção, sendo considerado o principal reservatório doméstico por viver próximo ao homem, ser atrativo para os flebotomíneos, apresentar taxas de infecção significativa e, em geral ser infectante para o vetor (ALENCAR, 1956; MILES et al., 1999). No ambiente silvestre os reservatórios são raposas (Cerdocyon thous), marsupiais (Didelphis albiventris) e roedores (Nectomys squamipes) que agem como mantenedores do ciclo da doença (DANTAS-TORRES et al., 2006). Recentemente, o gato doméstico (Felis catus) foi encontrado naturalmente infectado por L. chagasi, em uma área de transmissão de LV no estado de Minas Gerais, porem seu papel epidemiológico não está definido (SILVA et al., 2010). Estudo realizado na região centro-oeste do Brasil verificou que L. longipalpis alimenta-se preferencialmente em aves, roedores, humanos, gambás, bois, cavalos e cães em ordem decrescente de importância, revelando assim que o papel dos cães como hospedeiro reservatório em algumas áreas pode ter uma menor relevância (MISSAWA et al., 2008). 2.4 Vetores Os vetores das Leishmaníases são insetos denominados flebotomíneos, pertencentes à ordem Diptera, família Psychodidae, subfamília Phlebotominae, gênero Lutzomyia no novo mundo e Phlebotomus no velho mundo. Conhecido popularmente, dependendo da localização geográfica, como mosquito palha, tatuquira, birigui, entre outros (BRASIL, 2006). Algumas espécies além de transmitirem o protozoário Leishmania são hospedeiras de cerca de 150 microorganismos, como tripanossomatídeos, vírus e bactérias (SHAW et al., 2003). 18

19 2.4.1 Biologia dos Flebotomíneos Os flebotomíneos, são insetos de pequeno porte medindo de 2 a 3 mm de comprimento, possuem o corpo revestido por pelos, castanho claro ou cor de palha. São facilmente reconhecíveis pelo seu comportamento, ao voar em pequenos saltos e pousar com as asas entreabertas. Na fase adulta estão adaptados a diversos ambientes, porém na fase larvária desenvolvem-se em ambientes terrestres úmidos e ricos em matéria orgânica e de baixa incidência luminosa (LAINSON & RANGEL, 2003; BRASIL, 2006). Assim como muitos outros dípteros hematófagos, estes insetos necessitam de suprimentos de carboidratos que, na natureza, adquirem diretamente da seiva de plantas, néctar (ALEXANDER & USMA, 1994), secreções de afídeos e frutas maduras (CAMERON et al., 1995). A hematofagia é um hábito exclusivo das fêmeas, que necessitam do sangue para a oviposição e o obtém sugando diversos vertebrados (mamíferos, aves, répteis e anfíbios). Durante o dia, os flebotomíneos adultos se mantêm abrigados em locais úmidos e os ovos são depositados em microambientes ricos em matéria orgânica que fornece alimento para as larvas (ALEXANDER, 2000). Possuem hábitos crepusculares e noturnos para realizar a hematofagia, embora possuam também hábitos matutinos e vespertinos no interior das matas (FORATTINI, 1973). O ciclo biológico se processa no ambiente terrestre e compreende quatro fases de desenvolvimento: ovo, larva (com quatro estádios), pupa e adulto (Figura 2). A oviposição inicia-se normalmente no 5º dia após a refeição de sangue e varia de 24 a 52 ovos por fêmea. As fêmeas são atraídas pelo hexanol e 2-metil-2-butanol presente em fezes de frango ou coelho. Esses compostos estimulam a oviposição (DOUGHERTY et al., 1995). A eclosão dos ovos ocorre geralmente após 6 a 9 dias, com o desenvolvimento de larvas e pupas cerca de 14 a 19 dias e 8 a 9 dias, respectivamente (RANGEL et al., 1986). Figura 2. Ciclo biológico dos flebotomíneos. (A) Ovo. (B) Larva. (C) Pupa. Fonte: Maurício Luiz Vilela. 19

20 2.4.2 Lutzomyia longipalpis A primeira descrição de L. longipalpis foi feita por Lutz & Neiva (1912) a partir de insetos capturados nos estados de São Paulo e Minas Gerais. A distribuição coincidente de L. longipalpis e LV na maior parte da América Latina reforçou a idéia inicial de que este seria o principal vetor da doença nessa região (LAINSON & RANGEL, 2005). A relação de provas que incriminavam L. longipalpis como principal transmissor de LV foi concluída quando cinco transmissões distintas para hamsters foram obtidas experimentalmente pela picada destes flebotomíneos (LAINSON et al., 1977). No Brasil, L. longipalpis ocorre nas regiões Norte, Nordeste, Centro Oeste, Sudeste e recentemente na região Sul (LAINSON & RANGEL, 2003). Nas regiões Norte e Nordeste, este flebotomíneo era encontrado originalmente nas matas participando do ciclo primário de transmissão da doença. Progressivamente houve adaptação desse inseto para o ambiente rural e sua adaptação a este ambiente foi somada à presença de animais silvestres e sinantrópicos (BRASIL, 2006). Ao final da década de 80 esta espécie começou a invadir o ambiente urbano, especialmente a periferia das grandes cidades, onde foi capturado no intradomicílio e peridomicílio, no último caso, em dependências com animais domésticos (LAINSON & RANGEL, 2005). Este flebotomíneo se adapta facilmente ao peridomicílio e a variadas temperaturas, podendo ser encontrado no interior dos domicílios e em abrigos de animais domésticos. Há indícios de que o período de maior transmissão de LV ocorra antes e após a estação chuvosa, quando há um aumento da densidade populacional do inseto (BRASIL, 2006; SARAIVA et al., 2011). Na cidade de Fortaleza 61,7% dos especimens de L. longipalpis foram capturadas no intradomicílio e 38,24% no peridomicilio. Esta espécie parece estar totalmente adaptada às áreas urbanas de Fortaleza. Esta adaptação é preocupante devido ao aumento das interações entre o vetor e indivíduos suscetíveis que possam tornar difícil a prevenção e o controle da doença (SILVA, 2011) Capacidade Vetorial A implicação de uma espécie como vetor de um parasito está ancorada em parâmetros comportamentais da relação inseto/hospedeiro vertebrado/parasito, tais 20

21 como: antropofilia, distribuição geográfica coincidente com da infecção pelo parasito, densidade elevada e competência vetorial. Menos de 10% dos flebotomíneos tem sido incriminados como espécie vetora de Leishmaníase e apenas 30 espécies tem demonstrado ter capacidade vetorial (BATES, 2007). A maioria das espécies de flebotomineos encontrados na natureza não desempenha qualquer papel na transmissão das Leishmaníases. Por diversas razões estas espécies não se alimentam de sangue ou são incapazes de suportar o desenvolvimento de espécies de Leishmania (KILLICK- KENDRICK, 1999; MUNSTERMANN, 2004). Algumas barreiras naturais existentes nos flebotomíneos vão conduzir a resistência ou a suscetibilidade do inseto à infecção por protozoários. Estes fatores determinarão a competência vetorial do inseto, e estão relacionados com a capacidade dos parasitos de resistirem às atividades enzimáticas presentes no intestino do inseto no momento da digestão, escaparem da MP que envolve o bolo alimentar, aderirem ao epitélio no momento da excreção do resto alimentar, completarem o ciclo de vida dentro do inseto vetor e inocularem os parasitos infectantes no hospedeiro vertebrado (LAINSON & RANGEL, 2003) Ciclo de Transmissão No hospedeiro definitivo, após a penetração macrofágica e formação do vacúolo parasitóforo, as promastigotas metacíclicas se diferenciam em amastigotas, multiplicamse por divisão binária, rompem a célula, liberando milhares de amastigotas que serão fagocitadas por novas células. Um vetor ao promover seu repasto neste mamífero ingere as amastigotas, iniciando o ciclo (BRYCESON, 1996; ASHFORD, 2000). As formas amastigotas ingeridas durante o repasto sanguíneo pelo flebotomíneo rapidamente são conduzidas ao intestino médio. Neste local os protozoários escapam das células e após cerca de 12 a 20 horas se diferenciam e se transformam em promastigotas. Estas primeiras formas no inseto são denominadas promastigotas procíclicos. Os procíclicos são formas pequenas, flageladas e ovoides, as quais sofrem intensa multiplicação dentro do bolo alimentar e são envolvidas por um tipo de matriz peritrófica (MP). A MP é uma camada acelular secretada por células que revestem o epitélio intestinal de um grande número de insetos hematófagos. Entre o 2º e o 5º dia após a alimentação os procíclicos começam a se dividir e progressivamente surge uma nova população de promastigotas, as nectomonas. As nectomonas são as formas predominantes dentro do trato digestivo do vetor nos 21

22 primeiros dias de infecção e tem a função de escaparem da MP e aderirem às células do intestino médio na porção abdominal se ligando as microvilosidades do epitélio intestinal (Figura 3). O escape da MP ocorre devido as quitinases liberadas pelo próprio parasito e a adesão celular é proporcionada pela ação do lipofosfoglicano (LPG) uma substância secretada pelo parasito que promove a resistência as enzimas digestivas (SACKS et al., 1984; SCHLEIN et al., 1990; PIMENTA et al., 1994;SARAIVA et al., 1995). Figura 3. Adesão de formas promastigotas de Leishmania sp. nas microvilosidades do intestino médio de flebotomíneo. Fonte: A partir das nectomonas surge uma forma recém identificada, as leptomonas, estas submetem-se a um novo ciclo de multiplicação (ROGERS et al 2002; ROGERS & BATES, 2004). Finalmente, duas formas são observadas na válvula estomodeal, haptomonas e metacíclicos. As haptomonas cujo precursor ainda não está bem esclarecido (nectomonas ou leptomonas) são pequenas com flagelos curtos e imóveis. Os promastigotas metacíclicos possuem forma delgada e longa com o flagelo extenso é altamente ativa e responsável pela continuação do ciclo de vida do parasito (LAINSON & RANGEL, 2003; KAMHAWI, 2006). As formas metacíclicas formam um tampão na válvula estomadeal impedindo o correto bombeamento do sangue estimulando a 22

23 regurgitação das formas metacíclicas presentes nas porções anteriores do intestino (SCHLEIN et al., 1992)(Figura 4). Figura 4. Ciclo de Leishmania spp. em vetor competente Fonte: Kamhawi (2006) O tempo aproximado necessário para que o parasito complete seu desenvolvimento no flebotomíneo é de 6 a 9 dias, dependendo da espécie. Aparentemente, o protozoário é capaz de alterar o comportamento de alimentação dos flebotomíneos para aumentar a eficiência da transmissão (ROGERS & BATES, 2007). Sugere-se que entre 100 e parasitos sejam liberados por um flebótomo infectado durante o repasto sanguíneo (SCHLEIN & WARBURG, 1986; SCHLEIN et al., 1992). Vale ressaltar que o crescimento parasitário só será abundante se, após o repasto sanguíneo infectante, a fêmea vier a alimentar-se de sucos vegetais ou de substâncias açucaradas. Se, em lugar disso, houver nova refeição de sangue, por volta do quarto ou quinto dia, os flagelados degeneram ou a infecção torna-se leve. Assim, será improvável que os parasitos possam ser inoculados em novos hospedeiros pela picada dos insetos (REY, 2008). 23

24 2.6 Medidas de controle O programa de controle adotado no Brasil baseia-se em três principais estratégias: diagnóstico e tratamento adequado dos casos humanos, inquéritos sorológicos com eutanásia dos cães positivos e vigilância entomológica (BRASIL, 2006). O diagnóstico precoce e a rápida instituição do tratamento dos casos humanos são importantes para o indivíduo e a comunidade, pois pacientes não tratados atuam como reservatório e contribuem para a transmissão antroponótica (CHAPPUIS et al., 2007). A prática da eutanásia canina é recomendada a todos os animais sororreagentes. Apesar das evidências de estudos experimentais que demonstraram uma diminuição da incidência de LV em crianças após a triagem sorológica de cães e eutanásia dos animais soropositivos, a eficiência e aceitação dessa estratégia de controle é cada vez mais debatida (ASHFORD et al., 1998; PALATNIK-DE-SOUSA et al., 2001). O tratamento de cães infectados não é uma estratégia de controle eficaz, pois as recaídas são freqüentes e poucos são os casos de cura parasitológica, apesar de estarem clinicamente curados (ALVAR et al., 1994). Além disso, o uso generalizado de medicamentos pode levar a resistência dos parasitos. A vigilância entomológica é importante para ampliar o conhecimento das áreas de ocorrência desses insetos, visto que a compreensão da dinâmica populacional desse grupo pode se revelar como importante fator para a implantação de políticas de controle epidemiológico (MARINHO et al., 2008). O controle químico por meio da utilização de inseticidas de ação residual é a medida de controle vetorial recomendada no âmbito da proteção coletiva. Esta medida é dirigida apenas para regiões consideradas de transmissão moderada e intensa e tem como objetivo evitar e/ou reduzir o contato entre o inseto transmissor e a população humana, conseqüentemente, diminuir o risco de transmissão (BRASIL, 2006). O controle químico é realizado à base de piretróides sintéticos de baixa toxicidade para mamíferos e alta atividade inseticida (AMÓRA et al., 2009). A adoção de tais medidas de controle não tem sido capaz de prevenir a expansão geográfica e a ascensão da incidência e letalidade da LV (DANTAS-TORRES et al., 2006). Assim, perspectivas de controle são dependentes do progresso em pesquisas para obtenção de melhores alternativas e estratégias de gerenciamento dos casos e controle dos vetores (DESJEUX et al., 2004). 24

25 2.7 Biologia molecular como ferramenta epidemiológica A taxa de flebotomíneos naturalmente infectados em áreas endêmicas e a correta identificação da espécie de Leishmania infectando uma determinada espécie de flebotomíneo são de grande importância em estudos epidemiológicos. A infecção de flebotomíneos por Leishmania spp foi mais frequentemente investigada através da dissecação do inseto e observação direta do parasito em seu intestino. Esse procedimento consome tempo e requer grande habilidade técnica, principalmente devido ao tamanho reduzido dos insetos (OLIVEIRA-PEREIRA et al., 2006). Apesar das pequenas diferenças na localização do parasito no tubo digestivo do vetor, estes parasitos assumem formas flageladas indistinguíveis entre as espécies de Leishmania, bem como de outras espécies de flagelados, o que complica a identificação do parasito no vetor (PAIVA, 2009). Além disso, um grande número de amostras devem ser examinadas para a obtenção de dados informativos de cada área, uma vez que a taxa de infecção de flebotomíneos com Leishmania é geralmente muito baixa (0,01-1%) mesmo em áreas endêmicas (HASHIGUCHI, 2001, 2003). Assim, o desenvolvimento de técnicas de biologia molecular, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), possibilitou a identificação de material genético de Leishmania, mesmo em quantidades mínimas como 50fg de DNA do parasito (FU et al., 1998). As principais vantagens dos métodos moleculares são: elevada sensibilidade e especificidade, independente do número, estágio e localização dos parasitos no intestino do inseto (PEREZ et al., 1994) Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) A técnica se baseia na amplificação in vitro de sequências específicas de nucleotídeos presentes no parasito e tem permitido identificar várias espécies, tendo grande valor em estudos envolvendo a detecção de Leishmania spp. em flebotomíneos (PAIVA et al., 2006; GOMES et al., 2008). A utilização dessas técnicas para identificar possíveis vetores das Leishmaníases é uma ferramenta útil em diferentes áreas geográficas (PITA-PEREIRA et al., 2005,PEREZ et al., 2007; PITA-PEREIRA et al., 2008) e tem sido aplicada com sucesso em áreas de estudo sobre competência vetorial de flebotomíneos (RODRIGUÉZ et al., 1999; ARANSAY et al., 2000), mesmo em áreas com baixa taxa de infecção (SILVA & GRUNEWALD, 1999; MIRANDA et al., 2002). 25

26 A PCR reproduz in vitro a habilidade natural de replicação do DNA, podendo ser repetida em larga escala. A metodologia requer o conhecimento parcial do DNA alvo de um determinado organismo, para o desenvolvimento de oligonucleotídeos iniciadores (primers) ou sondas que irão hibridizar-se especificamente à sequencia alvo (YANG & ROTHMAN, 2004). Essas sequências de oligonucleotídeos, conhecidos como primers, delimitam a região a ser amplificada e são selecionados a partir de pequenas unidades de RNA ribossomal, DNA do cinetoplasto ou outras sequências genômicas altamente conservadas do parasito (GRADONI & GRAMICCIA, 2008). Um ciclo de PCR consiste em três fases: desnaturação do DNA molde, ligação dos primers e polimerização do DNA. Na primeira etapa faz-se a separação das cadeias de dupla hélice de DNA através do calor. Esta separação é essencial para que, na segunda fase, dois iniciadores se liguem às sequências dos pares de bases complementares da cadeia molde. Na terceira fase, ocorre a extensão da cadeia e polimerização dos nucleotídeos complementares ao DNA molde, esta amplificação é feita pela Taq DNA polimerase I, uma enzima termoestável. Este processo é então repetido por 25 a 40 ciclos (GLICK, 1998; BROWN, 1999) Embora a PCR convencional seja altamente sensível e específica, apresenta algumas limitações, tais como, a necessidade de realizar a eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, o uso de reagentes nocivos à saúde, como o brometo de etídio e a ausência da capacidade quantitativa. Além disso, os achados dos estudos com PCR convencional mostraram baixas taxas de infecção variando de 0,4% a 3,9% (MARTÍNS-SÁNCHEZ et al., 2006; OLIVEIRA-PEREIRA et al., 2006; PAIVA et al., 2006; SILVA et al., 2008). Estas desvantagens passaram a ser mais evidenciadas no final do século XX e início do século XXI devido ao surgimento de uma nova tecnologia, a PCR em tempo real (qpcr) (CAVALCANTI, 2008) PCR em tempo real (qpcr) A medida que o uso da PCR foi sendo difundido e, consequentemente trazendo avanços não só nos estudos moleculares, como também nas demais áreas onde a técnica era aplicada, se fez necessário seu aprimoramento para que tais limitações fossem superadas. Assim, no início da década de 90 estudos passaram a explorar a atividade exonucleásica da Taq DNA polimerase e a capacidade quantitativa da PCR utilizando o 26

27 brometo de etídio. Tais estudos promoveram um refinamento da PCR convencional e o surgimento da qpcr (HOLLAND et al., 1991; HIGUCHI et al., 1992). Esse sistema é baseado no uso de corantes ou sondas fluorescentes que permitem o monitoramento em tempo real do produto amplificado. A análise da emissão de luz é feita por um detector de sinal luminoso e um amplificador de sinal que traçam um gráfico com a absorção obtida após cada ciclo da qpcr. O ciclo onde o sinal de amplificação exponencial atinge uma intensidade de fluorescência superior ao limiar de detecção (Threshold) é denominado C t e, o momento em que o C t é ultrapassado está diretamente relacionado à quantidade de DNA amplificado (MORTARINO et al., 2004). A qpcr permite a realização de três tipos de ensaio: quantificação absoluta, quantificação relativa e discriminação alélica (APPLIED BIOSYSTEMS, 2001). A quantificação absoluta é utilizada como ferramenta diagnóstica para detecção da infecção e quantificação de seu agente etiológico e baseia-se na análise da curva padrão. A curva padrão relaciona as concentrações de DNA padrão, e é por meio destes dados, ou seja, quantidades conhecidas de DNA, que o software efetua a quantificação do DNA alvo nas amostras em teste (APPLIED BIOSYSTEMS, 2005). A curva padrão fornece o coeficiente angular da reta (slope), composta pelos pontos da curva. O coeficiente angular (S) é importante para o cálculo da eficiência da amplificação (E). Uma eficiência de 100% é obtida com um valor de S de -3,3 e indica que o número de moléculas amplificadas dobra a cada ciclo da PCR (KUBISTA et al., 2006). As características da qpcr possibilitam a eliminação da etapa laboriosa pósamplificação de preparo do gel para eletroforese, convencionalmente necessária para visualização do produto amplificado. Desta forma, pode-se observar que as vantagens da qpcr em relação à PCR convencional são inúmeras e incluem, rapidez na obtenção dos resultados, reprodutibilidade e capacidade quantitativa (CAVALCANTI, 2008; RANASINGHE et al., 2008). Além de permitir o monitoramento em tempo real do produto amplificado, é um método mais sensível e rápido para o diagnóstico da LV podendo ser realizada com uma variedade de amostras biológicas (MORTARINO et al., 2004; VITALE et al., 2004) Esta técnica, inovadora, vem sendo utilizada para estimar a carga parasitária em pools de flebotomíneos, com sensibilidade de até 10 pg de DNA de Leishmania em 27

28 100ng de DNA de flebotomíneos, além de ser capaz de detectar DNA equivalente a 0,004 parasitos (RANASINGHE et al., 2008; BEZERRA-VASCONCELOS et al., 2011). Ranasinghe et al. (2008) evidenciaram o potencial da técnica de qpcr para determinação da carga parasitária de Leishmania em flebotomíneos experimentalmente infectados. Contudo, demonstraram a necessidade de aperfeiçoamento deste método para estudo em flebotomíneos naturalmente infectados. Para aumentar a sensibilidade da qpcr na detecção de L.(L.) infantum chagasi em flebotomíneo, a utilização do kdna para amplificação é o primeiro passo. Além de muito sensível, a mensuração do número de leishmânias presente na amostra é mais exata e precisa do que genes do DNA genômico. A interpretação da carga parasitária em pools de flebotomíneos naturalmente infectados deve ser feita com cautela, pois pode ser diferente em cada fêmea infectada e o nível de infecção individual pode interferir na carga parasitária total do pool (BEZERRA-VASCONCELOS et al., 2011). 28

29 3 JUSTIFICATIVA O desenvolvimento de métodos precisos para identificação de espécies de Leishmania no inseto vetor é crucial para a realização de estudos epidemiológicos e programas de controle. Trabalhos que identifiquem flebotomíneos infectados são importantes para o mapeamento das áreas de risco de transmissão da doença. A PCR em tempo real é atualmente a técnica de maior sensibilidade e especificidade para esse tipo de estudo, além de permitir quantificar a carga parasitária por flebotomíneo. A partir dos dados obtidos pela qpcr é possível identificar as áreas de maior risco na cidade de Fortaleza auxiliando nas medidas de controle. Entretanto, a aplicação da qpcr na detecção de Leishmania spp no vetor ainda é pouco utilizada e por ser uma técnica empregada muito recentemente nessa área, há carência de estudos que evidenciem a distribuição da carga parasitária em flebotomíneos naturalmente infectados. 29

30 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA No município de Fortaleza, estado do Ceará, a carga parasitária de Leishmania infantum chagasi em Lutzomyia longipalpis está igualmente distribuída durante o ano independente da estação do ano e da distribuição do vetor no intra ou peridomicílio. 30

31 5 OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL Contribuir para o controle da Leishmaniase Visceral, por meio do conhecimento da distribuição do agente etiológico da doença em flebotomineos que sabidamente participam da cadeia de transmissão. 5.2 OBJETIVO ESPECÍFICO Avaliar a carga parasitaria de L. infantum chagasi em L. longipalpis capturado em diferentes regiões do município de Fortaleza por meio de qpcr correlacionando com a estação do ano, seca ou chuvosa, e o local de captura do vetor, intra ou peridomicílio. 31

32 6 CAPÍTULO I Quantificação da carga parasitária de Leishmania infantum chagasi em Lutzomyia longipalpis no município de Fortaleza, Ceará, Brasil Parasite load quantification of Leishmania infantum chagasi infection in Lutzomyia longipalpis captured in Fortaleza, State of Ceará, Brazil Periódico: International Journal for Parasitology (Submetido em Junho de 2012). 32

33 Parasite load quantification of Leishmania infantum chagasi infection in Lutzomyia longipalpis captured in Fortaleza, State of Ceará, Brazil Ana Caroline M. Rodrigues a, Rafaella A. Silva a, Luciana M. Melo b, Maria C. S. Luciano b, Claudia M. L. Bevilaqua a, * a Laboratório de Doenças Parasitárias, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Av. Dedé Brasil, 1700, CEP , Fortaleza, CE, Brazil b Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil *Corresponding author. Tel.: ; Fax: address: claudiamlb@yahoo.com.br (C. M. L. Bevilaqua) Laboratório de Doenças Parasitárias, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Av. Dedé Brasil, 1700, CEP , Fortaleza, CE, Brazil 33

34 Abstract Visceral leishmaniasis (VL) has been reported in nearly all states of Brazil, with many reported cases in Ceara State, where the disease is endemic. This study aimed to detect and quantify the natural infection of Lutzomyia longipalpis by real time PCR (qpcr). The sandflies were captured between February 2009 and January 2010 at 22 sites in four regions of the Fortaleza municipality in the Ceará State, Brazil. Two CDC traps were used at each collection point, one inside and one outside the home. The females were grouped in pools of 10 specimens based on region of capture (North, South, East and West), the trap location (indoors or outdoors) and the season of year (dry or wet). For the amplification of L.infantum chagasi DNA, primers targeting kdna and Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase (MTHD) were employed. For the amplification of L. braziliensis DNA, primers targeting RNase III domain gene were employed. The specificity was determined by analyzing the melting curves after each qpcr. The parasite load was measured by absolute quantification. For statistical analysis, the frequency distribution and the chi-square or Fisher's exact test were used. The significance level was 5%, and SPSS V19 was used. The parasite load was analyzed descriptively. Of the 123 pools, 45 were positive for L.infantum chagasi, and the infection rate was 36.5%. The parasite load in the samples ranged from ± to 2,820,246 ± 129, No statistical differences were found with respect to the frequence of sandfly infection between the regions (P=0.3014), season (P=0.3906) or trap location (P=0.8486). Statistical differences were found with respect to the frequence of sandfly infection between the two seasons only at the region West (P=0.0152). The use of qpcr is a technique with high sensitivity and specificity for the detection, identification and quantification of parasites in naturally infected sandflies. The constant presence of infected vectors should alert the community to the possibility of outbreaks of VL in Fortaleza because this species is the primary vector in this state and elsewhere in Brazil. Keywords: Leishmania infantum chagasi, Lutzomyia longipalpis, qpcr, infection rate 34

35 1.Introduction Visceral Leishmaniasis (VL) is a zoonosis caused by protozoa belonging to the complex Leishmania (Leishmania) donovani. Leishmania infantum chagasi is the primary agent responsible for disease in Latin America (Smith et al., 2011). Disease transmission occurs through the bite of female sandflies of the genus Lutzomyia in the New World and the genus Phlebotomus in the Old World. Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva, 1912) is the primary species involved in the transmission of this disease in Brazil (Michalsky et al., 2011). The domestic dog (Canis familiaris) is the main reservoir in urban areas, and the sylvatic reservoirs are foxes (Dusicyon vetulus and Cerdocyon thous), didelphid marsupials and rodents (Rattus rattus and Nectomys squamipes) (Deane, 1958, Barata et al., 2005). VL has been endemic in the state of Ceará since 1930, where cases were reported for the first time. In 2009, 787 cases were reported, with 432 confirmed cases and 16 deaths. The largest number of reported cases was in Fortaleza (194), considered an area of intense transmission according to the Brazilian Ministry of Health. The sandfly fauna of Ceara is composed of 14 species (Deane & Deane, 1957). Silva (2011) recorded the presence of two species of sandflies in Fortaleza, L. longipalpis and Lutzomyia migonei. Determining the rate of infection of sandflies by Leishmania spp is an important tool for epidemiological studies of Leishmaniasis and vector competence (Smith et al., 2010). The classic method used to identify the parasite in the gut of sandflies is the dissection of the digestive tract, followed by direct microscopic examination (Guimarães, 2011). However, a limitation of this technique is the difficulty associated with the processing of a large number of specimens. In addition, this technique requires an experienced technician (Perez et al., 2007). In recent years, molecular methods based on polymerase chain reaction (PCR) have been frequently used in studies for the detection of natural infection, and these PCR-based techniques have increased the sensitivity and specificity of the identification of Leishmania spp., regardless of the number, location and stage of the parasite vector (Perez et al., 1994). Recent studies of natural infection and parasite-host interaction have used real-time PCR (qpcr), a technique capable of quantifying the parasite load and monitoring the amplified products in real time (Gomez-Saladin et al., 2005; Ranasinghe et al., 2008; Bezerra-Vasconcelos et al., 2011). The advantages of qpcr 35