Os avanços nas pesquisas para o desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)

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1 FACULDADE DE AMERICANA CURSO DE BIOMEDICINA JULIANA RIBEIRO BISCASSI Os avanços nas pesquisas para o desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) AMERICANA 2013

2 FACULDADE DE AMERICANA CURSO DE BIOMEDICINA JULIANA RIBEIRO BISCASSI Os avanços nas pesquisas para o desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) Monografia apresentada a Faculdade de Americana como requisito parcial para obtenção do Título de Biomédico. Orientadora: Profa. Dra. Leila Aidar Ugrinovich Coorientadora: Profa. Dra. Patrícia Ucelli Simioni. AMERICANA 2013

3 FICHA CATALOGRÁFICA Elaborada pela Biblioteca Central da FAM por Ana Paula dos Santos Galletta CRB-8/7166 B526a Biscassi, Juliana Ribeiro Os avanços nas pesquisas para o desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) / Juliana Ribeiro Biscassi. -- Americana, f. Orientador: Leila Aidar Ugrinovich. Monografia (Trabalho de Conclusão de Curso) Curso de Biomedicina, Faculdade de Americana. 1. Imunologia. 2. Vacinas terapêuticas. HIV Doenças. I. Ugrinovich, Leila Aidar. II. Título. CDU

4 JULIANA RIBEIRO BISCASSI Os avanços nas pesquisas para o desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) Monografia apresentada a Faculdade de Americana como requisito parcial para obtenção do Título de Biomédico. Área de Concentração: Data da defesa: 09/12/2013 Resultado: Banca Examinadora Nome do Professor: Leila A. Ugrinovich Nome do Professor: Marta S. Baracho Nome do Professor: Rodrigo A. Dalia Titulação: Doutorado Titulação: Doutorado Titulação:Mestrado

5 Existem muitas hipóteses em ciência que estão erradas. Isso é perfeitamente aceitável, elas são a abertura para achar as (Carl Sagan)

6 RESUMO A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, provocada pelo HIV (vírus da imunodeficiência adquirida) é considerada ainda hoje como uma das principais preocupações mundiais na área da saúde humana, por tratar-se de uma doença ainda sem cura e cujo tratamento é de difícil adesão, além de ser mantido por tempo indeterminado. Várias pesquisas vêm sendo realizadas em todo o mundo na tentativa de se desenvolver uma vacina que atue como uma nova forma de terapia para que seja possível controlar a viremia e a progressão para a doença. Busca-se assim uma maior qualidade e expectativa de vida para o portador do HIV. A maior dificuldade no desenvolvimento de uma vacina está na grande capacidade de mutação genética do vírus. Porém, algumas pesquisas tem demostrado que existem proteínas no envelope viral que possuem regiões antigênicas conservadas, mesmo com a constante mutação do vírus. Um dos alvos atuais de estudo e que foi pesquisado neste trabalho é a proteína Tat (Trans-ativador de transcrição), que apresentam resultados promissores em estudos iniciais, principalmente com relação à ativação e aumento da resposta imune humoral. Outra linha de pesquisa visa a produção de vacinas compostas por vários epítopos de proteínas derivadas do HIV, testadas em camundongos. Outra vacina estudada neste trabalho baseia-se na indução de células dendríticas autólogas, melhorando a apresentação do antígeno para o sistema imunológico e aumentando desta forma a resposta imune. Apesar de ainda não se ter uma vacina eficiente e eficaz, as descobertas realizadas até o momento permitem avanços na tecnologia para uma futura vacina. Palavras-chave: HIV, AIDS, Vacina, Proteína Tat e células dendríticas autólogas.

7 Abstract The Acquired Immune Deficiency Syndrome, caused by HIV (human immunodeficiency virus) is still considered one of the major global concerns in human health, due it is a disease with no cure and the treatment is difficult and maintained indefinitely. Several studies have been performed around the world in an attempt to develop vaccines as new forms of therapy to control viremia and disease progress. The biggest difficulty in developing a vaccine is the large mutation capacity of the virus. However, some researchs have shown that there are preserved regions in viral envelope even with virus mutation. One of the current targets in study, is the Tat ( trans - activator of transcription ) protein, which showed promising results in early studies, particularly with respect to activation and by increasing humoral immune response. Some researches aimed to produce vaccines composed of multiple epitopes derived from HIV proteins, tested in mice. Another vaccine studied described in this work is based on the induction of autologous dendritic cells by enhancing antigen presentation to the immune system and thereby increasing the immune response. Despite of the fact that we have not an efficient and effective vaccine, the discoveries made to date advances in technology allow for a future vaccine Key words: HIV, AIDS, Vaccine, Tat protein, Dendritic cell

8 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO OBJETIVO PROBLEMA JUSTIFICATIVA METODOLOGIA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Morfologia Estrutural do HIV TAT (Trans Ativador de Transcrição) Estudos realizados com a utilização da proteína Tat Induções de respostas de linfócitos T Imunização com células dendríticas autólogas CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...26

9 7 1. INTRODUÇÃO O vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Humana (SIDA). Trata-se de um vírus pertencente à família Retroviridae e ao gênero Lentiviridae, sendo constituído de duas moléculas de RNA de fita simples. Atualmente cerca de 34 milhões de pessoas em todo o mundo estão infectadas com o HIV (OMS, 2011). O vírus é dividido em subtipos diferentes, pois se trata de um microrganismo que está constantemente sofrendo mutações (TRABULSI et al., 2005). O HIV-1 é o tipo mais predominante e com maior taxa de mutação, sendo também o mais frequente causador de infecções em todo o mundo. Já o HIV-2 apresenta um índice menor de patogenicidade e transmissibilidade e é encontrado principalmente na África Ocidental, Senegal, Guiné, Gâmbia e Cabo Verde (BRITO, 2011). A infecção das células humanas é mediada pela proteína GP-120, presente no envelope viral. Esta proteína interage com receptores presentes na superfície de algumas células do sistema imune. No linfócito T CD4+, o vírus se fixa no receptor CD4 e no coreceptor CXCR4, já nos macrófagos o vírus se fixa ao co-receptor CCR5. Após essa interação, o vírus penetra na célula hospedeira, liberando seu conteúdo nucleoproteico no citoplasma conforme a Figura 1 demonstra. O RNA é transcrito em DNA e, em seguida, é integrado ao DNA da célula, dando início à produção de novas partículas virais. O sistema imunológico tenta combater a infecção viral, como em qualquer outra infecção, porém a replicação acelerada do vírus ocorre em um curto período de tempo, sobrecarregando assim as defesas do hospedeiro. Além disso, a multiplicação viral destrói as células alvo, diminuindo a quantidade destas células de defesa circulantes (SANTOS et al., 2002). A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) é o último estágio da infecção pelo HIV, que é diagnosticada quando a contagem de células T se encontra abaixo de 200/mm³. Neste estágio o sistema imunológico fica devastado, tornando o infectado totalmente imunossuprimido, incapaz de gerar respostas efetivas contra qualquer microrganismo patogênico que possa se instalar e causar uma infecção (TORTORTA et al., 2005).

10 8 Fig. 1 Infecção do linfócito T pelo HIV Fonte: Peterlin, 2003 A transmissão pelo HIV pode ocorrer tanto através de sangue e fluídos corporais contaminados como através de relações sexuais sem preservativo, à partir do contato com sêmen ou secreção vaginal contaminada, leite materno, infecção de mãe para feto por meio da placenta, agulhas de seringas contaminadas com sangue, transplante de órgãos, inseminação artificial e transfusão de sangue (TORTORA et al., 2005). As recomendações de prevenção compreendem não compartilhar o uso de agulhas e sempre utilizar descartáveis, não praticar promiscuidade, manter relações sexuais sempre de forma protegida através do uso de preservativos masculino ou feminino, circuncisão para homens e realizar o teste para detecção do HIV regularmente (OMS, 2011). O atual e principal método de tratamento para o HIV consiste na administração de antirretrovirais, que são uma combinação de diferentes drogas que têm proporcionado uma maior sobrevida a milhões de pessoas infectadas em todo o mundo, pois atuam no controle e redução da carga viral, desde que não seja interrompido (VIRGIN et al., 2010). A principal

11 9 dificuldade na adesão ao tratamento ocorre devido às alterações no cotidiano do indivíduo, pela rigidez nos horários da administração dos medicamentos, as frequentes consultas médicas para acompanhamento e os diversos efeitos colaterais causados pelos antirretrovirais (SANTOS et al., 2011). Entre esses efeitos destacam-se as náuseas, vômitos, diarreia, eritemas, agitação e insônia, que podem ocorrer logo no início do tratamento, mas que muitas vezes são temporários (BRASIL, 2013). À medida que o tratamento se prolonga, outros danos mais graves podem ocorrer, devido à ação concomitante entre o vírus e o efeito tóxico dos medicamentos, como problemas renais, hepáticos, diabetes, osteoporose, alterações neuropsiquiátricas (insônia, agitação, pesadelos, ansiedade, depressão e dificuldade de concentração), boca seca, feridas na boca, azia, gases, constipação, vômitos, diarreia, febre, suor noturno, dislipidemia, hipertensão arterial e intolerância à glicose (BRASIL, 2013). Devido a isso, várias linhas de pesquisa têm sido desenvolvidas na tentativa de se encontrar uma vacina terapêutica que atue de forma menos agressiva e que não gere dependência, diferentemente do tratamento com antirretrovirais, em que o uso deve ser contínuo e ininterrupto. Portanto, o objetivo desse trabalho foi realizar um levantamento dos dados publicados referentes às pesquisas que buscam o tratamento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, bem como de relatar a eficácia das vacinas em fase de testes.

12 10 2. OBJETIVO No presente trabalho, foi realizado um levantamento bibliográfico referente às novas Linhas de Pesquisa relacionadas ao tratamento/cura dos portadores do vírus HIV, com foco principal nas vacinas em testes clínicos como nova forma de terapia contra o vírus.

13 11 3. PROBLEMA O tratamento atual para a SIDA é agressivo, contínuo e estende-se por tempo indeterminado. O que há em desenvolvimento na atualidade para o controle ou remissão da carga viral, evitando-se desta forma o desenvolvimento da SIDA e uma dependência contínua de medicamentos?

14 12 4. JUSTIFICATIVA Diversas vacinas para o controle da carga viral do HIV estão em avaliação atualmente, em estudos clínicos em fase avançada. Embora notícias sejam divulgadas de forma errônea á população sobre o avanço nas pesquisas, muitos grupos buscam o desenvolvimento de vacinas que atuem de forma menos agressiva, tornando o portador mais independente em relação aos medicamentos atuais e que ainda assim diminua a carga viral de tal forma que impeça a progressão para a SIDA.

15 13 5. METODOLOGIA Para a elaboração deste trabalho foram pesquisados artigos científicos de revistas nacionais e internacionais relacionados ao tema. Foram pesquisados em acervo digital online como Pubmed, Nature Medicine, Plos One, Science Direct e Medline, além de livros de acervo bibliotecário. Para pesquisa mais precisa utilizamos como palavras chaves: HIV-1, vacina HIV, Tat, SIDA e células dendríticas autólogas.

16 14 6. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Desde a década de 80, a SIDA vem alcançando todos os lugares do mundo, todos os dias. O desenvolvimento de uma vacina seria uma das maiores descobertas e que contribuiria muito para a diminuição dos altos índices de contaminação e de morte. Ainda na década de 80, acreditava-se que para o desenvolvimento desta vacina seria apenas uma questão de tempo, o que não aconteceu até hoje (VIRGIN et al., 2010). A produção de uma vacina profilática demonstrou ser de difícil desenvolvimento e sucesso, devido à variação do vírus, que está constantemente sofrendo variação genética. Uma vacina terapêutica seria uma melhor alternativa para os que dependem dos medicamentos, além de ter como objetivo principal o retardo da progressão da doença (NAVIO et al., 2011). Várias são as linhas de pesquisa desta nova terapêutica, atualmente em estudo no mundo todo. Porém, todas ainda se encontram em fase de testes, embora algumas já tenham demonstrado resultados promissores. Cada vacina atua de forma diferente e em locais diversos no vírus, já que o mesmo é considerado de grande potencial mutagênico. 6.1 Morfologia Estrutural do HIV A estrutura do vírus é composta por duas fitas de RNA idênticas, a enzima transcriptase reversa e um envelope formado por fosfolipídeos. (TORTORA et al., 2005). Na face interna do envelope encontra-se uma capa protéica denominada p17, ligada a um ácido conhecido como ácido mirístico, que fornece a matriz para a estrutura viral, além de auxiliar na manutenção da sua integridade e participar de forma essencial na incorporação das proteínas do envelope conforme a Figura 2. No envelope situam-se as glicoproteínas gp41 (proteína transmembrana) e gp120 (proteína de superfície), responsáveis pela ligação do vírus aos receptores das células do sistema imunológico, através de seus sítios de ligação (SANTOS et al., 2002).

17 15 Fig. 2 Estrutura do HIV Fonte: HEMOSC, 2011 O vírus HIV é um vírus que não possui um genoma único, podendo sofrer mutações genéticas em um mesmo indivíduo infectado. Isto ocorre pela replicação acelerada, que leva a erros de transcrição do seu RNA. Um mesmo hospedeiro pode ter vírus com taxas de variação de genomas de aproximadamente 6% até 50%, dependendo da região geográfica que ele se encontrar (SANTOS et al., 2002). A variação na sequencia genômica do vírus torna difícil estabelecer um epítopo que se mantenha invariável, podendo ser reconhecido pelo sistema imune, além de servir como base de estudo para desenvolvimento de uma vacina (SANJUÁN et al., 2013). Por tratar-se de um vírus complexo, o HIV codifica algumas poliproteínas que são essenciais para a infecção. São elas as proteínas Gag, Pol e Env. Além destas, várias proteínas reguladoras são codificadas pelo vírus - Tat, Rev, Vpr, Vpu, Vif e Nef - possuindo essas importante papel na replicação viral, principalmente na síntese de RNA (KUCIAK et al., 2008). O tratamento com antirretrovirais, apesar de controlar a carga viral, não impede o vírus de produzir algumas dessas proteínas como a Tat, a Rev e a Nef (LECOEUR et al., 2012). Algumas dessas proteínas têm sido estudadas na tentativa de obter-se uma nova forma de terapia através de vacina. Nesse sentido, uma proteína que tem despertado grande interesse e até o momento apresentado resultados promissores nos estudos experimentais é a proteína Tat.

18 Tat (Trans-ativador de transcrição) A proteína Tat (Trans-ativador de transcrição) tem sido alvo de vários estudos para servir como base de vacina terapêutica. A Tat é uma proteína que regula a replicação do vírus HIV-1, acelerando o processo de transcrição do DNA na célula hospedeira (BORSETTI et al., 2009). Segundo Chang et al.,1997, apud MONINI et al., 2012, a liberação da Tat acontece no momento em que o vírus infecta as células T e é encontrada no soro de indivíduos infectados e na matriz extracelular do vírus ligada a proteoglicanos. A proteína demonstra ter um importante papel na disseminação da infecção das células, principalmente em macrófagos e células dendríticas, pois atua na inserção de partículas virais nestas células (MONINI et al., 2009), por ser altamente aderente (NAPPI et al., 2009). Atua também como uma toxina extracelular, segundo Gallo, 1999, apud CHEN et al., 2013, além de estar envolvida na patogenia do HIV-1, na demência, doenças degenerativas, sarcoma de Kaposi e apoptose de células (HUERTAS et al., 2010). A Tat é uma proteína que possui uma cadeia polipeptídica com 101 aminoácidos, é codificada pelo gene Tat e constituída por dois éxons. O primeiro éxon codifica a região da Tat que possui de 1 a 72 aminoácidos e é responsável pelas regiões funcionais da proteína. Já o segundo éxon, de 73 a 101 aminoácidos, codifica as regiões responsáveis pela infectividade viral (OPI et al., 2004). A proteína Tat pode ser dividida em seis diferentes regiões: região N- terminal, que é uma região conservada (WENTING et al., 2012), região rica em cisteína que é necessária para a atividade transcricional; região do núcleo que é altamente conservada e está relacionada a apoptose; região básica,essencial para a ligação da Tat com o ativador de transcrição de resposta (TAR); região rica em glutamina relacionada a apoptose mediada por células; e região C-terminal, conforme representado na Figura 3 (HUERTAS et al., 2010). N-terminal Região rica em Núcleo Cisteina Região básica Região rica em C-terminal Glutamina Fig. 3 Ilustração Tat nativa dividida por regiões Fonte: adaptada de CHEN et al.; 2013

19 17 O mecanismo de ação desta proteína é complexo e ainda desconhecido, pois envolve vários elementos e cofatores. Ela estimula a transcrição através da sua interação com o TAR (ativador de transcrição de resposta), que é um elemento localizado no RNA que possui um sítio de ligação com a proteína Tat. (JABLONSKI et al., 2009) para realizar a transcrição de alongamento (LINT et al., 2013). Uma série de mediadores e cofatores virais e celulares atuam em conjunto à Tat ao mesmo tempo e levam ao alongamento eficiente do RNA. (KUCIAK et al., 2009). Em macrófagos não infectados possui um efeito imunossupressor e pode induzir a apoptose de linfócitos. A Tat pode sofrer mutações de até 38% entre um subtipo e outro de HIV sem perder sua função. Existem alguns subtipos de HIV classificados em subtipos A e C que são encontrados mais predominantemente na Índia, América do Sul e África, subtipo B predominante na Europa e América do Norte e subtipo D mais predominante na África (OPI et al., 2004) Estudos realizados com a utilização da proteína Tat Em estudos iniciais, coelhos foram imunizados com peptídeos da proteína Tat derivada do HIV de subtipo B. Alguns destes animais foram infectados com vírus de subtipos A, B e C. Nos animais infectados com subtipos A e C não houve produção de anticorpos com capacidade de reconhecer regiões da proteína do vírus do subtipo B. Com isso os pesquisadores puderam concluir que para a concepção de uma vacina a proteína em sua forma completa, ou seja, 101 aminoácidos é mais efetiva, pois entre os subtipos do vírus há muitas variações que podem afetar o reconhecimento do antígeno. A utilização de apenas um epítopo específico de um subtipo não seria funcional em muitas pessoas, já que existem vários subtipos em todo o mundo (OPI et al., 2004). Em outro estudo realizado na Índia, país que ocupa o segundo lugar em número de indivíduos infectados pelo HIV, foram coletadas 112 amostras de soro de pacientes soropositivos e 150 amostras de soronegativos para a realização de um teste in vitro das reações entre epítopos da proteína Tat com os anticorpos dos pacientes. Foi utilizada a proteína completa e mais uma forma recombinante do subtipo C do vírus para verificar qual destas seria mais imunogênica. Através do método de detecção ELISA, foi possível classificar

20 18 os pacientes soropositivos quanto à presença de anticorpos nas amostras. Foram descritos 14% com anticorpos anti-tat IgM e IgG significativamente elevados e de alta avidez, além de anticorpos anti-gp41. Verificou-se que houve uma moderada reação antígeno-anticorpo com o subtipo A do vírus, baixa com o subtipo B e alta com os subtipos D e seu homólogo C (KASHI et al., 2009). Neste estudo indiano foi possível observar que a utilização da proteína Tat em sua forma completa, ou seja, nativa, devido a grande imunogenicidade correspondente as regiões expressas pelo segundo éxon obteve melhores resultados e que na maior parte das amostras os anticorpos conseguiram neutralizar a proteína Tat de forma eficiente, inibindo sua atividade de trans ativação de 50 a 70% comparado às amostras do grupo controle (KASHI et al., 2009). Outros estudos demonstraram resultados interessantes relacionados à Tat, sugerindo que ela está altamente ligada a não progressão da doença ou a um retardamento da mesma (RICHARDSON, 2003). Foi observado nas amostras de soro de indivíduos infectados que uma pequena parte deles apresentava anticorpos anti-tat e a maioria não apresentava. Os indivíduos anti-tat positivos, principalmente jovens assintomáticos e recém-infectados, demostraram uma resposta imune humoral mais efetiva, sendo que a progressão para a doença ocorria de forma bem mais lenta, levando a um maior tempo de sobrevida, quando comparado aos indivíduos anti-tat negativos (REZZA et al., 2005). A proteína Tat possui regiões imunogênicas que mesmo com a constante mutação do vírus, mantêm-se conservadas (BUTTÒ et al., 2003), o que apoia o conceito de utilizá-la como base para o desenvolvimento de vacinas. Em uma recente pesquisa realizada na China, foram coletadas amostras de sangue de 426 indivíduos, sendo 326 soropositivos e 100 indivíduos saudáveis (controle). Esse ensaio foi realizado in vitro e teve como objetivo caracterizar as respostas dos anticorpos anti-tat em diferentes regiões da proteína Tat para avaliar qual seria a região mais antigênica da proteína e a capacidade de neutralização pelo anticorpo e assim ajudar nos projetos de desenvolvimento de vacinas (CHEN et al., 2013). Foram utilizados os soros dos participantes e os seis peptídeos da Tat recombinantes purificados por meio de coluna de cromatografia de afinidade (LIAO et al., 2012). Dos 326 soropositivos, apenas em 42 (12,9%) deles produziram anticorpos anti-tat naturais. A quantidade de células T CD4 encontradas nos soropositivos homens foi de 437/mL e nas mulheres foi 340/mL. (CHEN et al., 2013).

21 19 Foi verificado neste estudo que os anticorpos anti-tat reconheciam determinadas regiões de acordo com os respectivos aminoácidos na proteína Tat e com eficiência conseguia de certa forma neutralizar a proteína e que uma fração de imunoglobulina G (IgG) presente contribuiu para a neutralização, intensificando assim a resposta imune (CHEN et al., 2013). Os resultados obtidos nesta pesquisa demonstraram que as regiões N e C-terminais da Tat foram as mais imunogênicas por exibirem maior reação antígeno anticorpo com o soro dos participantes. O peptídeo Tat formado pelos aminoácidos de 22 a 100, que continha algumas regiões incluindo a C-terminal, exceto a N-terminal mostrou maior reação, que foi de 45,2%, já os peptídeos Tat formados pelos aminoácidos de 1 a 48 e 1 a 86 que possuíam a região do N-terminal apresentaram reação de 59,5% e 33,3 %, respectivamente (CHEN et al., 2013). Um estudo terapêutico desenvolvido na Itália, em ensaio de fase I em humanos infectados pelo HIV-1, foi realizado utilizando uma vacina com base na proteína Tat combinada com algumas regiões imunogênicas presentes no envelope do vírus. A vacina foi administrada por cinco vezes num período de 48 semanas, através de injeção subcutânea ou intradérmica. Após a vacinação foi observada uma significativa presença de anticorpos anti- Tat funcionais, que é raro em resposta imune natural, além de um aumento de resposta imune de células T-helper 2 (ENSOLI et al., 2008). Houve um aumento também na resposta humoral com alta presença de imunoglobulinas IgM de 17% para 83%, IgA e IgG aumentaram de 11% a 100%. Os maiores picos da presença destas imunoglobulinas foram identificados após a quarta imunização. Respostas celulares incluindo Interferon - -4) e linfoproliferação também foram observadas e tiveram aumentos significativos nos vacinados. Mesmo após as 48 semanas do ensaio, as imunoglobulinas ainda estavam presentes no soro dos indivíduos participantes (ENSOLI et al., 2008). Através destas pesquisas podemos verificar que a proteína Tat apresenta um grande potencial para contribuição no desenvolvimento de vacinas e que deve continuar a ser investigada. Estudos recentes afirmam que vacinas terapêuticas baseadas na proteína Tat são relativamente seguras e tem melhorado a resposta imunológica em pacientes tratados com antirretrovirais (ENSOLI et al., 2010).

22 Induções de respostas de linfócitos T No Brasil, um recente estudo realizado em camundongos, demonstrou eficácia de uma vacina desenvolvida com o objetivo de ampliar a resposta de células T CD4+ para induzir a proliferação de células T CD8+ citotóxicas (MUDD et al., 2012). A vacina, nomeada HIVBr18, era composta por 18 epítopos em conjunto, provenientes de diferentes regiões de algumas proteínas do vírus através de uma sequencia de nucleotídeos codificados para estes epítopos por técnica de DNA recombinante em um vetor viral. As regiões utilizadas foram das proteínas p17, p24, p6, protease, integrase, gp41, gp160, rev, vpr, vif, vpu e nef. Essas proteínas foram selecionadas devido a sua conservação e por serem frequentemente reconhecidas em amostras de indivíduos infectados como importantes imunógenos (ROSA et al., 2011). Os camundongos utilizados na pesquisa foram geneticamente modificados para expressar moléculas de HLA (antígeno leucocitário humano) de classe II humano, para verificar quais os peptídeos do antígeno são mais imunogênicos. Foi relatado anteriormente que os camundongos transgênicos para HLA de classe II podem desenvolver respostas aos epítopos reconhecidos por humanos. Cada camundongo foi modificado para quatro diferentes moléculas de HLA (DR2, DR4, DQ6 e DQ8) que são mais comuns e estão presentes em aproximadamente 50% da população (ROSA et al., 2010). A vacina HIVBr18 conseguiu provocar respostas imunes de linfócitos T nas quatro estirpes dos camundongos transgênicos. Dos 18 epítopos presentes no teste, dezesseis, foram reconhecidos pelas moléculas de HLA de classe II dos camundongos, principalmente DR2, DR4 e DQ6. Foi observada uma maior proliferação de linfócitos T CD4+, dos animais que responderam a onze epítopos da vacina, o que mostra a capacidade desta em provocar a resposta destas células. As respostas de linfócitos T CD8+ foram menores em relação às respostas dos linfócitos T CD4+, porém também reconheceu seis epítopos, ressaltando que cerca de 78% de indivíduos infectados exibem respostas para linfócitos T CD8+,os quais são eliciados por células T CD4+ (RIBEIRO et al., 2010). Sete peptídeos foram capazes de suscitar a secreção de IFN- -se que 80% dos camundongos que expressaram moléculas de HLA DR2, DR4 e DQ6, responderam

23 21 positivamente à vacina, mas os autores acreditam que em humanos as respostas deverão ser maiores e mais eficazes (RIBEIRO et al., 2010). Portadores do HIV que fazem o uso contínuo de terapia antirretroviral conseguem manter a carga viral e o nível de células T CD4+ controladas, isso faz com que tenham uma sobrevida maior e livre de sintomas, assim como pessoas que não fazem uso de antirretrovirais conseguem manter também uma sobrevida por um determinado tempo, pois já foi observado que o sistema imune combate naturalmente o vírus, principalmente através respostas de células T citotóxicas específicas e células T auxiliares. Porém, ao longo do tempo estas respostas vão diminuindo com o aumento constante da replicação do vírus, levando a progressão da doença (CONNOLLY et al., 2008). 6.3 Imunização com células dendríticas autólogas Alguns estudos que utilizam células dendríticas autólogas também têm demonstrado importantes resultados. Estas células dendríticas provenientes do próprio indivíduo infectado são utilizadas para promover apresentação dos antígenos aos linfócitos e assim eliciar respostas mais eficazes contra o vírus através de células T citotóxicas e células T auxiliares (WHITESIDE et al., 2009). Este ensaio já foi realizado em alguns países como Espanha e Estados Unidos, e contou com a participação de 18 indivíduos soropositivos que estavam em tratamento com o uso de antirretrovirais e possuíam carga viral plasmática de 50 a 400 cópias /ml e todos expressavam em suas células dendríticas o HLA A0201 (CONNOLLY et al., 2008). A base desta vacina é a utilização de células dendríticas, por estas transportarem antígenos até os linfócitos e induzirem respostas de células T específicas como ilustrado na Figura 4. Foram utilizadas células dendríticas dos 18 participantes soropositivos. Essas células foram extraídas de cada indivíduo através de um procedimento de leucaférese, através de um equipamento específico e automatizado, e estimuladas com um epítopo para apresentação aos linfócitos. Os epítopos utilizados foram regiões imunogênicas de peptídeos do próprio HIV das proteínas Gag, Pol e Env que possuem um alto grau de conservação. Além dos três peptídeos utilizados também foi incluído um peptídeo do vírus influenza A

24 22 (aminoácidos 56 á 66) devido a ele ser um epítopo já utilizado em outras vacinas estudadas e reconhecido por pessoas que possuem o HLA A0201 (CONNOLLY et al., 2008). Fig. 4 Célula dendrítica apresentando um antígeno ao linfócito T Fonte: UFMG, 2013 A vacina foi administrada em duas doses com um intervalo de três semanas entre elas. Os participantes foram divididos em dois grupos, um grupo com seis pessoas e um grupo com doze pessoas. No grupo de seis pessoas o teste foi realizado com duas doses em um nível baixo com aproximadamente de 1 a 3 milhões de células, e o grupo de doze pessoas recebeu um nível alto, de aproximadamente 5 a 10 milhões de células. Após cada dose administrada foi observado se haveria reações para avaliar a segurança da vacina. As observações ocorreram durante oito semanas, principalmente no primeiro e segundo dia após a administração da vacina. Nas semanas 6, 8 e 12 foram colhidas amostras de sangue para realização de exames imunológicos (WHITESIDE et al., 2009). Não foram observadas reações adversas após a vacinação, apenas um participante apresentou um quadro febril somente no dia seguinte e então foi suspensa a administração da segunda dose a ele. Os outros participantes não apresentaram nenhuma reação ao longo das 8 semanas seguidas e alternadas posteriormente. Isso conferiu à vacina segurança e tolerância à sua composição e o nível da dose mesmo sendo a mais alta (WHITESIDE et al., 2009). Para verificar os resultados obtidos após a administração das duas doses da vacina, foram colhidas amostras de sangue dos participantes em semanas alternadas por três vezes.

25 23 Observou-se que nove participantes responderam a um ou mais peptídeos, doze responderam ao peptídeo do vírus Influenza A e três responderam a todos os peptídeos apresentados, de acordo com a Figura 5. As doses mais altas tiveram um resultado maior, além disso, os níveis de células T CD8+ tiveram um aumento significativo na 6ª semana em alguns dos participantes, assim como, outros tiveram seus níveis tanto de linfócitos como de carga viral controlado, sem nenhum aumento. Em oito participantes houve uma diminuição importante na carga viral plasmática (WHITESIDE et al., 2009) Respostas aos Peptídeos Gag Pol Env Influenza A Todos Peptídeos Fig. 5 Gráfico referente á resposta aos peptídeos. Fonte: adaptado de CONNOLLY et al., 2008 Vários estudos têm sido realizados com a utilização de células dendríticas autólogas na concepção de vacina contra o HIV. Em 2011 na Espanha, outra vacina foi testada em pacientes que não recebiam nenhum tipo de tratamento antirretroviral. Neste ensaio foram administradas três doses da vacina com um intervalo de duas semanas entre as doses. Os participantes foram acompanhados durante 48 semanas e neste período as únicas reações observadas após a vacinação em alguns deles, foram de sintomas de gripe e aumento dos linfonodos, mas que desapareceram após três dias aproximadamente (GARCIA et al., 2013). Houve uma diminuição moderada na carga viral plasmática e respostas fracas específicas para o HIV durante um período de apenas 48 semanas. Diferentemente de um estudo muito parecido realizado por Lu et al em 2004, em que se obteve uma diminuição de

26 24 90% na carga viral durante 1 ano. Os autores acreditam que essa diferença nos resultados entre os dois estudos é que a técnica utilizada na inativação do vírus pode ter prejudicado, pois a técnica de inativação por aquecimento pode comprometer a integridade da estrutura viral. No estudo realizado por Lu et al., 2004, para a inativação do vírus foi utilizado um reagente de oxidação o aldritiol-2, que mostrou melhores resultados, porém não é muito utilizado nos estudos aprovados pelas autoridades reguladoras europeias (GARCIA et al., 2011).

27 25 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS O desenvolvimento de uma vacina terapêutica contra o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é de grande importância para o tratamento dos portadores, que, na maioria dos casos, são dependentes do uso de antirretrovirais, os quais que trazem muitos efeitos colaterais indesejáveis. O presente trabalho demonstra que ainda há muito a ser feito na área da pesquisa e desenvolvimento de tal vacina. Porém, deve-se levar em consideração que, desde que o HIV foi descoberto, tratamentos têm sido desenvolvidos visando prolongar a sobrevida e melhorar a qualidade de vida dos pacientes. Estudos que foram e ainda estão sendo realizados em todo o mundo utilizando novas tecnologias tem ajudado na compreensão de mecanismos do vírus ainda desconhecidos, auxiliando na direção a ser seguida na concepção de vacinas de diferentes composições. Os ensaios realizados, descrito neste trabalho, demonstram que há muitos estudos em andamento para o desenvolvimento de uma vacina. De acordo com as pesquisas descritas neste trabalho, podemos concluir que possíveis vacinas terapêuticas e/ou profiláticas estão em fase de desenvolvimento em diferentes linhas como, através da utilização da proteína trans-ativadora de transcrição (TAT), da indução de respostas de infócitos T com a utilização de dezoito diferentes epítopos do HIV e também através de células dendríticas autólogas. Embora um longo caminho ainda tenha que ser percorrido até que essas possam estar disponíveis. Ainda que até o momento não seja possível obter uma vacina eficaz e eficiente, muitas descobertas relevantes foram realizadas e permitem assim muitos avanços na tecnologia de vacinação para essa síndrome.

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