PRODUÇÃO DE HÍBRIDOS EM ALFAVACA (Ocimum selloi Benth): UMA PLANTA AROMÁTICA, CONDIMENTAR E MEDICINAL

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1 1 PRODUÇÃO DE HÍBRIDOS EM ALFAVACA (Ocimum selloi Benth): UMA PLANTA AROMÁTICA, CONDIMENTAR E MEDICINAL Cláudio Lúcio Fernandes Amaral 1 Vicente Wagner Dias Casali 2 Bruno Portela Brasileiro 3 RESUMO: O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar, por meio de marcadores isoenzimáticos, híbridos de Ocimum selloi Benth oriundos do cruzamento entre dois acessos, quais sejam: acesso A de Nova Friburgo RJ, e acesso B, de Tiradentes MG. Na análise genética foram utilizados os sistemas enzimáticos, esterase, fosfatase ácida, glutamato desidrogenase, glutamato oxaloacetato transaminase, leucina aminopeptidase, peroxidase e xiquimato desidrogenase. Destes, apenas o da esterase se mostrou eficiente na identificação, caracterização e diferenciação das populações e de seus indivíduos. Verificou-se que a distribuição das isoenzimas dos parentais comparada com a prole permitiu confirmar o processo de hibridação. Palavras-chave: Diferenciação; Isoenzimas; Fitomelhoramento. ABSTRACT: The aim of this work was to identify and characterize utilized marked isoenzymatic hybrids of Ocimum selloi Benth from artificial mating between two access: ( A ) the Nova Friburgo RJ germplasm and ( B ) the Tiradentes MG germplasm. The following enzymatic systems were used: esterase, acid phosphatase, glutamate dehydrogenase, glutamate oxaloacetate transaminase, leucine aminopeptidase, peroxidase and shikimate dehydrogenase. Only the systems esterase showed efficiency in identifying, characterizing and differentiating both access, and their respective hybrids. Key-words: Differentiation; Isozymes; Crop Breeding. 1 Doutor em Genética Universidade Federal de Viçosa. Professor da Faculdade de Tecnologia e Ciências Jéquie e da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia. clamaral.jeq@ftc.br 2 Doutor em Genética e Melhoramento - Purdue University. Professor titular da Universidade Federal de Viçosa. vwcasali@ufv.br 3 Discente do Curso de Ciências Biológicas, com ênfase em Genética. Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB) - Campus de Jequié-BA. brunobiogene@hotmail.com

2 2 1 Introdução O Brasil apresenta uma das maiores biodiversidades vegetais da Terra e, pelo menos, a metade das espécies vegetais pode apresentar alguma propriedade terapêutica útil à população, mas nem uma parte ínfima dessas plantas foi ainda estudada (MARTINS et al., 1994), principalmente, no que se refere à sua variabilidade genética. Entre as plantas medicinais de grande importância encontra-se a alfavaca (Ocimum selloi Benth), planta da Família Lamiaceae, que ocorre, principalmente, nas regiões Sudeste e Nordeste do País, apresentando propriedades aromáticas, condimentares e medicinais (AMARAL et al., 1999). O processo de hibridação é uma ferramenta importante em programas de melhoramento genético, sendo fundamental para o desenvolvimento de novas variedades, pois possibilita o aumento do vigor híbrido, pela ocorrência de novas combinações de genes codificadores de caracteres de interesse agronômico (ALLARD, 1971; BORÉM, 1999; PATERNIANI, 2001). Este estudo teve como principal objetivo identificar e caracterizar, por meio de marcadores isoenzimáticos, híbridos de Ocimum selloi Benth oriundos do cruzamento entre dois acessos do Banco de Germoplasma de Plantas Medicinais da Universidade Federal de Viçosa, Brasil, quais sejam: acesso A, de Nova Friburgo RJ, e acesso B, de Tiradentes MG. 2 Material e Métodos 2.1 Material vegetal Foram utilizadas 123 plantas, 48 por acesso e 27 indivíduos obtidos por meio de sementes provenientes de cruzamento artificial. As plantas do acesso A foram coletadas em Nova Friburgo RJ e as plantas do acesso B, em Tiradentes MG. Cada planta de ambos os acessos e os produtos do cruzamento entre estes foram propagados assexuadamente, por meio de uma estaca colocada em um copo plástico de 200ml, preenchido por substrato constituído de areia, solo e esterco, na proporção de 1:1:1 e, posteriormente, mantido ao ar livre. Os parentais e a prole foram levados ao laboratório de preparo, onde suas folhas e raízes foram retiradas.

3 3 2.2 Extração das amostras Na coleta das amostras, retirou-se, pela manhã, com o auxílio de uma tesoura, uma folha nova de cada planta amostrada. Além das folhas, utilizaram-se ainda raízes, sendo estas lavadas e suas extremidades cortadas e pesadas, de maneira a padronizar a quantidade de amostras usadas nas análises genéticas. As amostras obtidas das folhas foram destinadas à análise eletroforética dos seguintes sistemas isoenzimáticos: álcool desidrogenase, esterase, fosfatase ácida, glutamato desidrogenase, glutamato oxaloacetato transaminase, isocitrato desidrogenase, leucina aminopeptidase, malato desidrogenase e xiquimato desidrogenase. Já as amostras obtidas das raízes foram utilizadas para a análise eletroforética de fosfatase ácida, glutamato oxaloacetato transaminase, malato desidrogenase e peroxidase. A solução extratora usada foi a de Alfenas et al. (1991). Com o objetivo de ajustar a metodologia, efetuaram-se vários testes preliminares, procurando determinar, em cada sistema isoenzimático, as combinações adequadas de ph dos tampões do gel e dos eletrodos e os procedimentos apropriados de coloração. Portanto, como sistemas-tampão gel-eletrodo utilizou-se o sugerido por Shaw & Prasad (1970) para as enzimas: fosfatase ácida, glutamato desidrogenase, glutamato oxaloacetato transaminase, malato desidrogenase e peroxidase e o indicado por Soltis et al. (1983) para as enzimas: álcool desidrogenase, esterase, isocitrato desidrogenase, leucina aminopeptidase e xiquimato desidrogenase. Os protocolos para revelação da atividade enzimática de álcool desidrogenase, fosfatase ácida, isocitrato desidrogenase, malato desidrogenase foram os indicados por Shaw & Prasad (1970) e de esterase, glutamato desidrogenase, glutamato oxaloacetato transaminase, leucina aminopeptidase, peroxidase e xiquimato desidrogenase os protocolos sugeridos por Soltis et al. (1983). 2.3 Análises genéticas Foi utilizada a técnica de eletroforese horizontal em gel de amido. Sendo utilizado amido nacional (amido de milho ou Maizena ) e amido hidrolisado ( Sigma S4501), para fins de

4 4 comparação. Ambos os géis de amido foram preparados, a 12%, com 42g de amido, adicionados a 350ml de solução-tampão (CONKLE et al., 1982). 2.4 Detecção dos sistemas enzimáticos No sistema enzimático peroxidase, as bandejas refratárias foram colocadas em câmara fria a 4 C até o aparecimento das bandas isoenzimáticas. Já nos sistemas enzimáticos álcool desidrogenase, esterase, fosfatase ácida, glutamato desidrogenase, glutamato oxaloacetato transaminase, isocitrato desidrogenase, leucina aminopeptidase, malato desidrogenase e xiquimato desidrogenase, as bandejas refratárias foram colocadas em estufa a 37 C, no escuro, até o aparecimento das bandas isoenzimáticas. 2.5 Secagem dos géis Após a coloração, o excesso de solução corante (SHAW & PRASAD, 1970; SOLTIS et al., 1983) foi retirado sob água corrente, submetendo-se, posteriormente, cada fatia de gel à fixação (glicerina 50% na peroxidase e 10% nas demais enzimas, por cerca de 12 horas à temperatura de 4ºC). Após a fixação, cada fatia de gel pôde ser trabalhada na tomada de dados ou, então, desidratada para posterior catalogação. O gel foi desidratado entre duas folhas de papel celofane poroso. 2.6 Numeração das bandas nos géis Na interpretação das bandas, os géis foram colocados justapostos sobre a superfície de um diafanoscópio e, mediante o uso de uma régua graduada em milímetros, foi medida a distância percorrida pelas bandas, transcrevendo-as num papel milimetrado, com base nas suas mobilidades relativas. A mobilidade relativa foi calculada pela razão entre a distância de cada banda até a origem (posição de inserção das amostras no gel) e a distância percorrida por uma banda particular, preferencialmente a mais anódica (+), presente em todas as populações. As freqüências dos

5 5 padrões das bandas isoenzimáticas foram obtidas pela relação número de indivíduos por padrão específico de bandas isoenzimáticas/número total de indivíduos por população amostrada. 3 Resultados e Discussão 3.1 Comparação da eficiência de uso dos géis Na técnica de eletroforese horizontal em gel, o amido nacional (amido de milho ou Maizena ) apresentou melhor resultado na visualização das bandas isoenzimáticas, se comparado ao amido hidrolisado ( Sigma S4501). Além disso, o primeiro é mais barato, sendo de fácil obtenção quando comparado ao segundo, que, às vezes, deve ser importado, portanto, demorado para ser adquirido. 3.2 Esterase O sistema esterase apresentou atividade isoenzimática anódica, nos tecidos foliar e radicular; entretanto, a baixa resolução de bandas isoenzimáticas da raiz inviabilizou sua utilização nas análises fenotípicas. Este sistema foi útil como marcador para demonstrar a ocorrência de hibridação, em decorrência da presença de indíviduos ( C ) com o padrão 3 (Geração Filial F 1 ), oriundo do cruzamento artificial entre indivíduos do acesso A com o padrão 1 (Geração Parental P 1 ) e os do acesso B com o padrão 2 (Geração Parental P 2 ) (Figura 1). [+] [-] Mr EST (folha) Padrõe A B C Indivíduos Figura 1: Zimograma do sistema isoenzimático: esterase (EST) em tecidos foliar de acessos ( A e B ) e de seus híbridos ( C ) de alfavaca (O. selloi Benth), com mobilidade relativa (Mr) e padrões de bandas isoenzimáticas (1, 2, 3).

6 6 De acordo com Almeida et al. (2004), espécies do gênero Ocimum, são autocompatíveis, portanto, cruzamentos intra-específicos podem ser utilizados no desenvolvimento de novas variedades, pois a hibridação possibilita a manutenção ou o aumento da heterose das espécies pela ocorrência de novas combinações de genes codificadores de caracteres de interesse agronômico (BORÉM, 1999), como, por exemplo, a produção de óleos essenciais, que, por serem amplamente utilizados pelas indústrias farmacêuticas, têm alto valor no mercado nacional e internacional (NATION et al., 1992). Com relação à composição e ao conteúdo de moléculas terapêuticas, encontram-se, normamelmente, altas herdabilidades para estas substâncias, o que facilita o melhoramento por seleção, entretanto, com relação à diversidade estrutural e funcional dos fitofármacos, os híbridos podem apresentar características inéditas às dos parentais (AMARAL; SILVA, 2003). 3.3 Demais sistemas isoenzimáticos Os sistemas isoenzimáticos fosfatase ácida, glutamato desidrogenase, glutamato oxaloacetato transaminase, leucina aminopeptidase, peroxidase e xiquimato desidrogenase não se mostraram eficientes na identificação, caracterização e diferenciação dos acessos e seus respectivos híbridos. Referências ALLARD, R. W. Sistemas reprodutivos e métodos de melhoramento de plantas. In. Princípios do melhoramento genético de plantas. Rio de Janeiro: Edgard Blucher, cap. 4, p ALFENAS, A. C. et al. Eletroforese de proteínas e isoenzimas de fungos e essências florestais. Viçosa: UFV, p. ALMEIDA, O. S.; SILVA, A. H. B.; SILVA, A. B.; SILVA, A. B.; AMARAL, C. L. F. Estudo da biologia floral e mecanismos reprodutivos do alfavacão (Ocimum officinalis L.) visando o melhoramento genético. Acta Scientiarum. Maringá, v. 26, n. 3, p , set

7 7 AMARAL, C. L. F.; ALMEIDA, E. C.; CASALI, V. W. D. Biologia floral e mecanismos de reprodução da alfavaca (Ocimum selloi Benth). Revista da Sociedade Brasileira de Olericultura, v. 1, p. 1-11, nov AMARAL, C. L. F.; SILVA, A. B. Melhoramento Biotecnológico de Plantas Medicinais. REVISTA BIOTECNOLOGIA CIÊNCIA E DESENVOLVIMENTO, v. 30, n. 1, p , jan/jun BORÉM, A. Hibridação Artificial de Plantas. Viçosa: UFV, p. CONKLE, M. T. et al. Starch gel electrophoresis of conifer seeds: a laboratory manual. Berkerley: USDA, Forest Service, Genetics technical reports, PSW-64, p. MARTINS, E. R. et al. Plantas medicinais. Viçosa: UFV, p. NATION, G. R. et al. Estimation of outcrossing in basil. HortScience, Alexandria, v. 27, n. 11, p , Feb PATERNIANI, M. E. A. G. Z. Use of Heterosis in Maize Breeding: History, Methods and Perspectives A Review. Crop Breeding and Applied Biotechnology, v. 1, n. 2, p , Feb SHAW, C. R.; PRASAD, R. Starch gel electrophoresis of enzymes - a compilation of recipes. Biochemical Genetics, New York, USA, v. 4, n. 2, p , Nov SOLTIS, D. E.; HAUFLER, C. H.; DARROW, D. C.; GASTONY, G. J. Starch gel electrophoresis of ferns: a compilation of grinding buffers, gel and eletrode buffers and staining schedules. American Fern Journal, Washington, D.C. USA, v. 73, n. 1, p. 9-27, Jan Agradecimentos Ao Departamento de Fitotecnia (DFT) da Universidade Federal de Viçosa (UFV), pelo apoio na execução deste projeto ao Grupo Entre Folhas - Plantas Medicinais por ter fornecido o material vegetal utilizado neste trabalho; aos Grupos Plantgen e Plantmed e ao CNPq, pela bolsa de pesquisa. À Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB), Faculdade de Tecnologia e Ciências (FTC) e aos Grupos de pesquisa PLANTGEN (UESB) e PLANTMED (FTC).