METODOLOGIA PARA OBTENÇÃO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS: ESTUDO PRELIMINAR

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1 Revista Eletrônica Novo Enfoque, ano 2012, v. 15, edição especial, p METODOLOGIA PARA OBTENÇÃO DO PLASMA RICO EM PLAQUETAS: ESTUDO PRELIMINAR ALVES, Silvia Beatriz Carneiro Rodrigues 1 MONTEIRO, Marina Príncipe Guilhem PIRES, Natália Rebouças SANTOS, Aline Vieira Pinheiro dos Palavras-chave: Eqüino. Plasma. Plaquetas Problemática O plasma rico em plaquetas (PRP) é um preparado derivado de sangue total e tem como característica conter uma gama de fatores de crescimento. Tais fatores são reconhecidos por estimularem a proliferação celular e colaborar com cicatrização de diversos tecidos. Apesar da utilização do PRP ser promissora, a metodologia para sua obtenção tem se mostrado bastante controvertida, havendo dezenas de protocolos. Este estudo preliminar visa a primeira etapa da busca de uma metodologia que seja reprodutível e alta eficácia em termos de obtenção de alta concentração plaquetária. O gel de plasma rico em plaquetas (PRP) surgiu em 1997, através de estudos dos processos de obtenção de cola de fibrina (VENDRAMIN, 2009). Sendo técnica vantajosa no sentido do mesmo ser oriundo do próprio paciente, tornando-se livre de toxicidade e incapaz de gerar imunorreação (GARCIA, 2005), que combinado à liberação dos fatores de crescimento, acelera o processo de reepitelização, angiogênese, síntese de colágeno, quimiotaxia dos neutrófilos, macrófagos e fibroblastos (SILVA, 2010). Este gel apresenta propriedades adesivas, hemostáticas e cicatrizantes e tem sido utilizado em procedimentos cirúrgicos por dentistas, ortopedistas, neurocirurgiões e cirurgiões plásticos (VENDRAMIN, 2009). 1 Aluna do PIBIC&T do curso de Medicina Veterinária da Universidade Castelo Branco. bia.triz@ig.com.br Avenida Brasil, 9727 Penha Rio de Janeiro / RJ. 2 Aluna do PIBIC&T do curso de Medicina Veterinária da Universidade Castelo Branco. marina_pguilhem@yahoo.com.br. 3 Médica Veterinária e professora da Universidade Castelo Branco. nreboucas@infolink.com.br. 4 Médica Veterinária e professora da Universidade Castelo Branco. vetvieira2004@hotmail.com.

2 As plaquetas são fragmentos citoplasmáticos, anucleados, discoides, derivados dos megacariócitos. Possuem cerca de 5 a 7µm de diâmetro e, normalmente, largura inferior a 3µm. Nos equinos, as plaquetas são lentiformes, podendo alcançar 20µm de diâmetro (MAIA, 2009). As respostas plaquetárias são iniciadas quando uma lesão tissular é produzida, disparando uma forte interação celular (CARMONA, 2011) e apresentando importante função no processo de coagulação do sangue (MAIA, 2009). O PRP é fonte autógena de fatores de crescimento, obtida pelo sequestro e concentração de plaquetas por gradiente de densidade por meio de centrifugação a fim de produzir uma alta concentração de plaquetária em pequeno volume de plasma (VENDRAMIN, 2009). Este hemocomponente é capaz de liberar, conhecidamente, sete fatores de crescimento, sendo eles: fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento transformante beta 1 (TGF-β1), TGF-β2, fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento insulínico tipo I (IGF-1) e fator de crescimento de hepatócitos (HGF) (CARMONA, 2011). Nos protocolos para obtenção do PRP a primeira centrifugação separa as células vermelhas (7µm de diâmetro) e brancas (7-15µm de diâmetro) das plaquetas (2µm de diâmetro) devido à diferença de densidade. Na segunda centrifugação ocorre a concentração das plaquetas, produzindo o PRP e o PPP (plasma pobre em plaquetas) (VENDRUSCOLO, 2012). Todavia, sabe-se que o processo de centrifugação tem que seguir algumas regras para obtenção de material de qualidade e eficiência. O processo deve ser estéril e preciso, para a obtenção da separação dos componentes sanguíneos em alta concentração, sem provocar a lise das plaquetas ou danificá-las, pois uma vez que isso aconteça, perderão a atividade de secretar os fatores de crescimento e, com isso, seu objetivo principal (GARCIA, 2005). Assim como a manipulação do sangue durante a centrifugação deve ser realizada de forma cuidadosa e em rotação adequada assegurando a separação das células plaquetárias de outras e para evitar ruptura ou danos à sua membrana (PAGLIOSA, 2007). O objetivo do presente estudo foi reproduzir com equipamentos simplificados e de baixo custo uma metodologia para a obtenção do PRP, visto que os trabalhos existentes na literatura apresentam uma grande variação na metodologia do seu preparo e nem todos alcançam as mesmas concentrações plaquetárias

3 Procedimentos Metodológicos Foram utilizados dois equinos, um macho castrado e uma fêmea, mestiços, com média de idade de 8 anos, hígidos, vacinados, vermifugados, selecionados mediante exame clínico e hematológico prévio e alojados no Hospital de Grandes Animais do Campus de Medicina Veterinária da Universidade Castelo Branco Rio de Janeiro. As coletas foram realizadas em 10 ensaios com intervalo de tempo entre elas de 15 dias. Em cada ensaio foram coletados seis tubos contendo anticoagulante citrato de sódio 3,2% com capacidade para 4,5mL de sangue, totalizando 27 ml por ensaio. O anticoagulante de eleição foi o citrato de sódio por ter característica de preservar integridade da membrana das plaquetas. Simultaneamente, foi coletado tubo com anticoagulante EDTA para avaliação de hemograma e contagem inicial das plaquetas. As amostras foram acondicionadas e transportadas em isopor com gelo até o Laboratório de Patologia Clínica da Universidade Castelo Branco. Foi utilizada a centrífuga Quimis (modelo Q-222T18/28), na qual os tubos foram submetidos a duas centrifugações. Para a contagem inicial de plaquetas, utilizou-se o contador automático de células ABC Vet. Foram testados seis protocolos utilizando diferentes variáveis (Quadro1), sendo um deles previamente descritos por Carmona (2007) e os seguintes com pequenas modificações do mesmo (Quadro2). Quadro 1: Diferentes velocidades (rpm) utilizadas nos protocolos. PROTOCOLO 1ª 2ª TEMPO CENTRIFUGAÇÃO CENTRIFUGAÇÃO (MINUTOS) (rpm) (rpm)

4 78 Quadro 2: Resultados da contagem manual de plaquetas/mm 3 para a obtenção do PRP. PROTOCOLO TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7 TUBO 8 MÉDIA 79 1 DIA DIA DIA DIA DIA DIA DIA DIA DIA DIA Para quantificar plaquetas foi escolhida a contagem manual em câmara hematimétrica de Neubauer, utilizando líquido de Brecher (oxalato de amônia 1%), visto que, segundo a literatura, contadores automáticos podem identificar agregados de plaquetas como uma única célula. Considera-se como melhor protocolo o que obtiver maior concentração plaquetária após as centrifugações Análise de dados Na avaliação hematológica dos animais observou-se que os mesmos apresentaram-se dentro da normalidade, no que diz respeito à contagem de plaquetas, durante todo experimento, mostrando apenas pequenas alterações em relação à hematimetria, conforme demonstrado no Quadro 3. Quadro 3: Avaliação hematológica, sendo contados Ht: Hematocrito; Plaq: Plaquetas; WBC: células brancas; RBC: celulas vermelhas; HGB: hemoglobina Ht (32,0-47,0) PLAQ ( ) WBC (5,2-13,9) RBC (6,4-10,0) HGB (11,0-17,0) DIA 1 29, ,5 6,1 10,4 DIA 2 27, ,2 5,75 9,6 DIA 3 28, ,9 5,94 10 DIA 4 32, ,9 6,74 10,8 DIA 5 27, ,3 5,72 9,3 DIA 6 34, ,5 7,2 11,6 DIA DIA 8 37, ,1 8,94 12,8 DIA 9 33,4-8,8 8,05 11,8 DIA 10 29, ,1 5,89 9,7 86

5 Os resultados revelaram contagens das plaquetas muito diversas nos protocolos testados, sendo mais regulares os protocolos reproduzidos nos ensaios 1, 4, 5 e 6. A quantidade de plaquetas obtidas nestes variou entre e plaquetas/mm 3, de acordo com os diferentes protocolos, quando o 6 mostrou-se mais eficiente, conforme ilustrado no Quadro Discussão de Resultados Os benefícios da utilização do PRP na injúria tissular são de grande interesse na medicina veterinária, entretanto a técnica para o seu preparo ainda vem sendo discutida e observa-se uma infinidade de protocolos pesquisados nos últimos tempos. Durante o desenvolvimento deste trabalho, foi observado que forças de centrifugação mais baixas à integridade plaquetária foram mais preservadas enquanto nas mais altas não se obteve concentrações satisfatoriamente elevadas, provavelmente devido à formação de pellets no fundo do tubo. Maia (2009) também fez observação semelhante em seu estudo. Em relação ao tempo de centrifugação, não se pôde observar influência na concentração das plaquetas, conforme demostra quadro 1. Tal resultado também foi descrito por Rutkowski (2008). Os resultados serão avaliados estatisticamente na segunda etapa deste estudo. As maiores concentrações plaquetárias, nessa pesquisa, foram alcançadas quando a metodologia empregada utilizou plasma em conjunto com botão eritrocitário na primeira centrifugação e apenas plasma na segunda. De acordo com Woodell-May (2008), o PRP ideal não deve conter eritrócitos uma vez que essas células podem potencializar a fisiologia da resposta pró-inflamatória no local da injúria através da ativação de receptores de adesão de outras células do sistema imune, e a secreção de quimiosinas e citocinas que vão promover a diferenciação celular,. O PRP ideal deve conter entre três a cinco vezes mais plaquetas que os níveis fisiológicos (MARX, 1998), porém, no presente estudo, ainda não foi possível obter essa concentração utilizando-se a metodologia e equipantes supracitados

6 Considerações Finais Há necessidade de adequação da metodologia para obtenção do PRP a fim tornar possível ao clínico veterinário a utilização desta técnica tão promissora em seu dia a dia, com equipamentos simples e baixo custo em relação às técnicas anteriormente descritas. O presente experimento confirmou ser difícil a reprodução das técnicas descritas para a obtenção de PRP, corroborando a ideia da necessidade de padronizar uma metodologia de fácil execução e alta reprodutibilidade. A utilização do PRP para se obter altas concentrações de fatores de crescimento para reparação tecidual já é de conhecimento da comunidade científica no âmbito da medicina veterinária. Para tanto, torna-se fundamental dominar a técnica de obtenção do material a fim de se ampliar sua utilização no universo da clínica e cirurgia veterinária. A segunda etapa desse estudo tem o intuito de descrever uma metodologia que alcance este escopo Referências CARMONA, J. U.; LÓPEZ, C.; GIRALDO, C. E. Uso de concentrados autólogos de plaquetas como terapia regenerativa de enfermidades crônicas del aparato musculoesquelético eqüino. Archivos de Medicina Veterinária, vol 43, p 1-10, CARMONA, J. U et al. Autologous platelet concentrates as a treatment of horses with osteoarthritis: a preliminary pilot clinical study. Journal Equine Veterinary Science, vol 27, n 4, p , GARCIA, R. L. L et al. Plasma rico em plaquetas: uma revisão de literatura. Revista Brasileira Implantodont Prótese Implant, vol 12, n 47-48, p , MAIA, L.; SOUZA, M. V. Componentes ricos em plaquetas na reparação de afecções tendo - ligamentosas e osteo-articulares em animais. Ciência Rural, Santa Maria, vol 39, n 4, p , jul, MAIA, L. et al. Platelet-rich plasma in the treatment of induced tenopathy in horses:histologic Evaluation.. Journal Equine Veterinary Science, vol 29, n 8, p , MARX, R. E.Platelet concentrate: a strategy dor accelerating and improving bone regeneration. In: DAVIES J. E., BONE ENGINEERING, Toronto: University of Toronto, 2000b, p

7 MARX, R. E et al. Platelet-rich plasma: growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surgery Oral Medicine Oral Pathology, vol 85, n 6, p , PAGLIOSA, G. M.; ALVES, G. E. S. Considerações sobre a obtenção e o uso do plasma rico em plaquetas e das células mesenquimais indiferenciadas em enxertos ósseos. Ciência Rural, Santa Maria, vol 37, n 4, p , jul-ago, SILVA, A. L. G. et al. Possibilidade de utilização do plasma rico em plaquetas (PRP) autólogo para tratamento de feridas cutâneas crônicas. Revista Paraense de Medicina, vol. 24, n. 3/4, juldez, RUTKOWSKI, J. L. et al. An analysis of a rapid, simple, an inexpensive techinque used to obtain platelet-rich plasma for use in clinical pratice. Journal Oral Implant, vol 34, n 1, p 25-33, TRINDADE-SUEDAM, I. K. et al. Avoiding leukocyte contamination and early platelet activation in platelet-rich plasma. Journal Oral Implant, vol 33, p , VENDRAMIN, F. S.; FRANCO, D.; FRANCO, T. R. Método de obtenção do gel de plasma rico em plaquetas autólogo. Revista Brasileira de Cirurgia Plástica, vol 24, n 2, p 212-8, WOODELL-MAY, J. E.; PIETRZAK, W. S. Platelet-rich plasma in orthopedics. In: ORTHOPEDIC BIOLOGY AND MEDICINE: MUSCULOSKELETAL TISSUE REGENERATION, BIOLOGICAL MATERIALS AND METHODS, Totowa: Hamana Press, 2008, p