04/06/2012 PATOLOGIA. Imunofluorescência. O que é Imunohistoquímica: Impacto como Marcador Prognóstico

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1 PATOLOGIA O que é Imunohistoquímica: Impacto como Marcador Prognóstico Vera Luiza Capelozzi Departamento de Patologia Faculdade de Medicina - Universidade de São Paulo Brazil Imunofluorescência Técnica precursora IHQ: reações antígeno-anticorpo Tecido fresco congelado, microscópio especial, pobre definição morfológica Anos 80-90: IHQ aplicação ampla na Patologia Cirúrgica Detecção mais sensível: Acs monoclonais altamente específicos, idênticos e em abundância Cortes inicialmente congelados: fixação em formalina e embebição em parafina IHQ: Tipos de Anticorpos Monoclonais e policlonais monoclonais: mais específicos policlonais: reconhecem diversos epítopos injeção de um antígeno peptídico em animais após a estimulação de resposta imune secundária isolamento dos anticorpos a partir do soro Primários e secundários primários: antígeno de interesse e são não-marcados anticorpos secundários produzidos contra anticorpos primários reconhecem IGs de uma espécie particular e são conjugados : biotina, fosfatase alcalina, peroxidase, Flúor Alexa ou Fluor DyLight 1

2 IHQ: Preparação das Amostras Cortes: finos 4μm, micrótomo lâminas Controles padronização processamento e fixação Controles internos : tecido (ou células) da mesma secção secção do mesmo espécime da paciente Controles externos : tecidos (ou linhas de células) de outras fontes células negativas e outras positivas de expressão do antígeno em questão IHQ: Direta e Indireta Direto (one-step) anticorpo marcado (e.g. Isotiocianato de Fluoresceína -FITC) conjugado reage diretamente com o antígeno no tecido simples e rápido baixa sensibilidade: pequena amplificação de sinal Ac primário não-marcado (primeira camada) + Agdo tecido + Ac secundário marcado (segunda camada) contra IgG da espécie animal na qual Ac primário foi produzido segunda camada Ac marcada com corante fluorescente ou enzima Método mais sensível: amplificação maior: reações Acsecundários com diferentes sítios antigênicos do Ac primário Número pequeno de Ac secundários conjugados (marcados) gerado Ex: Acsecundário marcado produzido contra IgGde coelho (comprado sem encomenda) reage com qualquer Acprimário produzido em coelhos Método direto: produzir Acsmarcados customizados contra cada antígeno de interesse 2

3 HE & IHQ IHQ: Indicações na Patologia Cirúrgica tecido de origem de uma neoplasia indiferenciada órgão de origem de uma neoplasia diferenciada subtipagem de neoplasias (linfomas) fatores prognósticos, terapêuticos e índices proliferativos (por exemplo, hormônios) identificação de estruturas, organismos e materiais secretados pelas células detecção de células neoplásicas metastáticas diferenciação proliferação celular maligna e benigna IHQ: Marcadores diagnósticos técnica excelente de detecção: local exato da proteína no tecido maior desvantagem ao contrário do immunoblotting: coloração checada contra um peso molecular impossível mostrar que a coloração corresponde à proteína de interesse Acs primários devem validados por Western Blot 3

4 Pan Citoqueratina: celulares epiteliais e todos carcinomas; alguns sarcomas CD45 (LCA): marcador de leucócitos; HMB45: marcador de melanoma e nevos azul, de Spitz e juncional, angiomiolipoma; S100: células gliais e de Schwann, melanócitos, células de Langerhans e células reticulares interdigitantes Vimentina: marcador de células de origem mesenquimal (sarcomas); Actina: leiomiossarcoma(positivo), câncer papilar de mama (negativo) e outros; Alfafetoproteína(AFP): tumores de células germinativas (seio endodérmico) e carcinoma hepatocelular; BCL-2: linfoma folicular x hiperplasia reacional, subtipos de linfomas, carcinomas e sarcomas; CA 125: ovário, vesícula seminal, colo uterino, endométrio, trato gastrintestinal, tireóide e mama; Antígeno prostático específico (PSA): para câncer de próstata; Receptores de estrogênio e progesterona: marcadores prognósticos em câncer de mama; CD3 (Pan-T): linfomas de células T; CK7: epitélios glandulares e transicional - subtipos de carcinomas, ductos biliares; CD10: células foliculares e linfoblastos, normais e neoplásicas, estroma endometrial e células renais; CD15: granulócitos maduros, células de Hodgkin e de Reed-Sternberg e diversos adenocarcinomas CD20 (Pan-B): linfomas de células B; CD30 (Ki-1): linfoma de Hodgkin, linfoma de grandes células anaplásico e carcinoma embrionário; CD117 (proto-oncogene c-kit): estroma gastrointestinal (GIST), carcinomas e leucemias, mastócitos; CK20: tumores gastrointestinais, carcinoma de células transicionais, tumor de células de Merkel; CromograninaA: diferenciação neuroendócrina; Desmina: células musculares, estriadas ou lisas - tumores musculares lisos e estriados E-caderina: carcinoma ductal x carcinoma lobular de mama Erb-B2/Her-neu: mama, ovário e trato-gastrointestinal. Prognóstico e preditivo em carcinoma de mama; KI-67: marcador de proliferação celular; Proteína P53: produto do gene supressor tumoral marcador prognóstico TTF-1: marcador de carcinomas de pulmão e tireóide e neoplasias neuroendócrinas. CK-7 Caspase-9 CD56 TTF1 Bcl-2 MMP-9 AE1+AE3 CD1a P63 Vimentina IL-4 CD3 CD68 Câncer de Pulmão: Tipos Histológicos Classificação WHO 2004 Tipos Maiores 1 LCC 5.0% Outros* 24.0% SCLC 13.0% Adenocarcinoma 38.3% 19.7% SqCC *Inclui CA adenoescamoso, CA sarcomatoides, Carcinoides, CA glândulas salivares, e Carcinomas inclassificáveis Percentual distribuido entre casos classificaveis, Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18: SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive),

5 Carcinoma Não-Pequenas Células (NSCLC): Tipos Histológicos 14% 19% 38% Adenocarcinoma Carc Cels Escamosas Carc Grandes Células Não Especificado (NOS) 29% 1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18: SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive), NSLCL: 70% Apresentação como Doença Avançada 5

6 Análise molecular de adenocarcinomas AKT1 NRAS MEK1 MET AMP HER2 PIK3CA 2% BRAF 2% Double Mutants 3% Sem mutação EML4-AKL 7% EGFR 17% KRAS 22% Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado Kris MG, et al. ASCO CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC Abstract O16.01 Alvos moleculares potencialmente tratáveis Alvos emergentes tratáveis em Adenocarcinoma de pulmão K-ras EGFR B-raf HER2 PIK3CA ALK MET Other Outro (Indeterminado) Alvos emergentes tratáveis em CA Celulas Escamosas de pulmão Gene Evento Frequencia, % FGFR1 Amplificação FGFR2 Mutação 5 PIK3CA Mutação 9 PTEN Mutação-deleção 18 CCND1 Amplificação 8 CDKN2A Deleção/mutação 45 PDGFRA Amplificacãomutação EGFR Amplificação 10 MCL1 Amplificação 10 BRAF Mutação 3 DDR2 Mutacão 4 ERBB2 Amplificação 2 Bang Y, et al. ASCO Abstract 3. Hammerman P, et al. IASLC WCLC Abstract PRS.1 9 IHQ: Marcadores Diagnósticos Adenocarcinoma Carc Cels Escamosas TTF1 p63 Travis WD; USCAP

7 IHQ, FISH, PCR: Marcadores Preditivos e Diagnósticos Gene copy number by FISH for epidermal growth factor receptor Mutation in epidermal growth factor receptor Huber Herbst RS, Hirsch FR. Lancet 373 (2009) Amsterdam, Protein expression by immunohistochemistry for epidermal growth factor receptor Qual Material? Patologia Cirúrgica: Rotina O que o Tipo de Procedimento na Obtenção da Biópsia pode Oferecer? - biópsia por agulha em múltiplos pontos ou core biópsia mínima : como definir histologia e análise molecular? - fatores que influenciam as análises moleculares Como Atender ao que o Patologista pode fazer? Como Facilitar o que quer saber o Oncologista? Kevin L, USCAP

8 Kevin L, USCAP 2012 Optimizando o Diagnóstico em Biópsias Pequenas Histologia: grupo de células incluso maligno não pequenas células não favorece adenocarcinoma pela morfologia Recomendável IHC para confirmar origem pulmonar Resultados: TTF1 neg, CK7 pos Tumor insuficiente recortes: Napsin A, CK20, sinaptofisina, cromogranina, e P40... Laudo: carcinoma não pequenas células, NOS, clínico pergunta: tumor de uma paciente com antecedentes de câncer de mama se for, recomendável pesquisa de Her2neu 8

9 Se pensarmos: mais a favor de adenocarcinoma precisamos saber se trata de AIS Se não: como temos certeza da ausência de diferenciação escamosa recomendamos pesquisa de EGFR e ALK Mudanças na Histologia do Câncer de Pulmão Pequenas Células (SCLC) -15% de todo câncer de pulmão - incidência em declínio Não-Pequenas Células (NSCLC) - 80% de todo câncer de pulmão - tipos de NSCLC : - células escamosas - adenocarcinoma - grandes células Carcinoma não-pequenas células Adenocarcinoma - padrão glandular -mucina positiva (50%) WHO - CK7+/CK20- - TTF1+ Napsin A Comum, mas não 100% Carcinoma células escamosas -queratinização celular -pontes intercelulares -escamas córneas WHO - CK7-/CK20- - P63+ CK5/6+ Comum, mas não 100% 9

10 NSCLC NOS MICROSCOPIA ÓPTICA NSCLC FAVORECE ADENOCARCINOMA TTF1 TTF1 10

11 NSCLC- FAVORECE ADENOCARCINOMA CONFIRMADO PELA MOLECULAR Travis W, USCAP 2012 NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA Travis W, USCAP 2012 NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA 11

12 NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA- BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA Travis W, USCAP 2012 MUTAÇÃO EGFR ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE SINALIZAÇÃO Travis W, USCAP 2012 EGFR EXON 21 L858R- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA Brevet M et al. J Mol Diagn 12: ,

13 EGFR EXON 19 DELEÇÃO- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA Brevet M et al. J Mol Diagn 12: , 2010 Análise molecular de adenocarcinomas AKT1 NRAS MEK1 MET AMP HER2 PIK3CA 2% BRAF 2% Double Mutants 3% Sem mutação EML4-AKL 7% EGFR 17% KRAS 22% Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado Kris MG, et al. ASCO CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC Abstract O16.01 Quantificação da Expressão do EGFR FLEX Baixa EGFR IHC score <200 N=776; 69% Alta EGFR IHC score 200 N=345; 31% IHC score=0* IHC score=112 IHC score=270 Aproximadamente 1/3 pacientes estão no grupo EGFR alta expressão Huber *This field Amsterdam, Pirker, WCLC 2011, Abst O

14 EGFR-Anticorpo FLEX NSCLC wet IIIB/IV EGFRexpressing Chemotherapy + Cetuximab Chemotherapy Maintenance Cetuximab until PD or intolerable toxicity Chemotherapy (CT) Cisplatin 80 mg/m 2 day 1 Vinorelbine 25 (30) mg/m 2 days 1, 8 Every 3 weeks, up to 6 cycles Cetuximab initial dose 400 mg/m 2 then 250 mg/m 2 weekly Pirker R et al. J Clin Oncol 2008, 18S (abstract 3), Lancet 2009;373: Huber Amsterdam, Huber FLEX: sobrevida CT + cetuximab (n=557) Median OS 1-year survival 11.3 mo 47% CT (n=568) 10.1 mo 42% No effect of kras-mutation and EGFR- FISH O'Byrne P ea. ASCO 2009 Pirker HuberR ea. ASCO 2008, Lancet 2009;373: Amsterdam, Huber CT, chemotherapy; HR, hazard ratio; OS, overall survival Sobrevida com Alta Expressão EGFR (N=345) Overall survival (%) CT + cetuximab Survival Median 1-year 2-year 12.0 mo 50% 24% CT 9.6 mo 37% 15% HR*=0.73 [95% CI ], p= Number of patients at risk Months CT + cetuximab CT Huber Amsterdam, *When adjusted for prognostic factors: HR 0.67 [95% CI ], p=0.002; Logrank 14

15 CONCLUSÃO Medicina Personalizada do Paciente Câncer de Pulmão Avançado deve ser Direcionada para Histologia e Genética (IHQ, ISH, PCR) OBRIGADA!! 15

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