Clinical Chemistry. Germany; Center, New York, NY; Enschede, the Netherlands;

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1 Circulating Cancer Cells and Their Clinical Applications Moderator: Eleftherios P. Diamandis1,2,3* Experts: Klaus Pantel,4 Howard I. Scher,5,6 Leon Terstappen,7 and Evi Lianidou8 Células Cancerígenas Circulantes e Suas Aplicações Clínicas Eleftherios P. Diamandis, Moderators 1,2,3, * Klaus Pantel, Experts 4, Howard I. Scher, Experts 5,6, Leon Terstappen, Experts 7 and Evi Lianidou, Experts 8 1 Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, 2 Department of Pathology and Laboratory Medicine, Mount Sinai Hospital, and 3 Department of Clinical Biochemistry, University Health Network, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada; 4 Institute of Tumour Biology, Centre of Experimental Medicine, University Medical Centre Hamburg Eppendorf, Hamburg, Germany; 5 Genitourinary Oncology Service and 6 Department of Urologic Oncology, Sidney Kimmel Center for Prostate and Urologic Cancers, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY; 7 Faculty of Science and Technology, MIRA Research Institute, Department of Medical Cell BioPhysics, University of Twente, Enschede, the Netherlands; 8 Department of Chemistry, University of Athens, Athens, Greece. *Envie correspondência para esse autor para: University of Toronto, Canada Mount Sinai Hospital, 60 Murray St., 6th Floor, Toronto, Ontario, M5G 1X5 Canada. Fax ; ediamandis@mtsinai.on.ca. Câncer residual mínimo é definido como a presença de células tumorais que não são detectáveis pelos atuais procedimentos diagnósticos de rotina usados para classificação do tumor em pacientes com câncer após remoção cirúrgica do tumor primário. Dados dos grupos Norte Americano e Europeu demonstraram o impacto no prognóstico de pacientes com câncer de seio das células tumorais disseminadas (DTCs)9 na medula óssea. Detecção das células tumorais circulantes (CTC) e enumeração no sangue periférico foram examinadas em estudos prospectivos de multicentros de cânceres metastáticos de próstata, colorretal e de seio e foram associadas com reduzida sobrevivência geral e livre de progressão. Um número crescente de estudos de pesquisa clínica está validando essas observações e as estendendo para outros cânceres e para estágios mais iniciais da doença. CTCs são altamente heterogêneas, e sua caracterização molecular é importante, não apenas para confirmar sua origem maligna como também para seguir mudanças imune-fenotípicas com a progressão do tumor e identificar diagnosticamente e terapeuticamente alvos relevantes que ajudarão a estratificar pacientes com câncer para terapias individualizadas. A raridade das CTCs e desse modo a quantidade muito limitada de amostra disponível apresenta um formidável desafio analítico e técnico. Recentes avanços técnicos na detecção e caracterização da CTC incluem métodos PCR (RT-qPCR) quantitativos e de transcrição reversa, abordagens baseadas na imagem, e dispositivos de micro filtro e de microchip. CTCs representam um novo e promissor campo diagnóstico para pacientes em estágios avançados no qual as plataformas sensíveis de detecção da CTC permitem o monitoramento da doença e a eficácia do tratamento. O desenvolvimento de tecnologias de células únicas pode permitir a realização do perfil dessas células com o propósito de adaptar os regimes de tratamento. Técnicas de detecção e caracterização da CTC têm grande promessa de desempenhar um papel como uma biópsia líquida que permitirá que os médicos sigam as mudanças do câncer durante o tempo e moldem o tratamento. Pesquisa atual sobre as CTCs está focando a identificação de novos biomarcadores diagnósticos e terapêuticos produzidos por essas células. CTCs são promissoras como novos biomarcadores de tumores porque elas são alvos bem definidos para se entender a biologia tumoral e a disseminação das células

2 tumorais que podem abrir novas avenidas para a detecção precoce da metástase e seu bemsucedido tratamento. Nós discutimos as CTCs e seu potencial diagnóstico com 4 cientistas e clínicos líderes nesse campo. Uma lista de leitura sugerida sobre esse tópico é fornecida no Suplemento de Dados que acompanha a versão online dessa em 1. Quais são os atuais métodos analíticos para detectar CTCs? Quão confiáveis são esses métodos? Importa qual método é usado clinicamente? Klaus Pantel: Métodos analíticos atuais para detectar CTCs sempre incluem um passo de enriquecimento e um passo de detecção. Enriquecimento das CTCs pode ser baseado no tamanho (dispositivos de filtração), densidade (por exemplo, centrifugação Ficoll), capacidade de invadir uma matriz de colágeno, e imuno seleção positiva [por exemplo, enriquecimento baseado nos anticorpos das moléculas de adesão das células epiteliais (EpCAM) das CTCs] ou imuno seleção negativa (isto é, depleção dos leucócitos por anticorpos CD45 ). As subsequentes abordagens usadas para detectar CTCs são (i) imunocitoquímica com anticorpos anticitoqueratina (anti-ck); (ii) RT-PCR tendo como alvo vários mrnas epiteliais, incluindo CK-19 mrna; e (iii) testes de immunospot epiteliais (EPISPOT) que detectam proteínas específicas dos tumores liberadas pelas CTCs [por exemplo, antígeno específico da próstata (PSA)]. Todos os métodos de enriquecimento são tendenciosos porque células tumorais são heterogêneas e alguma fração das CTCs pode ser perdida (por exemplo, imuno seleção com anticorpos EpCAM não pode pegar CTCs de EpCAM negativa). Detecção com anticorpos anti-ck é atualmente a abordagem mais validada e padronizada, que também permite interpretação morfológica de eventos positivos. Diferentes métodos de detecção levam a diferentes resultados, como mostrados pela análise comparativa das mesmas amostras do paciente com diferentes tecnologias. Desse modo, os resultados clínicos grandemente dependem da tecnologia usada para detectar CTCs. A tecnologia que tem produzido a maior quantidade de dados clínicos sobre a relevância prognóstica das CTCs nos cânceres de seio, de próstata, e de cólon é o sistema CellSearch (Veridex) aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos. Howard I. Scher: Nesse ponto, não há definição padronizada de uma CTC, e as várias técnicas usadas para enriquecer e caracterizar essas células não medem ou relatam o mesmo biomarcador da CTC. A ampla gama de testes e dispositivos em uso e em desenvolvimento inclui aqueles baseados em: diferenças físicas, por exemplo, centrifugação do gradiente de densidade, filtração, ou a plasticidade das CTCs relativa às células não malignas; anticorpos de células de superfície conjugados com pérolas magnéticas, microposts, ou ferrofluidos para positivamente selecionar/capturar células tumorais; e esvaziar a população de células não malignas primeiro, deixando as CTCs para trás um processo chamado de seleção negativa. Os vários passos do enriquecimento são então seguidos por diferentes métodos para detectar e caracterizar as células via várias técnicas moleculares ou citométricas. Confiabilidade do teste deve considerar 2 componentes. O primeiro é o desempenho analítico do teste. Na maioria dos relatórios, detalhes dos passos da validação analítica que foram realizados estão faltando. Muitos dos testes foram estudados apenas em um cenário de um único laboratório, e a maioria desses testes não são certificados pelo CLIA. Conhecer tanto a capacidade do teste quanto o que ele está realmente medindo e relatando é crítico antes de prosseguir para o teste clínico. O segundo compo-

3 nente é a avaliação clínica, isto é, o nível de evidência que foi gerado até agora com respeito ao contexto no qual o teste pode ser usado na clínica. Importa qual método está sendo usado clinicamente? Sim, e a primeira consideração é o contexto de uso para o qual o teste está sendo desenvolvido. Declarado diferentemente, qual é a decisão médica que o resultado do teste precisa informar? Contextos de uso incluem diagnóstico, prognóstico, previsão, indicadores de resposta, ou substitutos de eficácia/resposta. Como exemplos, conhecimento de uma contagem celular não informa a escolha de uma terapia específica pela outra, as passo que a detecção de uma mutação quinase nas CTCs poderia. Nenhum teste único fornecerá informação sobre todos esses contextos. Leon Terstappen: Atualmente, o sistema CellSearch é o único sistema validado para enumeração da CTC e como tal é o único sistema que pode ser usado na clínica. Embora uma variedade de métodos analíticos esteja sendo explorada para a detecção das CTCs, apenas uns poucos estão disponíveis para uso laboratorial rotineiro. As definições usadas para definir CTCs variam grandemente entre os diferentes métodos e resultam em uma grande variedade nos números relatados das CTCs detectadas, assim como na proporção de pacientes nos quais CTCs são detectadas. Como consequência, um método de detecção de CTC precisa ser não somente preciso e reproduzível, mas estudos clínicos prospectivos também precisarão ser conduzidos para determinar as implicações das CTCs detectadas para cada método analítico. Evi Lianidou: Atualmente existe uma grande quantidade de métodos analíticos para detectar CTCs. Entretanto, como indicado anteriormente, a principal abordagem analítica com releção à detecção das CTCs sempre inclui 2 passos: (a) isolameto/enriquecimento e (b) detecção. CTCs são eventos raros que seguem uma distribuição Poisson, e esse fato tem que ser levado em conta para sua detecção. O volume de amostra do sangue periférico usado para seu isolamento é crítico, especialmente no caso de doença precoce. As abordagens de enriquecimento mais amplamente usadas são baseadas (a) na diferente densidade das CTCs, uma característica explorada com tais métodos como centrifugação na presença de Ficoll; (b) filtração; e (c) isolamento imunomagnético (positivo ou negativo) através de anticorpos específicos para marcadores epiteliais tais como EpCAM ou leucócitos (CD45), respectivamente. Uma combinação de métodos de enriquecimento é também usada, por exemplo, dispositivos de filtração em combinação com isolamento EpCAM positiva, enriquecimento Ficoll, e então isolamento imune magnético positivo. Abordagens de detecção são baseadas em (a) imagem (imunocitoquímica e imunofluorescência) através do uso de marcadores específicos para CTCs tais como CKs (principalmente CK-8, 18, e 19), leucócitos tais como CD45, e viabilidade celular via coloração 4,6-diamidino-2-fenilindol dicloridrato (DAPI) principalmente pelo sistema CellSearch aprovado pela FDA; (b) métodos moleculares baseados na expressão gênica de marcadores específicos tais como CK-19; e (c) métodos baseados na detecção de proteínas secretadas por CTCs imobilizadas, tais como o teste EPISPOT. Apesar do fato da maioria desses métodos ser altamente específica e sensível, até agora não existem estudos extensos destinados a comparar sua eficácia quando usamos as mesmas amostras clínicas. Essa é uma importante questão para seu uso clínico já que, especialmente na doença precoce, diferenças na sensibilidade analítica entre esses métodos desempenham um papel muito crítico. Existe necessidade de um sistema de controle de qualidade para enumeração da CTC? Klaus Pantel: Existe uma clara necessidade de um sistema de controle de qualidade para

4 enumeração da CTC. Sistemas automatizados de detecção da CTC (por exemplo, CellSearch) incluíram controles embutidos positivos e negativos que permitiram a distribuição de imagens entre os centros laboratoriais participantes. Visto que os sistemas de detecção microscópica são dependentes do observador, o desenvolvimento de padrões internacionais para enumeração e caracterização da CTC é da máxima importância. Howard I. Scher: Existe mais do que uma necessidade; é essencial. Sem controle de qualidade, os resultados relatados e os dados clínicos que podem ser derivados deles são virtualmente não interpretáveis e são de limitado até nenhum valor. Neste momento, como indicado anteriormente, o único teste CTC que foi liberado pela FDA para uso, CellSearch, define uma CTC como uma célula que está morfologicamente intacta, possui um núcleo cercado por citoplasma após coloração DAPI, expressa CK-8, 18, ou 19, e é CD45 negativo. Digno de nota é que como parte do processo de validação, que mostrou a reprodutibilidade e consistência do teste nos laboratórios de referência e locais, mais de 450 amostras de pacientes com câncer, além das amostras de controle, foram avaliadas. Leon Terstappen: Cada sistema CTC deve ser validado e acompanhado com um sistema de controle de qualidade. Evi Lianidou: Numerosos estudos de uma única instituição sugerem que CTCs podem desempenhar um importante papel na estratificação do risco e monitoramento da eficácia terapêutica. Esses achados precisam ser avaliados em testes para verificar esse conceito no cenário clínico. Acordo sobre a detecção padronizada das CTCs é absolutamente necessário. Questões críticas incluem: (a) a padronização da fase préanalítica, tal como a própria amostragem (por exemplo, volume da amostra, evitar a coamostragem de células epiteliais epidérmicas em caso de marcadores epiteliais tais como CK- 19 será usada mais tarde para detecção da CTC), envio da amostra (estabilidade das CTCs sob diferentes condições) e condições de armazenagem (uso de preservativos ou anticoagulantes); (b) padronização do isolamento da CTC através do uso de controles marcados no sangue periférico; (c) padronização dos sistemas de detecção; e (d) estudos comparativos interlaboratoriais e intralaboratoriais para as mesmas amostras. O desenvolvimento de padrões internacionais para enumeração e caracterização da CTC também é muito importante, especialmente nos sistemas de detecção de imagem que são dependentes do observador. Um recente estudo mostrou a viabilidade da garantia da qualidade externa da enumeração da CTC usando o sistema CellSearch. Métodos moleculares baseados no RT-qPCR podem ser usados nos laboratórios clínicos de rotina e podem ser padronizados, já que as questões necessárias de qualidade, tais como valores do ciclo de quantificação (Cq), limite de detecção, precisão, acurácia, e experimentos de recuperação, foram claramente descritos. Estudos que compararam métodos moleculares baseados no RT-PCR e imunocitoquímica mostraram uma significativa correlação, ao passo que num recente estudo de comparação do teste CellSearch e um teste molecular (AdnaTest BreastCancer), resultados concordantes com relação à positividade do HER2 (receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2) foram obtidos em apenas 50% dos pacientes. Em conclusão, um sistema universal de controle de qualidade interna e externa para detecção e enumeração da CTC é urgentemente necessário antes de sua aplicação na clínica. Para qual câncer foi feito mais trabalho com CTCs e por quê? Klaus Pantel: Câncer de seio tem sido o foco das atividades internacionais nas CTCs porque é aceito que disseminação precoce de origem sanguínea de células tumorais desempenha um papel importante no câncer de seio, como sublinhado pelo trabalho anterior sobre a relevância clínica das DTCs na medula óssea. Mais recentemente, dados sobre monitoramento das CTCs em câncer de próstata avançado resistente à prostatectomia têm fornecido importantes pistas dessa abordagem como uma biópsia

5 líquida, particularmente no contexto das novas terapias. Howard I. Scher: Uma procura na literatura da PubMed por células tumorais circulantes e tipo de tumor produziu os seguintes números de publicações: seio, 275; melanoma, 181; pulmão, 155; próstata, 117; colorretal, 116; sarcoma, 53; cabeça e pescoço, 41; linfoma, 41; leucemia, 21; rim, 22; e bexiga, 16. O número de publicações é apenas um aspecto do trabalho feito numa área específica da doença. Mais importante é a qualidade, que nos traz de volta à validade analítica do(s) teste(s) usado(s) nos relatórios e o nível de evidência que tem sido gerado para apoiar um específico contexto de uso. Uma questão reside no passo de detecção. Por exemplo, usando-se CellSearch, encontramos contagens celulares desfavoráveis acima de 50% 70% dos pacientes com doença metastática progressiva resistente à prostatectomia; para câncer colorretal, essa taxa é de 15%. Em casos onde as taxas de detecção são baixas, novos testes são necessários para aumentar a proporção de pacientes nos quais os biomarcadores da CTC podem ser avaliados. O documento de liberação da FDA para enumeração da CTC com a CellSearch declara: A presença de CTC no sangue periférico, como detectado pelo kit de Células Tumorais Circulantes do CellSearch, está associada com reduzida sobrevivência livre de progressão e reduzida sobrevivência geral em pacientes tratados para câncer metastático de seio, colorretal ou de próstata. O teste é para ser usado como uma ajuda no monitoramento de pacientes. Testes em série para CTC devem ser usados em conjunção com outros métodos clínicos para monitoramento ( 7/K pdf). Liberação, entretanto, não significa que os resultados possam ser usados como um substituto da resposta de eficácia para sobrevivência em arquivos reguladores. Essa questão específica pode ser abordada apenas incorporando a questão do biomarcador à sobrevivência baseados em ensaios de fase 3. Tal iniciativa está em curso na linha de base e nos testes da fase 3 de registro da enumeração da CTC de acompanhamento pós-tratamento do acetato abiraterona (Ortho Biotech, uma Divisão da Cougar Biotecnologia), no teste do MDV3100 (Medivation), e no teste do ipilimumab (Bristol-Myers Squibb) e TAK-700 (Millenium). Um documento formal resumido descrevendo essa iniciativa foi apresentado ao Centro de Avaliação e Pesquisa de Drogas (CDER) uma subdivisão da FDA, e análises da associação da enumeração da CTC com a sobrevivência está em curso. A significância prognóstica do número da CTC após o tratamento também está sendo estudada no câncer de seio como um indicador de resposta para mudar o tratamento. De particular interesse nos cânceres de pulmão e colorretal está a capacidade de detectar mutações quinase que prevêem a resistência do tratamento, tanto no começo da terapia quanto durante a terapia. Para esses contextos, o teste providencia levar uma amostra sanguínea facilmente adquirida para delinear o tumor na ocasião que um tratamento for considerado, potencialmente substituindo a necessidade de uma biópsia invasiva e cara que é difícil de realizar repetidamente. CellSearch como atualmente configurado não pode ser usado para detectar CTCs em pacientes com melanomas e carcinomas celulares renais, porque esses tumores não expressam EpCAM. Para detectar CTCs nesses contextos, alguns grupos estão estudando a detecção da CTC usando metodologias baseadas no qpcr para antígenos específicos do melanoma. Com base nos dados promissores da fase 2, os testes da fase 3 estão em curso. Finalmente, o nível da atividade de pesquisa será determinado pela necessidade não satisfeita que o teste será usado para abordar o desempenho técnico dos testes disponíveis e os resultados da sequência de testes necessários para gerar suficiente evidência para possibilitar uso rotineiro num cenário de prática clínica.

6 Leon Terstappen: Estudos prospectivos de multicentros têm sido conduzidos para cânceres metastáticos de seio, colorretal, e de próstata. O patrocinador escolheu conduzir estudos nos 3 carcinomas mais frequentes. Evi Lianidou: CTCs são principalmente estudadas no câncer de seio. A razão é que a relevância clínica das DTCs na medula óssea de pacientes com câncer de seio foi claramente mostrada. Visto que disseminação precoce de origem sanguínea das células tumorais desempenha um importante papel no câncer de seio, muito trabalho tem que ser feito nesse tipo de câncer tanto com as amostras da medula óssea quanto com as do sangue periférico. Usando RT-qPCR, nosso grupo mostrou que no câncer de seio inicial a detecção das células CK-19 mrna positivas no sangue periférico é um fator prognóstico independente para um reduzido intervalo livre de doença e sobrevivência geral para pacientes com câncer de seio de nodo negativo. Além disso, a detecção das células mamaglobina 1 (MGB1) mrna positivas e CK-19 mrna positivas no sangue periférico antes que quimioterapia adjuvante preveja má sobrevivência livre de doença, embora a detecção das CTCs CK-19 mrna positivas no sangue após quimioterapia adjuvante seja um fator de risco independente que indica a presença de doença residual resistente à quimioterapia. A importância da enumeração da CTC no câncer avançado de seio foi mostrada usando o sistema CellSearch. Mais recentemente, dados sobre o monitoramento das CTCs em outros tipos de câncer, tais como câncer avançado de próstata resistente à prostatectomia, têm fornecido importantes pistas como uma biópsia líquida, particularmente no contexto de novas terapias. Quais são as principais questões clínicas e necessidades não satisfeitas a serem abordadas com as CTCs? Klaus Pantel: (i) Estimativa do risco de reincidência metastática ou progressão metastática (informação prognóstica); (ii) estratificação e monitoramento em tempo real das terapias; (iii) identificação dos alvos terapêuticos e dos mecanismos de resistência (terapias biológicas). Howard I. Scher: Com foco no câncer de próstata em particular, questões-chave no desenvolvimento da droga e no tratamento do paciente são as dificuldades de avaliar os efeitos do tratamento. Isso é porque metástases esqueléticas, que são difíceis de analisar quantitativamente, representam o local mais frequente da disseminação metastática e uma das principais causas da morbidade relacionada com a doença, e embora medições em série do PSA guiem o tratamento, existem circunstâncias onde um paciente pode estar respondendo favoravelmente quando o PSA está subindo ou não estar respondendo quando ele está diminuindo. Indicadores precoces de resposta que podem ser rapidamente avaliados na fase 2 dos testes são essenciais, tanto para os pacientes individuais, assim como para informar a decisão de prosseguir para a fase 3 mais avançada do teste. Um problema adicional é que é difícil obter tumor metastático para perfil molecular do osso, o local mais comum da disseminação, e até mesmo quando é viável, poucos testes usados foram analiticamente validados. Utilizar uma terapia direcionada requer uma demonstração de que o alvo está presente quando o tratamento é considerado: biópsias são invasivas, caras, e difíceis de repetir. Virtualmente todos os tumores de próstata inicialmente respondem à ablação do andrógeno e eventualmente progridem para um estado resistente à prostatectomia (referido como câncer de próstata resistente à castração ou CRPC), que é quase invariavelmente letal. Concentrações de PSA são frequentemente usadas como um indicador de doença progressiva assim como um indicador de resposta tanto para agentes hormonais quanto citotóxicos. Entretanto, mudanças pós-terapia do PSA não são um desfecho substituto para sobrevivência geral. Esses achados sugerem a necessidade de identificar e definir medidas de resultados de eficácia que mais precisamente reflitam o verdadeiro benefício clínico.

7 Leon Terstappen: Uma ferramenta para determinar qual terapia ou combinação de terapias promete ser a mais eficaz para o paciente individual. Uma ferramenta para eficazmente determinar a eficácia do tratamento uma vez administrado. Evi Lianidou: Principais questões clínicas: (a) estudos clínicos para mostrar que detecção da CTC pode levar a uma mudança no tratamento dos pacientes com câncer que resulta num melhorado resultado clínico (o teste randomizado da fase 3 do Southwest Oncology Group 0500 é especialmente destinado a testar a estratégia de mudar a terapia contra manter a terapia para pacientes com câncer de seio metastático que possuam elevados níveis de CTC na primeira avaliação de acompanhamento e se espera que seja completado logo); e (b) medicina personalizada: o uso de CTCs para estratificação dos pacientes e monitoramento em tempo real das terapias. Necessidades não satisfeitas a serem abordadas: (a) validação cruzada dos achados entre os laboratórios; (b) caracterização molecular das CTCs possibilitará a identificação de novas terapias que terão como alvo a disseminação micro metastática e elucidarão sua conexão com as células tronco do câncer. A detecção da heterogeneidade entre as CTCs é importante? Klaus Pantel: CTCs e DTCs mostram uma acentuada heterogeneidade em termos de aberrações genéticas e padrões de expressão gênica. Para determinar essa heterogeneidade é importante, por exemplo, estimar a agressividade da carga do tumor residual e obter informação sobre a seleção dos clones específicos da CTC durante a terapia (por exemplo, status do HER2 das CTCs que se submetem à terapia anti-her2 com trastuzumab. Howard I. Scher: Sim. Sensibilidade e especificidade são uma questão com as técnicas específicas de enriquecimento da CTC, devido à heterogeneidade do tumor no tamanho da célula, densidade, e expressão do marcador. Consequentemente, alguma perda de células tumorais é provável de ocorrer, independentemente da técnica de enriquecimento usada. Tumores primários são conhecidos por serem heterogêneos, e as CTCs possuem um perfil citogenético molecular reflexivo desse fenômeno. A seleção dos múltiplos marcadores na detecção das CTCs é crítica. Além disso, uma mutação que seja preditiva para resposta a uma droga específica pode ser detectada numa população de CTCs, mas se a mutação estiver presente em apenas uma pequena proporção de CTCs, o benefício clínico pode ser limitado. A mesma consideração se aplica aos biomarcadores baseados nas proteínas. Leon Terstappen: Sim, heterogeneidade com respeito à presença dos alvos de tratamento em particular pode se tornar importante para moldar o coquetel ideal de terapias. Evi Lianidou: CTCs são altamente heterogêneas, como já foi mostrado através de métodos moleculares e de microscopia de exame a laser. Isso é altamente importante, particularmente quando alvos terapêuticos são expressos em CTCs mas não no tumor primário. Uma vez que CTCs HER2 positivos foram detectadas em um número substancial de pacientes com tumores primários HER2 negativos, avaliação do status do HER2 avaliando-se a expressão do HER2 nas CTCs é uma estratégia com potencial aplicação clínica. Entretanto, a importância da heterogeneidade da CTC não foi até agora totalmente explorada clinicamente. Quando é melhor se avaliar as CTCs? Antes ou depois do tratamento primário? Klaus Pantel: A meia-vida estimada das CTCs é curta. Desse modo, pode-se presumir que a avaliação das CTCs após terapia primária (por exemplo, após o término da quimioterapia adjuvante) fornece informação sobre depósitos micro metastáticos ocultos, ao passo que a detecção no diagnóstico primário (e remoção cirúrgica do tumor) pode ser grandemente determinada pela capacidade de disseminação do tumor primário. Embora dados que comparam a relevância clínica de se enumerar as CTCs nesses 2 pontos de tempo ainda estejam faltando,

8 a enumeração das CTCs que sobreviveram à terapia (neo)adjuvante pode ser mais relevante para o prognóstico do paciente do que a detecção das CTCs no diagnóstico primário. Howard I. Scher: Ambos, contudo, uma vez mais, a questão se resume ao contexto. Por exemplo, se um teste específico detectar doença em apenas 5% ou menos dos pacientes que se apresentam para terapia primária, seria mais apropriado procurar por novos testes que aumentam as taxas de detecção, porque a falha em detectar CTCs não garante um resultado favorável. Isso dito, existe dados de múltiplos tipos de tumores indicando que a detecção de células no diagnóstico está associada com um prognóstico inferior, mas ainda não existe dados que apóiem decisões sobre o tratamento definitivo de um tumor primário com base na presença ou ausência de células. Para o contexto de usar CTCs para perfil molecular para guiar a seleção do tratamento, é essencial se ter uma amostra pré-tratamento, ao passo que para o contexto da resposta ambos são importantes. Leon Terstappen: Antes da administração da terapia, a presença e o número de CTCs devem ser usados para avaliar o prognóstico e determinar a presença ou ausência dos alvos de tratamento. Depois do primeiro ciclo de terapia, CTCs devem ser usadas para determinar se a terapia administrada é eficaz ou não. Evi Lianidou: A presença de DTCs na medula óssea foi claramente mostrada ser de significância prognóstica em pacientes com câncer de seio antes do tratamento primário. Nosso grupo mostrou que no câncer de seio inicial, a detecção das CTCs CK-19 mrna positivas é um fator prognóstico independente tanto antes quanto depois da quimioterapia adjuvante. Qual é o papel das CTCs na medicina personalizada? Klaus Pantel: Monitoramento em tempo real e caracterização molecular das CTCs, particularmente para alvos terapêuticos (por exemplo, HER2) ou mutações que conferem resistência às terapias direcionadas [por exemplo, mutações do KRAS (oncogene v-ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral homólogo)], podem contribuir para uma melhor seleção dos pacientes com câncer que podem se beneficiar das caras terapias com consideráveis efeitos colaterais, e essas medições também podem permitir um mudança precoce para terapias mais eficazes em pacientes individuais. Howard I. Scher: Para muitos tipos de tumores, os determinantes biológicos que contribuem para a progressão mudam durante o tempo. Em tais casos, perfis moleculares do tumor primário obtidos para estabelecer um diagnóstico ou que é removido como terapia definitiva pode não serem informativos. Nesses casos, é essencial se obter material do tumor na hora da primeira e potencialmente de todas as subsequentes reincidências. Semelhantemente, é sabido que perfis moleculares também podem mudar em uma terapia específica. Aqui, se obter material do tumor para se fazer um perfil é essencial. Para a maioria dos tumores, entretanto, o desempenho de uma biópsia de repetição após o diagnóstico inicial e tratamento não é uma parte da prática rotineira e, como notado acima, também é invasiva, cara, e difícil de repetir. CTCs obtidas de uma simples amostra de flebotomia minimamente invasiva obtida no contexto do tratamento rotineiro do paciente pode atender a essa necessidade não satisfeita. Além disso, estudos sequenciais que mostram a presença ou ausência de CTCs provavelmente fornecerão rápidas leituras da eficácia do tratamento, possibilitando que terapias que estejam beneficiando um paciente sejam continuadas e aquelas que não estejam sejam interrompidas. Leon Terstappen: Em pacientes nas quais as CTCs podem ser detectadas e caracterizadas, as CTCs podem substituir a biópsia tradicional. Evi Lianidou: Caracterização molecular das CTCs pode fornecer valiosa informação sobre a expressão dos receptores específicos tais como HER2, ativando vias tais como angiogênese, e mutações específicas, tais como no receptor do fator de crescimento epidérmico, que confere sensibilidade às terapias. Análise molecular da CTC oferece a possibilidade de monitorar mu-

9 danças durante o curso do tratamento e pode servir como uma biópsia em tempo real para guiar terapias moldadas no futuro próximo. A evidência atualmente disponível é suficiente para usar as CTCs na clínica? Se for, para qual aplicação? Klaus Pantel: Em pacientes com câncer avançado (em particular câncer de seio e de próstata), existe suficiente evidência de que a enumeração das CTCs fornece informação prognóstica e parece ser mais sensível do que as atuais tecnologias de imagem ou marcadores séricos (por exemplo, PSA) usados para medir progressão. Em pacientes em estágio inicial, o papel prognóstico das CTCs ainda está sob avaliação. Medições da CTC são parte de testes clínicos em curso que testam novas drogas no câncer de seio e de próstata, e os resultados desses testes determinarão se a detecção da CTC (e caracterização) se tornarão uma ferramenta valiosa como um diagnóstico companheiro (isto é, marcador substituto para resposta ou fracasso da terapia). Howard I. Scher: Sim, a evidência até agora apóia o uso da enumeração da CTC para o uso clínico para o qual ela é liberada. Os dados são suficientes para dizer que o teste pode ser usado no lugar da imagem, ou como um biomarcador preditivo para guiar o tratamento, embora essa questão esteja sendo abordada prospectivamente em múltiplos testes. Leon Terstappen: Sim, para a determinação do prognóstico e do monitoramento da terapia de pacientes tratados para câncer metastático de seio, câncer colorretal, e câncer de próstata. Evi Lianidou: Existe suficiente evidência de que a enumeração das CTCs fornece informação prognóstica em pacientes com certos tipos de câncer avançado (seio, cólon, próstata). Detecção da CTC parece ser mais sensível do que as atuais tecnologias de imagem ou os clássicos biomarcadores séricos de tumor usados para detectar reincidência inicial. Em pacientes com câncer de seio em estágio inicial, nosso grupo mostrou que a detecção de CTCs CK-19 mrna positivas é um fator prognóstico independente, tanto antes quanto depois da quimioterapia adjuvante. Entretanto, essa é uma experiência de um único centro que ainda não foi validada por cruzamento em outros laboratórios, portanto o papel prognóstico das CTCs na doença inicial ainda está sob avaliação. Medição da CTC pode desempenhar um papel para a avaliação da eficácia de novas drogas no câncer de seio e de próstata. Essa questão está agora sendo testada em testes clínicos, e seus resultados determinarão se as CTCs podem ser usadas como marcadores substitutos para resposta da terapia. Qual é a sua previsão para a aplicabilidade clínica das CTCs daqui a 10 anos? Klaus Pantel: Monitoramento em tempo real das CTCs para avaliar a eficácia terapêutica complementará as atuais determinações da progressão do tumor por tecnologias de imagem ou medições dos marcadores séricos sanguíneos. Além disso, a análise molecular das CTCs para alvos terapêuticos e/ou mutações nas vias que conferem resistência às terapias moleculares ( biópsia líquida ) pode se tornar ferramentas valiosas para moldar terapias modernas às necessidades individuais de um paciente com câncer. Howard I. Scher: Além dos contextos discutidos na pergunta anterior, múltiplos grupos estão desenvolvendo a capacidade de consistentemente capturar células vivas e estabelecer culturas celulares de curto prazo. As últimas são usadas para testar os efeitos do anti-tumor das drogas específicas para melhor informar a escolha de uma terapia mais provável de beneficiar aquele paciente, assim como para melhor entender os mecanismos de resistência e a biologia mutante da doença. Análises de células únicas também estão em desenvolvimento, e logo os avanços tecnológicos nessa área possibilitarão a análise de números suficientes de células num cenário em tempo real. Além dos avanços tecnológicos antecipados, é essencial que novos designs de testes sejam desenvolvidos, criados, e executados para dar mais aerodinâmica ao processo. Essa aerodinâmica é essencial para

10 encurtar o tempo de desenvolvimento da droga e para minimizar o uso de estudos baseados na sobrevivência que inscrevem todos os que se apresentam. Tais estudos não são apenas ineficientes e caros, mas também possuem o detrimento adicionado de diminuir o desenvolvimento da droga e expor os pacientes ao ineficaz tratamento tóxico. Leon Terstappen: CTCs serão usadas em testes de rotina para monitorar tratamento do câncer e serão usadas para determinar quais terapias podem ser eficazes no paciente individual. Evi Lianidou: Uma combinação de sistemas avançados de imagem e caracterização molecular das CTCs será muito útil para melhor refinar o prognóstico, definir as estratégias de tratamento, e eliminar ou reduzir o risco de metástase. O uso de modernas e poderosas tecnologias tais como sequenciamento da próxima geração possibilitará a elucidação das vias moleculares nas CTCs e levará ao design de novas terapias moleculares que tenham como alvo especificamente as CTCs. Além disso, CTCs podem se tornar o método preferido para monitorar a eficácia das terapias adjuvantes do câncer. Notas de Rodapé 9 Abreviações não padronizadas: DTC, célula tumoral disseminada; CTC, célula tumoral circulante; RT-qPCR, PCR quantitativo de transcrição reversa; EpCAM, molécula de adesão da célula epitelial; CK, citoqueratina; EPISPOT, (teste) de immunospot epiteliais; PSA, antígeno específico da próstata; FDA, Administração de Drogas e Alimentos dos Estados Unidos; DAPI, 4,6-diamidino-2-fenilindol dicloridrato ; Cq, ciclo de quantificação; HER2, receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2; CDER, Centro de Avaliação e Pesquisa de Drogas; MGB1, mamaglobina 1. Contribuições dos Autores: Todos os autores confirmaram que eles contribuíram para o conteúdo intelectual desse paper e satisfizeram os 3 seguintes requisitos: (a) contribuições significantes para a concepção e design, aquisição de dados, ou análise e interpretação dos dados; (b) rascunhando ou revisando o artigo para conteúdo intelectual; e (c) aprovação final do artigo publicado. Revelações dos Autores de PotenciaisConflitos de Interesse: Na submissão do manuscrito, todos os autores completaram o formulário de Revelações de Potenciais Conflitos de Interesse. Potenciais conflitos de interesse: Emprego ou Liderança: E.P. Diamandis, Clinical Chemistry, AACC. Consultor ou Papel Consultivo: H.I. Scher, Veridex, Johnson & Johnson, and Ortho Biotech; L. Terstappen, Johnson & Johnson. Posse dos Valores: H.I. Scher, Johnson & Johnson. Honorários: K. Pantel, Veridex, Roche, Novartis, and Amgen. Fundo de Pesquisas: K. Pantel, Veridex; H.I. Scher, Ortho Biotech; L. Terstappen, Johnson & Johnson. Testemunho Hábil: Nada a declarar. Papel do Patrocinador: As organizações patrocinadoras não desempenharam papel algum no design do estudo, escolha dos pacientes inscritos, revisão e interpretação dos dados, ou preparação ou aprovação do manuscrito. Recebido para publicação em 19 de Abril de Aceito para publicação em 25 de Abril de The American Association for Clinical Chemistry This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. The views presented are those of the authors and not necessarily those of the AACC or the Journal. Reprinted from Clin Chem, 2011; 57 no , by permission of AACC. Original copyright 2011 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing this article, please refer to the original English publication source in the journal, Clinical Chemistry. Este artigo foi traduzido com a permissão da AACC. AACC não é responsável pela acurácia da tradução. Os pontos de vista apresentados são aqueles dos autores e não necessariamente os da AACC ou do Jornal. Reimpresso da ClinChem, 2011; 57 no , por permissão da AACC. Cópia original 2011 American Association for Clinical Chemistry, Inc. Quando citar este artigo, por favor refira-se à fonte de publicação original em inglês na revista,clinical Chemistry.