Avaliação da expressão de fher2 em tumores mamários felinos e sua correlação com variáveis clinicopatológicas

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1 RPCV (2012) 107 ( ) REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Avaliação da expressão de fher2 em tumores mamários felinos e sua correlação com variáveis clinicopatológicas Evaluation of fher2 expression in feline mammary tumors and its correlation with clinicopathological features Maria Soares 1, Jorge Correia 2, Sandra Carvalho 2, Fernando Ferreira 1 * 1 CIISA, Departamento de Morfologia e Função, Faculdade de Medicina Veterinária, UTL, Lisboa, Portugal 2 CIISA, Departamento de Sanidade Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, UTL, Lisboa, Portugal Resumo: O recetor para o fator de crescimento epidérmico humano de tipo II (HER2) é uma glicoproteína com reconhecida importância no cancro da mama na mulher, que condiciona o prognóstico e tratamento de um subtipo de tumor mamário, designado por HER2 positivo (HER2+), e cujo papel começa a ser investigado em oncologia felina. Com o objetivo de otimizar a imunodeteção desta proteína em tumores mamários felinos (TMF), verificar a incidência deste subtipo de tumores em gatas e estudar a hipótese desta espécie ser considerada como um modelo em oncologia comparada foram utilizados trinta casos de TMF, sujeitos a dezasseis protocolos de imunohistoquímica diferentes, com variações na recuperação antigénica e no anticorpo utilizado. Os resultados obtidos mostraram diferenças na deteção da proteína fher-2 em função do protocolo utilizado. Não foi encontrada qualquer marcação com os anticorpos SP3 e o TAB250 e o protocolo mais adequado na deteção dos TMFfHER2+ foi o que associou um maior tempo de recuperação antigénica (banho-maria a 95 ºC, 60 minutos) ao anticorpo A0485. Não foram encontradas associações entre os TMFfHER2+ e as características avaliadas (classificação histopatológica do tumor, grau de malignidade, índice de Ki-67, tamanho do tumor, presença de metástases regionais e idade da gata ao diagnóstico), o que é semelhante ao descrito na mulher. As semelhanças encontradas com a mulher para este subtipo de tumor mamário, a par da elevada incidência de TMF-fHER2+ (33,3%) permitem consolidar a gata como um importante modelo em oncologia mamária comparada, abrindo novas perspetivas no diagnóstico e tratamento dos TMF. Summary: The Human Epidermal Growth Factor Receptor type 2 (HER2) is a protein with known importance in women breast cancer, which determines the prognosis and treatment of a unique molecular breast cancer subtypes (HER2+) and its role is starting to be investigated in feline oncology. The aim of the study was to optimize the immunodetection of HER2 in feline mammary tumors (FMT), evaluate the incidence of this subtype of tumor and determine the possibility of this specie being considered as a model for comparative oncology. For that, thirty samples of FMT were used and submitted to sixteen different immunohistochemical protocols, with different antigen retrieval methods and different antibodies. The results showed differences in protein immunodetection, *Correspondência: fernandof@fmv.utl.pt. Tel: + (351) ; Fax: + (351) depending on the protocol used. Thus, there was no staining with SP3 and TAB250 (anti-her2 antibodies) and the best protocol for detection of FMT-fHER2+ was the one that conjugates the longer antigen retrieval method (water bath at 95 ºC for 60 minutes) with the A0485 antibody. No associations were found between FMT-fHER2+ and the characteristics considered (histopathological classification, grade of malignancy, Ki-67 index, tumor size, presence of regional metastases and age at diagnosis), which is similar to what is described in woman. Therefore, the similarities found in this subtype of tumor between the two species, together with the high incidence of FMT-fHER2+ (33.3% of positive cases) allow the consolidation of cat as an important species in comparative oncology and opens new perspectives in the diagnosis of FMT. Introdução Os tumores mamários felinos (TMF) são a terceira neoplasia mais frequente, logo atrás das neoplasias hematopoiéticas e da pele, representando cerca de 17% dos tumores nesta espécie. Ao contrário dos tumores mamários da cadela, na gata, estes tumores são, maioritariamente, malignos (85%) apresentando um prognóstico bastante reservado e um tempo médio de sobrevida muito reduzido - 8 a 12 meses (Lana et al., 2007). Ao exame histopatológico, os TMF apresentam, normalmente, invasão linfática e são geralmente classificados como carcinomas, sendo os mais comuns, os de tipo: cribriforme, tubular, tubulopapilífero e sólido (Lana et al., 2007; Ordás et al., 2007; Burrai et al., 2010; Rasotto et al., 2011). Nas duas últimas décadas, a oncologia humana desenvolveu grandes esforços para encontrar a atual classificação molecular dos tumores mamários. A tipificação molecular é realizada por rotina quer através de técnicas de imunohistoquímica (IHC) quer por técnicas de hibridação in situ fluorescentes ou cromogénicas (FISH - Fluorescence In Situ Hybridization ou CISH - Chromogenic In Situ Hybridization) muito padronizadas e que mostram benefícios relevantes sobretudo na selecção de terapêuticas específicas que 191

2 têm vindo a aumentar o tempo de vida e o período livre de doença das pacientes (Stebbing et al., 2000; Gancberg et al., 2002; Bilous et al., 2003; Sáez et al., 2006; Wolff et al., 2007). Um dos marcadores obrigatoriamente analisado é o recetor para o fator de crescimento epidérmico humano de tipo II (Human Epidermal Growth Factor Receptor-2, HER2), uma glicoproteína pertencente à família dos recetores ativadores de tirosinas cinases, estando a sua sobreexpressão relacionada com o tipo de tumor mamário humano mais agressivo, o HER2 positivo (HER2+). Estas neoplasias apresentam células tumorais com um elevado número de recetores HER2, devido à amplificação funcional do gene HER2 localizado no cromossoma 17 (Ménard et al., 2000; Wolff et al., 2007). A dimerização deste recetor, que está localizado na membrana citoplasmática, conduz à ativação de várias vias de sinalização intranucleares que promovem: a proliferação celular pela via da MAPK (Mitogen-activated protein kinase); a inibição da apoptose pela via da PI3K (phosphoinositide 3-kinase)/Akt; ou a formação de metástases, por subexpressão das adesinas (Ménard et al., 2004; Wolff et al., 2007). Estruturalmente, o HER2 apresenta 3 domínios funcionais: o intracelular, o transmembranar e o extracelular (Carney et al., 2003; Gauchez et al., 2008). Este último tem impulsionado a indústria farmacêutica a desenvolver anticorpos específicos anti-her2 que inibam a dimerização através do seu reconhecimento à superfície da célula. Atualmente, o único anticorpo terapêutico anti-her2 disponível (trastuzumab, Herceptin, Genetech) veio melhorar o tempo de sobrevida das pacientes com tumores HER2+ e as taxas de resposta à quimioterapia (Stebbing et al., 2000). Adicionalmente, os tumores mamários HER2+ são, geralmente, acompanhados de uma co-amplificação do gene da Topoisomerase IIα, fato que justifica a quimioterapia com os inibidores desta enzima (p.ex. doxorubicina, epirubicina) apesar da sua elevada toxicidade. Desta forma se compreende que a análise da expressão do HER2 assuma uma importância capital por condicionar o prognóstico e o tratamento dos tumores mamários nas mulheres (Bhargava et al., 2005; Tanner et al., 2006; Fountzilas et al., 2012). Em medicina veterinária, alguns estudos têm identificado uma sobre-expressão da oncoproteína HER2 em tumores mamários felinos (De Maria et al., 2005; Millanta et al., 2005; Wiston et al., 2005; Ordás et al., 2007; Burrai et al., 2010; Rasotto et al., 2011) levantando a hipótese de existirem tumores mamários fher2+ na gata, provavelmente, semelhantes aos do subtipo HER2+ da mulher. No entanto, as incidências reportadas por estes estudos apresentam valores muito díspares (5,5% a 92,5%). Pensamos que à semelhança dos estudos iniciais realizados na mulher, os valores discrepantes resultem do uso de diferentes protocolos de fixação e/ou de recuperação antigénica e da utilização de diferentes anticorpos anti-her2 pelos diferentes autores. Assim, o nosso estudo surge com o objetivo de padronizar e otimizar a imunodeteção da oncoproteina fher2 testando diferentes protocolos de recuperação antigénica e uma bateria de cinco anticorpos anti-her2, em paralelo, nas mesmas amostras. Adicionalmente, o possível efeito de vários parâmetros clinicopatológicos (idade ao diagnóstico, tamanho do tumor, metastização regional, classificação histopatológica e grau de malignidade e índice de Ki-67) na positividade para a imunomarcação de fher2 foi avaliado. Material e métodos Amostras Foi realizado um estudo retrospectivo com trinta tumores classificados como carcinomas mamários felinos e com um tempo de fixação em formol inferior a 72 horas, pertencentes ao Arquivo de Tecidos do Serviço de Anatomia Patológica, da Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa. Os tumores foram obtidos a partir de trinta gatas que se apresentaram à consulta no Hospital Escolar entre 2009 e A informação clínica foi recolhida por rotina. A classificação histopatológica dos tumores foi realizada por um Médico-Veterinário Patologista com experiência em patologia mamária (JC) e os critérios adotados foram os publicados pela Organização Mundial de Saúde (OMS). Os tumores foram categorizados de grau I ao grau III de malignidade, estabelecido a partir do seu pleomorfismo celular, da formação tubular e do número de mitoses presentes (Elston e Ellis, 1998; Misdorp et al., 1999). Em 21 dos 30 casos foram analisados os linfonodos regionais para pesquisa de metástases regionais. Técnica de imunohistoquímica para fher2 e Ki-67 Para a imunodeteção da glicoproteína de membrana fher2 foram utilizados os seguintes anticorpos primários: um anticorpo policlonal de coelho anti- HER2 (clone A0485 da DAKO, Glostrup, Dinamarca), dois anticorpos monoclonais de coelho anti-her2 (clone 4B5 da Ventana, Arizona, EUA e clone SP3 da Zytomed, Berlim, Alemanha) e dois anticorpos monoclonais de rato anti-her2 (clone CB11 da Zytomed e clone TAB250 da Invitrogen, California, EUA). Para otimizar a imunodeteção do fher2, as amostras foram individualmente submetidas a dezasseis protocolos diferentes, resumidos na Tabela 1. Em todos os protocolos foram usados cortes de tecido com 4 µm de espessura, em lâminas histológicas Starfrost (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) e secos a 60 ºC durante uma hora. Em seguida, os cortes foram desparafinados e reidratados através de 192

3 passagens por xilol e por soluções de álcool, graduadas em concentrações decrescentes, até serem colocados em água destilada. Posteriormente, os tecidos foram submetidos a diferentes procedimentos para recuperação antigénica (Tabela 1): com solução de tampão citrato (NaCH3COO, ph = 6) em panela de pressão (2 atm durante 2 min) ou em banho-maria (95 ºC durante 30 min ou 60 min). Para a imunomarcação com o anticorpo TAB250, na recuperação antigénica foi ainda realizado através de um método enzimático (Protease K, Zymed durante 10 min) aconselhado em estudos prévios (O'Malley et al., 2001; Thomson et al., 2001). Seguiu-se o bloqueio da peroxidase endógena (solução de bloqueio de peroxidase, Zytomed, durante 10 min), a incubação das amostras com o anticorpo primário a testar durante uma hora à temperatura ambiente e, finalmente, a incubação com o anticorpo secundário durante 30 min (HER2easy kit IHC, Zytomed). Entre todos os passos foram realizadas lavagens com solução de tampão fosfato salino (PBS). Como sistema de deteção foi utilizado o cromogéneo 3,3 -Diaminobenzidinatetrahidroclorido (DAB, DAKO), seguido de uma coloração com hematoxilina de Mayer. Controlos positivos e negativos foram usados em cada protocolo, sendo que o controlo positivo foi obtido a partir de blocos contendo tecido de carcinoma mamário humano com sobre-expressão de HER2 e previamente classificado como 3+ e o controlo negativo obtido a partir de carcinoma mamário humano sem sobreexpressão de HER2, previamente classificado como 0 (ver Critérios de Interpretação). Em paralelo, foi usado um controlo negativo suplementar com IgG de coelho (Abcam, Cambridge, RU) ou IgG de rato (DAKO), incubados durante 60 minutos em substituição e na mesma diluição do anticorpo primário anti-her2 correspondente. Para a avaliação do Ki-67 foram realizados cortes com 4 µm de espessura que foram colhidos para lâminas histológicas Starfrost e secos a 60 ºC durante uma hora. O protocolo de imunohistoquímica utilizado foi idêntico ao já descrito, com utilização da panela de pressão (a 2 atmosferas durante 2 minutos) para recuperação antigénica e incubação do anticorpo primário (clone MM1, Novocastra, Newcastle, UK) durante uma hora à temperatura ambiente, utilizando uma diluição de 1:1000. Como controlo positivo e negativo foram utilizados cortes de tonsilas de cão. Critérios de interpretação Foram seguidas as diretrizes da DAKO para a classificação da imunomarcação do HER2 (DAKO, 1999) onde: 0, corresponde a ausência de marcação; 1+, corresponde a uma marcação membranar incompleta e de fraca intensidade, em qualquer proporção de células tumorais; 2+, é definido como uma marcação membranar completa das células tumorais, com intensidade não uniforme ou fraca mas incluindo, no mínimo, 10% das células neoplásicas presentes no fragmento corado e, finalmente, 3+, quando há uma marcação membranar uniforme e de intensidade forte em pelo menos 10% das células neoplásicas. Assim, as amostras analisadas foram consideradas fher2 positivas (fher2+) quando classificadas como 2+ ou 3+ e fher2 negativas (fher2-) quando 0 ou 1+. A marcação citoplasmática foi considerada como não específica. Todas as lâminas foram sujeitas a uma classificação independente e cega por parte de um Médico-Veterinário Patologista (JC) e dois Médico- Veterinários (MS e FF). As classificações discordantes foram discutidas, utilizando um microscópio multi-ocular. O índice Ki-67 reflete o quociente entre o número de células tumorais marcadas pelo anticorpo anti-ki- 67 e de células tumorais não marcadas (coradas com hematoxilina) em 1000 células avaliadas. Foram consideradas positivas as células tumorais com marcação nuclear. Para a contagem celular foram usados campos de visualização com ampliação de 400x (Yerushalmi et al., 2010; Rasotto et al., 2011). Análise de resultados Na análise estatística dos resultados foi utilizado o sistema operativo IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM, Nova Iorque, EUA). Para avaliar o efeito do índice Ki- 67 (por comparação de médias) e da idade dos animais ao diagnóstico na classificação do fher2, foi utilizado Tabela 1 - Resumo dos protocolos imunohistoquímicos utilizados na deteção do fher2 Anticorpo primário Recuperação antigénica Clone Diluição Tempo de incubação CB11 Pré-diluído 60 min Banho-maria a 95 ºC durante 30 min, solução-tampão de citrato (ph = 6) 4B5 Pré-diluído 60 min A0485 1:250 1: min Banho-maria a 95 ºC durante 30 min, solução-tampão de citrato (ph = 6) SP3 1: min Panela de pressão a 2 atm durante 2 min, solução-tampão de citrato (ph = 6) TAB250 1:50 60 min Banho-maria a 95 ºC durante 30 min, solução-tampão de citrato (ph = 6) Banho-maria a 95 ºC durante 60 min, solução-tampão de citrato (ph = 6) 1:250 Panela de pressão a 2 atm durante 2 min, solução-tampão de citrato (ph = 6) Proteinase K durante 10 min 193

4 o teste de t de Student após verificação dos pressupostos de normalidade e variância pelos testes de Shapiro-Wilk e de Lavene. Uma vez que a amostra não respeitava os pressupostos de normalidade quando avaliado o tamanho da massa tumoral, foi utilizado o Teste de Mann Whitney U para determinação do efeito do tamanho do tumor na classificação do fher2. A associação entre a sobre-expressão do fher2 e o grau de malignidade, a classificação histológica e a presença de metástases regionais nos linfonodos foi calculada pelo teste Exato de Fisher. Em todos os testes foi considerando um nível de significância de 0,05. Resultados A idade média das gatas à altura do diagnóstico foi de 10,4 anos com um intervalo de idades entre os 5 e os 14 anos. Os trinta tumores analisados apresentaram um tamanho médio de 2,43 cm (intervalo entre 0,2-6 cm). Após exame histopatológico, 36,7% dos tumores foram classificados como carcinomas cribriformes (n=11), 30% como carcinomas tubulo-papilíferos (n = 9) e 23,3% como carcinomas tubulares (n = 7). Foram ainda observados um carcinoma sólido, um carcinoma mucinoso e um carcinoma das células escamosas. Relativamente ao grau de malignidade verificou-se que 73,3% (n = 22) dos tumores apresentava grau de malignidade III, 23,3% (n = 7) o grau II e, por fim, 3,3% (n = 1) o grau I. Dos 21 linfonodos avaliados, cerca de 43% apresentavam lesões infiltrativas por células neoplásicas. Relativamente à imunomarcação do fher2, os anticorpos CB11, 4B5 e A0485 mostraram marcação membranar específica, confirmando uma reatividade cruzada interespécie, enquanto que os anticorpos TAB250 e SP3 não apresentaram qualquer marcação independentemente do protocolo usado. Os controlos positivos e negativos apresentaram as classificações esperadas (3+ e 0, respetivamente), enquanto os controlos adicionais com soro de coelho e de rato confirmaram a especificidade da marcação em tecidos de gata (Figura 1). Dos vários protocolos testados, o protocolo com um maior tempo de recuperação antigénica (banho-maria a 95 ºC durante 60 minutos) seguido da imunodeteção com o anticorpo A0485 foi o que mostrou melhores resultados com 33,3% dos tumores a serem classificados como fher2+ (n = 10, 4 casos classificados como 3+ e 6 como 2+). Por outro lado, o método da panela de pressão foi a técnica mais eficaz na deteção do fher2 quando os anticorpos CB11 (26,7% de TMFfHER2+) ou 4B5 (20% de TMF-fHER2+) foram usados (Tabela 2 e Figura 1). De salientar que apenas o anticorpo 4B5 apresentou uma marcação citoplasmática inespecífica. O índice Ki-67 nas amostras tumorais felinas mostrou uma média de 30% e um intervalo de valores Figura 1 - Deteção do fher2 e do Ki-67 em tumores mamários de gata. (A) Marcação de HER2 em controlo positivo humano classificado como 3+ (400x). (B) Controlo negativo com IgG de Coelho após recuperação antigénica (400x). (C) Expressão de fher2 em carcinoma cribriforme felino após RA com o anticorpo CB11 (classificação 0) (400x). (D) Expressão de fher2 em carcinoma cribriforme felino após RA com o anticorpo A0485 (classificação 1) (400x). (E) Expressão de fher2 num carcinoma tubular, classificado com 1+ após RA e incubação com o anticorpo 4B5. De notar a marcação citoplasmática inespecífica (400x). (F) Expressão de fher2 num carcinoma tubulo-papilífero com classificação 3+ após RA em banho-maria a 95 ºC durante 60 minutos e incubação com o anticorpo A0485 (400x). (G) Marcação nuclear específica de Ki-67 em carcinoma cribriforme fher2- (400x) e em carcinoma cribriforme fher2+ (H) (400x); RA Recuperação Antigénica. entre os 5% e os 56%. A intensidade da marcação variou entre moderada a forte e os controlos mostraram os resultados esperados (Figura 1, G e H). A associação entre as variáveis clinicopatológicas estudadas e a classificação do fher2 após recuperação antigénica em banho-maria a 95 ºC durante 60 minutos e a imunomarcação com o anticorpo A0485 estão sumarizadas na Tabela 3 (idade ao diagnóstico, tamanho do tumor, índice Ki-67) e na Tabela 4 (classificação histopatológica, grau de malignidade e presença de metástases nos linfonodos regionais). A análise estatística não demonstrou diferenças significativas (p<0,05) entre o grupo de TMF-fHER2- e o grupo TMF-fHER

5 Tabela 2 - Frequências de tumores mamários felinos de acordo com as classificações do fher2 obtidas após o uso de diferentes protocolos de recuperação antigénica e de diferentes anticorpos anti-her2 Classificação fher TOTAL Anticorpo / Método de RA RA 30 min 24 (80%) 6 (20%) 0 (0%) 0 (0%) CB11 RA 60 min 18 (60%) 10 (33,3%) 2 (6,7%) 0 (0%) PP 9 (30%) 13 (43,3%) 6 (20%) 2 (6,7%) RA 30 min 23 (76,7%) 6 (20%) 1 (3,3%) 0 (0%) 4B5 RA 60 min 15 (50%) 10 (33,3%) 5 (16,7%) 0 (0%) PP 16 (53,3%) 8 (26,7%) 4 (13,3%) 2 (6,7%) 30 (100%) A0485 RA 30 min 16 (53,3%) 5 (16,7%) 8 (26,7%) 1 (3,3%) RA 60 min 15 (50%) 5 (16,7%) 6 (20%) 4 (13,3%) PP 6 (20%) 16 (53,3%) 5 (16,7%) 3 (10%) RA 30 min Recuperação antigénica em banho-maria a 95 ºC durante 30 minutos; RA 60 min Recuperação antigénica em banho-maria a 95 ºC durante 60 minutos; PP Panela de pressão (2 atm durante 2 min). Tabela 3 - Efeito da idade ao diagnóstico, do tamanho do tumor, do índice Ki-67 e o nível de expressão do fher2 em tumores mamários felinos TMF-fHER2 TMF-fHER2+ p (n = 20) (n=10) Idade (Anos) Média (±EPM; min-máx) 10,75 (±0,52; 6-14) 9,7 (±0,83; 5-13) 0,275 Tamanho do tumor (cm) Média (±EPM; min-máx) 2,27 (±0,3; 0,2-5) 2,78 (±0,43; 1-6) 0,350 Índice Ki-67 (%) Média (±EPM; min-máx) 32,5 (±3; 5-56) 24 (±4,7; 7-47) 0,123 EPM=erro padrão da média Tabela 4 - Associação entre a classificação histológica, o grau de malignidade, a metastização nos linfonodos regionais e o nível de expressão do fher2 em tumores mamários felinos TMF-fHER2- TMF-fHER2+ p Classificação histopatológica n=20 (%) n=10 (%) Cribriforme 8 (40%) 3 (30%) 0,57 Tubulo-papilífero 5 (25%) 2 (20%) Tubular 6 (30%) 3 (30%) Sólido 1 (5%) 0 (0%) Mucinoso 0 (0%) 1 (10%) Escamoso 0 (0%) 1 (10%) Grau de malignidade n (%) n (%) I 0 (0%) 1 (10%) 0,17 II 6 (30%) 1 (10%) III 14 (70%) 8 (80%) Linfonodos n = 13 (%) n = 8 (%) Sem metástases 8 (61,5%) 4 (50%) 0,67 Com metástases 5 (38,5%) 4 (50%) 195

6 Discussão O nosso estudo apresentava como objetivo principal a otimização do protocolo de imunodeteção do fher2 em amostras parafinadas de tumores mamários felinos. Para tal procurámos seguir as linhas de orientação da Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO) e da DAKO, sobretudo no que concerne ao tempo de fixação dos tecidos e aos critérios de interpretação, fatores críticos para a correta deteção e quantificação da proteína HER2 (Bilous et al., 2007; Oyama et al., 2007; Wolff et al., 2007). Desta forma, foi avaliada uma bateria de protocolos onde se fizeram variar o método de recuperação antigénica e/ou o anticorpo primário utilizado. O número de TMF com sobreexpressão do fher2 variou consideravelmente consoante o anticorpo e o método usado (0% - 33,3%). De facto, dois dos anticorpos anti-her2 testados (TAB250 e SP3) não mostraram reconhecer o fher2, o que poderá dever-se ao facto dos tecidos terem sido fixados em formol não tamponado que induz alterações conformacionais no domínio extracelular do recetor, impedindo que seja reconhecido por anticorpos que reconheçam esta porção da proteína (O Malley et al., 2001; Ricardo et al., 2007). Adicionalmente, estes resultados podem encontrar explicação no fato dos anticorpos comerciais anti- HER2 serem dirigidos contra a proteína HER2 humana que apresenta uma homologia de sequência aminoacídica de 93% quando comparada com a proteína fher2. Assim, poderá acontecer que a porção reconhecida por estes dois anticorpos não seja totalmente homóloga e, que portanto, a proteína felina não seja reconhecida independentemente do protocolo utilizado. Relativamente aos três anticorpos que reconheceram a oncoproteína fher2, foi o anticorpo A0485 que apresentou melhores resultados, conseguindo detetar sobre-expressão do fher2 em 33,3% dos TMF analisados, seguindo-se o anticorpo CB11 e o 4B5 com 26,7 e 20% de casos positivos, respetivamente, valores próximos aos publicados por De Maria et al. (2005) (n=40, 39% TMF-fHER2+) e Ordás et al. (2007) (n=30, 40% TMF-fHER2+). De salientar que dois outros trabalhos apresentaram resultados bastante díspares; os valores mais baixos até agora reportados (Rasotto et al. (2010), n=73, 5,5% TMF-fHER2+) utilizaram tempos de incubação do anticorpo primário muito reduzidos (18 min) e o estudo que aponta para uma elevada incidência da sobre-expressão do fher2 em TMF (90%, n=30) utilizou critérios de interpretação diferentes dos aprovados pela DAKO e pela ASCO, o que poderá ter aumentado significativamente o limiar de positividade (Wiston et al., 2005). Assim, os nossos resultados apontam para que o anticorpo A0485 seja o mais adequado na deteção da proteína fher2 em amostras parafinadas de gata, à semelhança daquilo que está descrito para os tecidos mamários de mulher (Lebeau et al., 2001; O'Malley et al., 2001; Thomson et al., 2001; Schrohl et al., 2011), sobretudo se associado a um maior tempo de recuperação antigénica (60 minutos em banho-maria a 95 ºC). Alternativamente, o anticorpo CB11 quando combinado com o método de recuperação antigénica que usa a panela de pressão, também permite uma boa imunodeteção do fher2. A maioria dos tumores avaliados apresentava um elevado índice de Ki-67, com uma média de 30%, o que salienta o comportamento agressivo destas neoplasias. De facto, a proteína Ki-67 é essencial à divisão celular, atingindo o seu pico de expressão durante a mitose, pelo que um maior índice tem sido associado, em Medicina Humana e mais recentemente em Medicina Veterinária, a um pior prognóstico e, consequentemente, a tumores mais agressivos (Harris et al., 2007; Yerushalmi et al., 2010; Santos et al., 2013). Após a análise estatística dos resultados não encontrámos qualquer diferença entre as variáveis clinicopatológicas avaliadas e a sobre-expressão do fher2+ nos tumores mamários analisados, resultados que são concordantes com estudos anteriores (Millanta et al., 2005; Rasotto et al., 2010). A presença de metástases regionais também não se correlacionou de forma significativa com nenhum dos grupos de tumores (TMF-fHER2+ e TMF-fHER2-). Também na mulher, os tumores HER2+ não mostram qualquer correlação com as diferentes variáveis clinicopatológicas (Stuart e Schnitt, 2001; Wolff et al., 2007; Farzadnia et al., 2007; Adly et al., 2010), levantado a hipótese da gata ser utilizada como modelo. Desta forma, pensamos que novos estudos que permitam compreender os mecanismos oncogénicos destes tumores são fundamentais de forma a abrir portas a novos métodos de diagnóstico e a tratamentos mais dirigidos. Agradecimentos Os autores agradecem à FCT (SFRH/BD/70720/- 2010), ao Serviço de Anatomia Patológica do Instituto Português de Oncologia e à Dra. Joana Rita Teixeira, da Escola Superior de Saúde Egas Moniz. Bibliografia Adly S, Hewedi IH, Mokhtar NM (2010). Clinicopathologic significance of molecular classification of breast cancer: relation to Nottingham prognosis index. Journal of the Egyptian Nat Cancer Inst, 22(4), Bhargava R, Lal P, Chen B (2005). 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