III Oficina Hemobrás Controle de Qualidade

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1 Dosagem de Fator VIII Técnicas disponíveis: vantagens, desvantagens e custos Desenvolvimento e avaliação da curva de calibração Controle de Qualidade Interno. III Oficina Hemobrás Controle de Qualidade

2 Indicações -PFC É uma fonte não concentrada de todos os fatores de coagulação. Correção de sangramento secundário às deficiências de fatores de coagulação para os quais a reposição do fator específico é inviável. Estados de deficiência de múltiplos fatores (ex.: tranfusão maciça; coagulação intravascular disseminada CIVD; falência hepática).

3 Preparo Formas de obtenção A partir do sangue total Única centrifugação Duas centrifugações pesada CH; PFC leve e pesada CH; CP; PFC Volume médio de cada unidade de PFC : 225 ml (sem produção de plaquetas) Aférese Volume entre 400 e 600 ml

4 Rotulagem do Plasma Plasma fresco congelado (PFC) - Separação do plasma 6 horas - Congelamento completo 8 horas Plasma fresco congelado (PFC24) - Separação do plasma 8 a 24 horas - Congelamento completo em até 2 horas Portaria MS n o de 13 de junho de 2011 Plasma obtido por aférese - Congelamento imediato após obtenção

5 Importante O resfriamento rápido do sangue total a 22 ± 2 o C protege o FVIII O processo de congelamento deve ser validado A temperatura no core da bolsa deve chegar a -30 o C no menor tempo possível Freezers de ultra baixa temperatura congelamento entre 30 min. a 1h30 Freezer - 80 o C (2 horas ou mais) DE 2011 RIA Nº 1353 DE 13 DE JUNHO

6 Congelamento - Efeito sobre o PFC Congelamento rápido aumenta a recuperação de FVIII no plasma descongelado, comparado ao congelamento mais lento. Congelamento rápido (-40 o C, <40 min): perda de cerca de 8% FVIII do pré para o pós-congelamento; 9% de aumento em beta-tg (lise plaquetária) mas sem significado estatístico Congelamento lento, (-40 o C): 14% de perda do FVIII; a taxa de congelamento é mais importante que a temperatura final. Congelamento lento (-20 o C): 20% de perda do FVIII; 8% de perda do FV; 14% de aumento em beta-tg Nenhuma diferença entre congelamento lento e rápido para o FVII, vwf, fibrina solúvel, complexo TAT, C 1 -esterase inhibitor (Akerblom, et al, 1992) Em locais onde há a possibilidade do congelamento ser realizado em equipamentos distintos, deve ser garantida a rastreabilidade das unidades congeladas em cada equipamento disponível.

7 Factor VIII Recovery in FFP Affected by Freezing Rate (Carlebjork, et al, 1986)

8 Tempo entre Coleta e Congelamento do Plasma Produção de Hemoderivados * Para processo validado e conduzido sob boas práticas de produção

9 Padrões da Qualidade Qualidade do plasma é um termo relativo e está relacionada à intenção de uso componente. PFC para transfusão Plasma para produção de hemoderivados - lábeis (fatores de coagulação) - não lábeis (proteínas estáveis - não injetáveis O controle da qualidade do plasma deve ser conduzido de forma a gerar informações que atestem a qualidade do hemocomponente O Fator VIII:C historicamente é um forte indicador da qualidade do plasma por apresentar as seguintes caracterísitcas: Ser o fator mais lábill Interesse comercial na obtenção de plasma com elevada recuperação desse fator para a terapêutica de hemofílicos A

10 Fatores que afetam a qualidade do plasma Coleta Técnica de coleta do sangue Mistura adequada do anticoagulante com o plasma, para evitar a ativação do processo de coagulação Anticoagulante: CPD ou ACD Há controvérsia se a coleta em ACD resulta num produto com menor ativiade de FVIII As diferenças observadas na atividade das proteínas plasmáticas ocorrem ao longo do tempo em plasma estocado a 6 o C Temperatura de armazenamento do sangue total Há ativação da coagulação pelo frio. O FVII, FVIII e FvW podem ser reduzidos significativamente Portanto, unidades de sangue total mantidas a temperatura ambiente até o processamento, garantem melhor recuperação da atividade de Fator VIII no PFC/PFC24.

11 Contato do Plasma com Componentes Celulares e Ativação da Coagulação pelo Frio Experimento: 39 doadores sangue total coletado em tubos com citrato 3,2% I. Alíquotas centrifugadas imediatamente e congeladas a 80 o C II. Alíquotas mantidas a 4 o C, 3.5 h III. Alíqotas do sangue total mantidas a 22 o C, 3.5 h Plasma posteriormente separado para dosagens de FII, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, vwf:ag, vwf:cb Resultado: Nenhum efeito da temperatura sobre FII, V, VII, IX, X, XI, XII No plasma obtido do sangue total mantido a 4 o C, 3.5 h: Perda de 25% do FVIII Perda de 50% a 60% do FvW (Favaloro, 2004) Verdadeiro para o plasma do sangue coletado em CPD ou ACD O tempo de contato do plasma com as células, bem como a temperatura de armazenamento antes do processamento, impactam na recuperação do FVIII no PFC24.

12 Temperatura de Armazenamento do ST Coagulation factor content of plasma produced from whole blood stored for 24 hours at ambient temperature: results from an international multicenter BEST Collaborative study. Queda de 23% da atividade do FVIII no PFC24 Níveis superiores a 0,50 UI/ml em 100% das unidades Cardigan et al. Transfusion 2011; 51 Suppl 1:50S-57S The quality of fresh-frozen plasma produced from whole blood stored at 4 degrees C overnight. Queda de 23% da atividade do FVIII no PFC24 Níveis superiores a 0,50 UI/ml em 87% das unidades Cardigan et al. Transfusion 2005; 45(8):1342-8

13 Levels of factor VIII and factor IX in fresh-frozen plasma produced from whole blood stored at 4 C overnight in Turkey Fator VIII níveis 25% menores quando comparados ao PFC congelado em até 8 horas Neval et al. Blood Transfus ; 10(2):

14 Fatores que afetam a qualidade do plasma Presença de células em contato com o plasma Podem causar reações imunológicas e liberar enzimas proteolíticas capazes de diminuir a atividade dos fatores de coagulação. Portanto, são parâmetros de inspeção da qualidade. Portaria MS n o de 13 de junho de 2011 Os fatores de coagulação, os inibidores e outros componentes podem sofrer alteração ao longo do tempo, tornando-se proteolizados, agregados, ativados ou inativados no plasma líquido.

15 Efeito da Temperatura de Armazenamento sobre o Fator VIII Alíquotas de 5 ml de plasma obtido por aférese Congelamento e estoque a -74 o C (x) Congelamento e estoque a - 24 o C (o) (Woodhams et al, 2001) Controle da Qualidade do PFC Dosagem de FVIII 30 dias após a produção reflete melhor as características dos processos de produção e congelamento e possibilita a rápida ação quando identificadas não conformidades.

16 Portaria MS n o de 13 de junho de 2011 Requisitos legais - Controle da Qualidade Plasma Fresco Congelado (PFC) Casuística Volume - 100% da produção Demais parâmetros mínimo de 04 unidades mensais ou 1% da produção (o que for maior) Conformidade esperada Igual ou superior a 75% (para cada parâmetro avaliado)

17 Portaria MS n o de 13 de junho de 2011 Parâmetros da Qualidade Fator VIII:C* 70% de atividade presente no PFC pré-congelamento Fator V 70% de atividade presente no TTPa Até o valor do pool controle + 20% Volume 150ml (todas as unidades) *Deve ser o teste obrigatório caso a instituição tenha o objetivo de enviar o PFC para processamento industrial.

18 Análise do PFC Composta de 03 fases Fase pré analítica: obtenção da amostra + transporte ao laboratório + conservação da amostra em caso de não processamento imediato Fase analítica: preparo da amostra para análise + preparo dos reagentes, cuidados com o armazenamento dos reagentes e controles, validação dos reagentes e controles, validação dos equipamentos, comparação entre os diferentes equipamentos Fase pós analítica: análise do resultado

19 Variáveis pré-analíticas Influências Qualidade da coleta da amostra (sangue total / PFC) Processamento (armazenamento do ST /conteúdo celular final do PFC) Estoque das amostras /bolsas Não devem ser avaliadas Unidades que foram transportadas ou armazenadas de forma inadequada Unidades que após o descongelamento estiverem hemolisadas, lipêmicas, com presença de coágulo ou fibrina Controle sobre o transporte ao recebimento as unidades devem estar completamente congeladas Controle sobre o armazenamento dentro do laboratório de CQ Registro de temperatura (atual máxima mínima) / gráfico de registro contínuo de temperatura

20 Problemas Comuns na Coleta INADEQUAÇÃO CONSEQUÊNCIA COMENTÁRIO Agitação excessiva e vigorosa Hemólise TP / TTP falsamente encurtado TP / TTP falsamente encurtado Hemólise e ativação plaquetária que deflagram o início da cascata de coagulação Rejeitar a amostra Falha na mistura da amostra após coleta Estoque inadequado (temperatura /tempo) TP / TTP falsamente prolongado TP / TTP falsamente prolongado Formação de coágulos - sangue e anticoagulante não se misturam Seguir recomendações de estoque Resfriar a amostra em refrigerador ou gelo TP falsamente encurtado Frio (4 o C) promove a ativação do Fator VII

21 Parâmetros de Análise - PFC Volume Vol. (ml) = peso da bolsa com plasma(g) peso da bolsa vazia(g) densidade do plasma (g/dl) Densidade - Padrão de literatura (1,026 g/dl) - Padrão determinado pelo laboratório (opcional) Deve ser verificado apenas se a unidade de PFC não foi previamente analisada quanto ao residual de células no précongelamento.

22 Descongelamento do PFC Variáveis que afetam o tempo de descongelamento Temperatura inicial do banho-maria (37 1 o C ) Caracterísiticas do banho maria - Capacidades de manutenção da temperatura durante descongelamento - Presença ou ausência de mecanismo de homogeneização das bolsas fluxo de água braço mecânico Forma de descongelamento - Protegido ou não por saco plástico - Massageamento e deslocamento das bolsas pelo analista - Quantidade de bolsas descongeladas simultaneamente - Volume das unidades Descongelamento alternativo: microondas específico

23 Descongelamento do PFC Recomendações Não exceder 20 minutos da permanência do PFC no banho A exposição prolongada do PFC a temperaturas próximas a 37 o C propicia perda de atividade do Fator VIII 10 minutos descongelamento total ou parcial + 05 minutos adicionais - com massageamento/deslocamento completo degelo + 05 minutos adicionais - Descongelamento completo das unidades com volumes maiores IMPORTANTE: monitorar o tempo de descongelamento com timer, se possível, para garantir total atenção a este passo.

24 Parâmetros de Análise - PFC Inspeção visual pós-descongelamento Avaliar presença de: - Lipemia - Hemólise - Coloração amarelada / esverdeada - Fibrina / coágulo Sinalizadores - Ativação da cascata da coagulação - Presença de substâncias cujo papel na transfusão ainda não está bem definido - Podem contra indicar a realização de testes de coagulação

25 Amostras Aliquotagem Feita em sistema aberto (coleta destrutiva) Homogeneização é necessária, porém não deve excessiva e nem vigorosa Transferência das amostras para tubos: plástico (polipropileno) ou vidro siliconizado Obs.: Para testes manuais o vidro facilita a identificação mais precisa do início de formação do coágulo, feita contra uma fonte luminosa (negatoscópio) Preservação (2 o C a 6 o C até análise) Tempo transcorrido entre o descongelamento Recomenda-se análise em no máximo 2 horas

26 Dosagem de Fator VIII - Considerações Posicionamento da instituição Auto suficiência para realizar a dosagem de Fator VIII? - Seleção da metodologia Terceirização / Parceiras? Ao planejar a realização dos testes pelo laboratório de controle da qualidade, é importante estimar o número de amostras que serão testadas mensalmente para: Avaliar o custo-benefício da implantação Definir plano de aquisição para equipamento e / ou insumos necessários. Definir estratégia de centralização dos testes para minimizar custos

27 Plasma Plasma Fresco Congelado Fresco Congelado Automação x Testes Manuais Automação Manual Seleção dos pontos da curva Determinada pelo software do equipamento Livre Construção da curva Realizada pelo equipamento Realizada pelo operador Papel log-log Planilha do excel Definição da faixa de linearidade Coelficiente de correlação (R 2 ) Identificação de resultados fora da faixa linear do teste Determinada pelo software do equipamento com liberação de flags Determinado pelo equipamento Gerados flags (alertas) pelo equipamento Idenficação da linearidade feita pelo operador, assim como a identificação dos resultados fora da faixa de linearidade Determinado pelo operador Identificação dependente do operados Coeficiente de variação 20% podendo chegar a 10% Superior a 20%? Habilidade técnica Acuidade visual

28 Fator VIII Proteína de fase aguda da coagulação, que pode estar elevada em determinadas situações onde há dano tecidual, inflamação ou stress. Síntese feita no fígado Atua na fase inicial da via intrínseca da coagulação É o componente mais termolábil da coagulação A diminuição plasmática de seus níveis pode indicar Hemofilia A Hemofilia adquirida É o marcador definido para avaliar a qualidade do plasma que será enviado para processamento industrial

29 Teste de Dois Estágios O ensaio consiste nas seguintes fases Estágio 1 deflaglação da produção do Fator Xa em quantidade proporcional à quantidade de FVIII existente na amostra teste Estágio 2 quantificação do Fxa para indiretamente deduzir o nível de FVIII Reagentes Soro ativado, Fator V, plasma teste absorvido com Al(OH) 3 ; plasma normal; CaCl2 e fosfolipídios Coeficiente de variação menor que o da técnica de 1 estágio Pouco utilzado atualmente Substituído em muitos casos pelo ensaio cromogênico Execução: manual ou automação

30 Dosagem de Fator VIII Ensaio cromogênico A metodologia cromogênica tem como elemento crucial a utilização de uma substância produtora de cor, denominada cromóforo. Os cromóforos tradicionalmente usados (ex.: S-2765) têm um pico de adsorção óptica a 405 nm. O método cromogênico é recomendado para o diagnóstico de hemofilia devido a sua melhor reprodutibilidade quanto ao limite inferior da curva (baixa atividade) Não depende de substrato deficiente de fator, eliminado assim, possíveis interferências de fator VIII residual. Não sofre influência dos reagentes utilizados, como acontece com o método coagulométrico de um estágio. Execução: manual ou automação Custo mais alto que o do teste coagulométrico Método de referência para determinação dos níveis de FVIII em concenrados (European harmacopoeia e ISTH Subcommittee for FVIII and F IX)

31 Método cromogênico para determinação da atividade de Fator VIII A amostra teste (plasma) é incubada com cálcio, fosfolipídio e grande quantidade dos fatoeres IX e X purificados. O Fator X ativado (Xa) gerado pela reação hidrolisa o substrato cromogênico. Essa reação gera um produto colorido que é medido por espectrofotometria. A quantidade de Fator Xa é diretamente proporcional à atividade do Fator VIII.

32 Teste Coagulométrico - Um Estágio O método de um estágio é uma modificação do teste de TTPa Baseia-se na habilidade da amostra-teste (diluída), de encurtar o tempo de coagulação em um meio que contém: - Plasma deficiente em fator VIII (substrato) e rico nos demais fatores - Reagente para TTPa (fosfolipídio + ativador de contato: caolim) e cálcio. Devido a todos os fatores estarem em excesso no plasma deficiente, em relação ao fator VIII, o tempo de coagulação desta mistura é afetado pela atividade do fator VIII da amostra testada. O nível de atividade do FVIII no plasma analisado correlaciona-se com a extensão da correção do TTPa. A atividade é calculada mediante comparação da correção produzida pelo plasma em teste com a correção produzida por várias diluições do plasma referência(curva de calibração)

33 Teste Coagulométrico de Um Estágio Se o equipamento identifica a formação do coágulo pela densidade óptica, amostras com turbidez (hiperlipidemia, hiperbilirrubinemia) podem gerar resultados de TTPa falsamente elevados. Teste mais utilizado na rotina clínica / controle da qualidade do PFC Este método está sujeito a: Todas as variáveis pré-analíticas que afetam o TTPa Variações na metodologia (diferentes fontes de fosfolipídios ou de plasma deficiente em FVIII) Desempenho do equipamento. Coeficiene de variação entre laboratórios: 20 30% No mesmo laboratório é desejável manter a variação inferior a 10%

34 Considerações Gerais - Reagentes Reagentes Procedência comercial garante maior padronização e menor variabilidade. Ampla oferta de produtos com resultantes de desempenho distintas Devem passar por qualificação Aquisição e armazenamento Preservar o máximo possível os mesmo lotes na rotina Garantir o armazenamento dentro de faixas de temperatura recomendadas.

35 Considerações Gerais - Reagentes Cuidados especiais Utilizar água reagente conforme especificação do fabricante Usar pipetas calibradas Na reconstituição observar rigorosamente as orientações do fabricante - Tempo de permanência a temperatura ambiente antes da reconstituição - Tempo mínimo de espera para uso após reconstituição - Temperatura do banho-maria para testes manuais (36,5 o C a 38,0 o C) Após reconstituição seguir as recomendações do fabricante quanto à validade e temperatura de armazenamento.

36 Teste de 1 Estágio - Reagentes Amostra Plasma pobre em plaquetas (PPP) contendo menos que 10x10 9 /L plaquetas Ativador de superfície Caolim; sílica micronizada; celite; ácido elágico Deve ser selecionado para assegurar que a reação seja sensível a deficiência s moderadas do Fator VIII (níveis de IU/ml). Fosfolipídio Cefalina para reposição dos fosfolipídios plaquetários Cálcio (em excesso) O cálcio é removido (por quelação) quando o sangue é coletado em citrato de sódio. A recalcificação é necessária para permitir que a coagulação ocorra.

37 Teste de 1 Estágio -Reagentes Plasma de Referência Padrão (calibrador) Possibilita a criação de um padrão de referência de atividade de Fator VIII contra o qual o nível de Fator VIII do plasma teste é comparado, tomando-se como base seu tempo de formação do coágulo. Quando o plasma comercial não está disponível, pode ser utilizado um pool de doadores normais (n=40). Nesse caso, por convenção,admite-se que todos os fatores de coagulação tenham atividade de 100%. Recomenda-se o uso dos padrões de referência comerciais nos quais os níveis de fatores de coagulação são calibrados contra padrões internacionais. Nesse caso seus níveis são apresentados em UI/dl ou UI/ml e não em %. Plasma deficiente em Fator VIII (plasma substrato) Plasma deficiente em Fator VIII (< 1 UI/dL), no qual os demais fatores de coagulação são mantidos em concentrações normais a elevadas. Pode ser adquirido comercialmente ou obtido pela seleção de plasma de paciente hemofílico A grave.

38 Teste de 1 Estágio - Reagentes Importante A sensibilidade de um reagente pode ser específica para uso em um determinado equipamento ou para uso combinado com outros reagentes. Recomendação Todos os reagentes necessários á execução dos testes devem ser do mesmo fabricante para que não haja comprometimento dos resultados. Os reagentes usados em automação devem ser do mesmo fabricante do equipamento e indicados para uso no modelo em questão. Reagentes de outras marcas podem gerar resultados inadequados.

39 Plasma Fresco Congelado Plasma Plasma Fresco Congelado Fresco Congelado CURVA DE CALIBRAÇÃO MÉTODO DE 1 ESTÁGIO Determinação da relação matemática entre o TTPa e a concentração do Fator VIII Construção da curva de calibração para FVIII Reagente necessário: Plasma calibrador (referência) * não usar pool de plasma normal Outros: reagentes para TTPa e Plasma deficiente em Fator VIII Como realizar as diluições o Com o tampão recomendado pela técnica o Partir da diluição inicial definida pelo fabricante o Recomendação: realizar as diluições de forma independente, ou seja, uma a uma Nas diluições seriadas erros pontuais em uma das diluições podem ser propagados para as demais o Utilizar pipetas calibradas

40 Plasma Fresco Congelado Plasma Plasma Fresco Congelado Fresco Congelado CURVA DE CALIBRAÇÃO MÉTODO DE 1 ESTÁGIO Características Quantidade de pontos: no mínimo 4 pontos a no máximo 7 a 8 Pode ser diferente para a primeira curva construída (definição da linearidade) as rotinas seguintes Dependerá dos resultados esperados para as amostras ou população analisada PFC acompanha a curva para valores de normalidade da população Hemofílicos curva diferenciada apresentando abaixo do padrão de normalidade Ex.: 1:2,5 1:5,0 1:10,0 1:20 1:40 1:80 1:160

41 Curva de Calibração Informações essencias Plasma referência: valor de bula para FVIII Ex.: 92% Diluição padrão para o teste implantado (basal) Ex.: 1:5 Definir a quantidade de pontos na curva e realizar as diluições Para cada diluição espera-se um valor teórico de atividade de FVIII, que é calculado a partir da diluição basal e do valor do plasma referência Diluição do Padrão 1:2,5 1:5 1:10 1:20 1:40 Atividade % ,5 A atividade de fator VIII da diluição inicial será correspondente à da bula do calibrador (plasma padrão de referência) O número de pontos da curva pode ser pré-definido pelo equipamento ou usuário

42 Plasma Fresco Congelado Plasma CURVA Plasma DE CALIBRAÇÃO Fresco Congelado Fresco Congelado Análise das diluições : em duplicata e determinação da média dos valores Montagem de um gráfico de dispersão (papel mono-log ou excel) Eixo Y: valores de TTPa (em segundos) Eixo X: porcentagens da atividade de FVIII das diluição utilizadas (logaritmo na base de 10) Traça-se uma linha que melhor se ajuste aos pontos obtidos Essa linha nos permite determinar a atividade% do fator VIII presente no plasma normal, necessária para produzir um determinado valor de TTPa Características esperadas Curva com forma de S, que permite identificar a faixa de linearidade dos resultados (quando usados 7 ou mais pontos). Excluir os pontos extremos e não lineares Coeficiente de correlação (R 2 ) próximo a 1,0 /r 0.99 (ideal)

43 Como a relação entre diluição/concentração e o TTPa é exponencial, se os os pontos forem plotados em papel Log-Lin será obtida uma linha reta.

44 Plasma Fresco Congelado CONTROLE Plasma Plasma DA QUALIDADE Fresco Congelado INTERNO Fresco Congelado Validação da curva de calibração Quando realizar Curva nova: na data da construção Na estocagem da mesma curva: a cada nova data de testes (controle interno) Orientações Devem ser avaliados ao menos dois pontos da curva a cada 8 horas Controle patológico (nível baixo de atividade) Controle normal Para melhor garantia da validação, os controles devem ser de procedência comercial, sempre que possível, devido à sua estabilidade e valor referenciado contra padrão internacional

45 Plasma Fresco Congelado CONTROLE Plasma Plasma DA QUALIDADE Fresco Congelado INTERNO Fresco Congelado Validação da curva de calibração Orientações Os pontos resultantes devem ficar próximos à reta da curva de calibração Os resultados obtidos - Devem estar compreendidos na faixa de especificação da bula dos controles ou - Atenderem às especificações internas do laboratório Se os resultados não forem satisfatórios, analisar possíveis causas e tomar ações corretivas - Limpeza do sistema analítico - Refazer a análise do(s) controle(s) - Substituir os controles (nova reconstitução substituição de lote) - Refazer a curva

46 Controle Interno Na análise pontual dos resultados pode ser utilizado o limite de 2 desvios padrão abaixo e acima da média do lote, como sinalizador de alerta

47 Controle Interno Acompanhamento entre rotinas O grau de dispersão dos resultados frente ao esperado pode indicar tendências de alteração de comportamento do sistema analítico. Recomenda-se que o coeficiente de variação seja igual ou inferior a 10% tanto para o nível normal quanto patológico

48 Análise do PFC Recomendação O descongelamento das amostras / unidades de PFC deve ser feito após a validação da curva / passagem dos controles diários, para minimizar o impacto tempo de espera até a realização da análise.

49 Plasma CONSIDERAÇÕES Fresco Congelado Plasma GERAIS Plasma Fresco TESTES Congelado DE COAGULAÇÃO Fresco Congelado Ensaios para determinação dos fatores de coagulação Sujeitos a grande variação aleatória Portanto o processo de medida deve ser controlado com bastante rigor As curvas de calibração devem ser traçadas de forma diferenciada à de outros ensaios São grandes responsáveis pelos resultados obtidos Curva de calibração para FVIII Recomenda-se a construção de nova curva nas seguintes situações: Todas as vezes que houver mudança do lote do plasma deficiente em FVIII e da cefalina A cada troca do lote do plasma de referência (calibrador) Após manutenção corretiva d equipamento Quando os valores obtidos com os controles ficarem fora da faixa de aceitação mesmo após medidas iniciais de correção serem adotadas Como minimizar a necessidade de construção de novas curvas Política de aquisição de reagentes de mesmo lote capazes de suprir a demanda de testes por períodos extensos. Programa de manutenção preventiva do equipamento Cumprimento aos procedimentos de limpeza. Aplicação das regras de Westgard para auxílio da interpretação dos resultados dos controles internos

50 Análise do PFC Realize o teste de TTPa com a amostra seguindo as recomendações do fabricante do kit / manual do equipamento Importante A diluição deverá obedecer a recomendação do fabricante do plasma deficiente em FVIII, que consta na bula do produto. Para a maioria dos produtos disponíveis no mercado a diluição é 1:5 Utilizando a curva anteriormente construída: Plote o resultado de TTPa obtido no eixo Y (segundos), trace uma linha até que ela encontre a reta e na sequência trace outra até encontrar o eixo X (atividade FVIII %) Identifique qual a atividade da amostra. Automação : não há necessidade de construir a curva ou fazer os cálculos manualmente. Os equipamentos estão programados para executar esses passos. Teste manual: a curva também pode ser feita em papel Log-Lin ou no excel.

51 Plasma Fresco Congelado Amostra pré-teste - Automação: Amostra do PFC não diluída deve ser colocada no equipamento, que então fará a diluição basal pedida pelo teste - Técnica manual: diluir o PFC conforme diluição basal indicada na bula do plasma deficiente em FVIII e prosseguir com a análise conforme técnica adotada Resultados Ex.: Linearidade da curva: 11,5 a 184% Resultado: 89,94% Dentro dos limites da curva Aceitar nesse caso utilizar o valor obtido, sem qualquer correção (multiplicação) Obs.: A diluição basal da amostra (1:5) não deve ser usada nesta situação para corrigir o resultado.

52 Plasma Fresco Congelado Resultados Ex.: Linearidade da curva: 11,5 a 184% Resultado: 206,83% Fora dos dos limites da curva Rejeitar e analisar novamente a amostra após efetuar diluição 1:2 Resultado (amostra diluída 1:2): 90,26%* Esse resultado deverá ser multiplicado por 2 (fator de diluição) 90,26% x 2 = 180,52% Resultado válido: 180,52% Obs.: A diluição basal da amostra (1:5) não deve ser usada nesta situação para corrigir o resultado.

53 Plasma Fresco Congelado Plasma VALIDAÇÃO Plasma DA Fresco METODOLOGIA Congelado Fresco Congelado Automação ou técnica manual Amostras - níveis normal e patológico (alto e baixo) Devem ser usadas amostras estáveis, de preferência mantidas a -80 o C Armazenamento máximo de 14 dias se mantidas a -20 o C Exatidão Proximidade do resultado da medida e do valor verdadeiro Não há padrões para todos os ensaios Melhor opção : ensaios de proficiência Comparação Entre equipamentos / Equipamento x técnica manual Correlação entre o sistema em uso ou referencial e o novo sistema/técnica Identificar inexatidão entre os comparados Premissa da validação: utilização de reagentes do mesmo lote, pois os resultados são muito dependentes dos reagentes

54 Plasma Plasma Fresco Congelado Plasma Fresco Congelado VALIDAÇÃO Fresco DA Congelado METODOLOGIA Automação ou técnica manual Precisão Melhor concordância encontrada em medidas repetidas Pode ser verificada através do desvio padrão ou coeficiente de variação (quanto menor o desvio padrão, maior a precisão. Permite a tomada de decisões imediatas de liberação ou não de um resultado. Controles internos avaliados durante dias - Controle normal (origem comercial) - Controle anormal (origem comercial) - Pool de plasma normal (geralmente preparado no laboratório, isto é, in house) - Plasma de paciente pré-diagnosticado com uma coagulopatia

55 Plasma Plasma Fresco Congelado Plasma Fresco Congelado VALIDAÇÃO Fresco DA Congelado METODOLOGIA Automação ou técnica manual Os resultados dos controles são plotados em um gráfico controle e comparados com os limites aceitáveis de erro para o analito. Quando os valores encontrados na amostra controle estão dentro dos limites aceitáveis, isto é, dentro da média mais ou menos dois desvios-padrão, conclui-se que o método analítico está funcionando adequadamente. De acordo com a Federação mundial de Hemofilia o CV% dos resultados em diferentes dias para TP e TTPa deve ser menor que 8% e, preferencialmente, mais baixo. Para os outros ensaios, tal como dosagem de fatores da coagulação, o CV% pode chegar a 10%.

56 Plasma Fresco Congelado Plasma VALIDAÇÃO Plasma DE Fresco REAGENTES Congelado Fresco Congelado Quando é necessário validar Troca de reagente ou de lote Nova reconstituição de um mesmo lote Reagente crítico ao desempenho do teste Manutenções corretivas com impacto no desempenho do equipamento Validações períodicas Conforme definição da área ou política da instituição Como deve ser feita a validação Para cada tipo de ensaio existe um procedimento específico Para o Fator VIII refazer a curva de calibração

57 Plasma Fresco Congelado Plasma ANÁLISE Plasma DE RESULTADOS Fresco Congelado Fresco Congelado Análise I. Durante os testes Passagem de controles Substituição/ reconstituição de reagentes Observar tendência de resultados Substituição de reagentes Alteração de comportamento do sistema analítico Alteração de condições do descongelamento Temperatura inadequada de armazenamento das amostras préteste Tempo de espera entre descongelamento e análise Características inerentes às amostra s (PFC / PFC24)

58 e Análise de Resultados Laboratório de Controle de Qualidade - Hemocentro de Campinas / Unicamp Controle de Qualidade de Plasma Fresco Congelado Local: Hemocentro de Campinas Período: janeiro 2012 Análise Pós-Descongelamento 0,9% da produção de PFC Tempo de armazenamento até análise - Mínimo: 10 dias e Máximo: 39 dias Data Bolsa N o Tipo DGS Vol F VIII F VIII Respons. Comp. Marca Peso (g) (ABO) (ml) (%) (UI / ml) PFC B ,2 1, PFC A ,2 1, PFC A ,4 0, PFC A ,0 0, PFC A ,4 0, PFC A ,6 0, PFC O ,4 0, PFC A ,4 1, PFC A ,4 1, PFC A ,8 1, PFC O ,5 0, PFC O ,7 0, PFC B ,6 1, PFC A ,5 1, PFC O ,4 0, PFC O ,0 0, PFC A ,6 1, PFC O ,4 0, PFC A ,6 1, PFC O ,5 1, PFC O ,6 1, PFC A ,6 1, PFC A ,5 1, PFC O ,6 0, PFC A ,8 1, PFC A ,4 1, PFC O ,1 0, PFC B ,9 0, PFC A ,8 1, PFC B ,0 0,75 31 Fresenius PFC A ,6 1,10 Andréa O Média * * ,9 1,05 n=31 DP * * 16 27,1 0,27 % Conforme * * 100,0 * 90,30 Máximo * * ,5 1,56 Mínimo * * ,7 0,49 Mediana * * ,2 1,03 Andréa O

59 Análise de Resultados Laboratório de Controle de Qualidade - Hemocentro de Campinas / Unicamp Controle de Qualidade de Plasma Fresco Congelado Local: Hemocentro de Campinas Período: janeiro 2012 Análise Pós-Descongelamento 0,9% da produção de PFC Tempo de armazenamento até análise - Mínimo: 10 dias e Máximo: 39 dias Data Bolsa N o Tipo DGS Vol F VIII F VIII Respons. Comp. Marca Peso (g) (ABO) (ml) (%) (UI / ml)

60 Plasma Fresco Congelado Plasma Plasma Fresco Congelado ANÁLISE DE RESULTADOS Fresco Congelado II. Término dos testes Estatística descritiva dos resultados mensais (média; mediana; desvio-padrão) Percentual de não conformidade Percentual analisado sobre a produção Avaliação de tendência ( resultados de meses anteriores e atual) intervenção precoce antes de chegar a não-conformidade Relatório mensal avaliação da direção Repercussões Abertura de relatório de não conformidade Rastreabilidade de processos (produção; congelamento; estoque; análise) Revalidação de processo Acompanhamentos necessários após revalidação

61 Interativa - Questão 1 São boas práticas na dosagem do FVIII do PFC: A. Coletar as amostras em tubos de vidro. B. Excluir da análise amostras lipêmicas. C. Manter as amostras a temperatura ambiente até análise. D. Deixar as bolsas no banho-maria pelo tempo que for necessário, até que descongelem completamente. E. Aguardar os resultados dos controles diários para descongelar as unidades.

62 Interativa - Questão 2 Com relação ao teste coagulométrico de um estágio, usado na dosagem de FVIII, é correto afirmar: A. É o ensaio com menor coeficiente de variação de resultados dentre as técnicas de dosagem de FVIII. B. É o mais utilizado na rotina de controle da qualidade do PFC. C. Realizar a técnica com uma mistura de reagentes de marcas diferentes não impacta na qualidade dos resultados. D. Dispensa a curva de calibração. E. Após a mudança do lote da cefalina não é necessário passar novamente os controles.

63 Interativa - Questão 3 As afirmações abaixo estão corretas? A. Amostras de PFC para dosagem de FVIII podem ser analisadas em até 8 horas do descongelamento, desde que permaneçam refrigeradas entre 2 o C e 8 o C. B. Uma curva de calibração recém- construída e com coeficiente de correlação r =0,999 pode ser considerada validada sem a passagem de controles. C. Um controle interno com resultado fora da faixa esperada deve ser repetido tantas vezes quantas forem necessárias até fique dentro da faixa de aceitação. Somente após a obtenção de um resultado aceitável, a rotina deverá ser iniciada. D. É recomendada a construção de uma nova curva de calibração após a manutenção corretiva do coagulômetro. E. O processo de dosagem de FVIII deve ser validado antes de sua implantação na rotina.

64 Interativa - Questão 4 Na rotina de controle da qualidade interno, realizada na data da dosagem de FVIII no PFC, é correto afirmar que: A. Podem ser usadas amostras conhecidas, ao invés de controles comerciais. B. É suficiente avaliar um único nível de controle. C. Os resultados obtidos com os controles internos devem ser avaliados de forma pontual, apenas na data da rotina. Resultados obtidos nas rotinas anteriores devem ser desconsiderados. D. O coeficiente de variação intra e entre rotinas, considerado aceitável para a dosagem de Fator VIII, é de 20% ou menos. E. A cada mudança do lote do plasma deficiente em Fator VIII deve ser refeita a curva de calibração.

65 Interativa - Questão 5 Com relação à dosagem de FVIII no controle da qualidade mensal do PFC, está correto afirmar: A. Pode ser feita a qualquer momento dentro da validade do PFC. B. A melhor estratégia é realizar todas as dosagens do mês em um único período, para evitar perdas de reagentes e consumo de controles. C. Assim que obtidos os resultados e desde que estejam não conformes, devem ser comunicados o mais breve possível ao Processamento, mesmo que a casuística prevista para análise não tenha sido realizada em sua totalidade. D. É desejável uma estratégia de reconhecimento de tendência de resultados ao longo dos períodos de análise do PFC. E. Os resultados não conformes obtidos na análise do PFC são sempre resultantes de problemas relacionados ao armazenamento.

66 Obrigado Andréa Origa Laboratório de Controle da Qualidade Hemocentro de Campinas Contato: (19)