FOTOACÚSTICA: CONSTRUÇÃO E APLICAÇÕES

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1 FOTOACÚSTICA: CONSTRUÇÃO E APLICAÇÕES Luana Carina Benetti 1, Paulo R. Innocente 2 RESUMO: Neste trabalho é descrita a técnica de Espectroscopia Fotoacústica com Célula Aberta (Open Photoacustic Cell - OPC) bem como sua montagem experimental. Mostra-se que a configuração experimental pode ser realizada com materiais de baixo custo. A técnica fotoacústica é aplicada para observação do efeito negativo, relacionado a evolução do oxigênio, em amostras de Camboatã Vermelho e Eucalipto Citriodora. A técnica permite experiências in vivo e as analises com uso desta técnica apresentam-se de acordo com os resultados esperados. Palavras chave: fotoacústica, fotossíntese INTRODUÇÃO: A Fotoacústica é uma técnica experimental, através da qual, é possível analisar as propriedades e o desenvolvimento de plantas relacionadas à fotossíntese. Esta técnica consiste em medir o calor e o oxigênio liberados pela incidência de luz sobre a folha de uma árvore. Tanto o calor, como o oxigênio, quando emitidos formam uma onda sonora, fazendo oscilar o diafragma do microfone. O processo fotossintético inicia com a absorção de energia, proveniente da luz. A energia absorvida excita os elétrons das moléculas de clorofila que saltam para fora desta, dando início a fase fotoquímica da fotossíntese. Nesta fase é gerado o oxigênio e o armazenamento de energia, no entanto, nem toda a energia absorvida é armazenada, parte dela se dissipa em forma de calor. Apesar de ser uma técnica recente, a técnica fotoacústica vem sendo muito utilizada por não necessitar de grande preparação da amostra podendo ser utilizada in vivo, havendo várias teses, dissertações e artigos publicados. A montagem experimental tem um custo elevado, uma vez que não se trata de um equipamento que encontra-se pronto no mercado e, portanto um dos desafios deste trabalho foi realizar a montagem experimental da técnica fotoacústica com um custo relativamente baixo, mas que obtivesse resultados significativos. Pode-se dizer que o trabalho foi dividido em duas partes. A primeira, a montagem experimental, envolvendo a aquisição e fabricação de equipamentos e a segunda, os testes com amostras para verificar o funcionamento do equipamento. Para montagem experimental tivemos como referência as teses e dissertações já publicadas em que constam esquemas da montagem e até equipamentos utilizados. O equipamento foi composto pelos seguintes itens: fonte de luz intensa e contínua (duas lâmpada de tungstêncio de 200 W), fonte de luz pulsada laser, filtro para infravermelho, lentes, processador, conversor analógico digital, amplificador e a célula fotoacústica com microfone de eletreto. Os testes foram realizados com amostra de Camboatã Vermelho, fornecido pelo Viveiro Florestal da Unochapecó e Eucalipto Citriodora e seus resultados encontram-se no capítulo 4 do presente trabalho. CONCEITOS BÁSICOS: Albert Einstein em 1905 propôs que a luz era composta por partículas de energia denominado fóton. A energia que cada fóton possui é dada por E=h.f, sendo h a constante de Plank e f a freqüência da onda, isto é, quanto maior a freqüência da onda absorvida, maior será a energia do fóton. Pigmentos são substâncias capazes de absorver luz. Um pigmento absorve todos os comprimentos de onda, aparece na cor preta, já os pigmentos absorvem apenas comprimentos de onda determinados e aparecem, na cor dos comprimentos de onda refletidos. A clorofila é um pigmento que torna as folhas dos vegetais verdes, pois absorve comprimentos de onda violeta, azul e vermelho, refletindo principalmente luz verde. Observa-se que os picos de produção fotossintética ocorrem juntamente com os picos de absorção da clorofila a e ocorrem em 435nm e 680nm, região que corresponde ao azul e ao 1 Acadêmica Curso de Física Licenciatura Plena, Unochapecó, lucbenetti@unochapeco.edu.br 2 Professor Orientador Mestre em Física

2 vermelho, respectivamente. É justamente pela coincidência nos picos de produção fotossintética e absorção da radiação que a clorofila a é um dos pigmentos mais importantes na absorção de radiação. A absorção de energia implica no aumento de energia das moléculas. Quando uma molécula está em seu estado fundamental de energia e absorve um fóton, ela passa para um estado de maior energia. Como a energia do fóton é igual a E=h.f, isso significa que a luz azul, por possuir maior freqüência, excita mais a clorofila a do que a luz vermelha, no gráfico representado pelo maior pico. De acordo com Mesquita (2005, p. 11),...no estado de mais alta energia a molécula é muito instável [..] perdendo parte da energia absorvida na forma de calor e decaindo para um estado excitado de mais baixa energia. A clorofila pode retornar para seu estado fundamental por várias maneiras: 1. A energia é total ou parcialmente convertida em calor, liberando um fóton de luz de energia menor que a absorvida, denominado fluorescência. 2. A energia é transferida da clorofila excitada para a clorofila vizinha, deixando a vizinha excitada e a primeira retornando ao estado fundamental. 3. Processo denominado Ressonância, o elétron de alta energia da clorofila, é transferido para a molécula vizinha, oxidando a clorofila e reduzindo a molécula vizinha. Para as células o segundo e terceiro processos são mais interessantes, pois permitem o armazenamento de energia. Enquanto no primeiro todo o trabalho realizado para a transformação de energia, torna-se inútil para a célula. Fotossíntese: De forma geral a fotossíntese é o processo pelo qual alguns organismos convertem energia luminosa em energia química, produzindo substâncias orgânicas. A fotossíntese ocorre no interior dos cloroplastos, ali estão presentes pigmentos, como a clorofila, capazes de captar a energia luminosa e transformá-la em energia potencial química. É nos cloroplastos que ocorre uma das principais etapas da fotossíntese e a mais importante para este estudo, é a etapa fotoquímica ou reações de claro. É nesta fase, que ocorre a absorção da luz, o transporte de elétrons e a produção do ATP. Após essa fase ocorre a fixação do carbono, que é a conversão do CO 2 em glicídios, é denominada fase química ou reações de escuro e não necessita da luz para ocorrer. As moléculas dos pigmentos fotossintetizantes (clorofilas e carotenóides) absorvem a energia luminosa. A energia absorvida excita os elétrons da clorofila, que adquirem um alto nível de energia e saltam para fora da molécula. Os elétrons perdidos pela clorofila são recuperados retirando-os das moléculas de água, forçando a fotólise da água. Ao ter elétrons removidos, as moléculas de água se decompõem em íons de H + (prótons), e átomos de oxigênio, estes se unem formando o gás oxigênio O 2 que é liberado para o meio. Os elétrons excitados, que saltaram da clorofila, são transferidos de uma substância aceptora (citocromo) para outra, nessa transferência liberam parte da energia captada na forma de luz. A última substância aceptora é o NADP (fosfato de dinucleotídio de nicotinamida-adenina) que se une com os íons para formar o NADPH. Unindo a equação química da fotólise da água e o transporte de elétrons, temos: 2H 2 O+2NAPH + O 2 +2H + +2NAPH +. A energia que os elétrons liberam ao serem transportados pelas substâncias aceptoras, é usada para forçar a passagens dos íons H + pela membrana tilacóide, os prótons se acumulam no lúmen tilacóide, devido a alta concentração os íons tendem a ir para o estroma. A passagem dos prótons leva a produção do ATP (trifosfato de adenosina), a partir de uma molécula de ADP (difosfato de adenosina) mais um fosfato. O ATP funciona como um agente armazenador de energia, através das ligações entre os fosfatos que envolvem grande quantidade de energia. Esse processo é denominado fotofosforilação. A fase química ou de escuro, ocorre no estroma dos cloroplastos. Nessa etapa, o NADPH e o ATP gerados na fase anterior, fornecem, respectivamente, átomos hidrogênio e energia para a produção dos glicídios a partir do gás carbônico. Basicamente, na fase fotoquímica da fotossíntese é gerado, a partir da água, o gás oxigênio e o armazenamento de energia, para na etapa química ocorrer a produção dos glicídios a partir do gás carbônico. A fotossíntese pode ser resumida pela equação: 6CO 2 + 6H 2 O 2 C 3 H 6 O 3 + 6O 2. Espectroscopia Fotoacústica: A espectroscopia fotoacústica é uma técnica experimental, que consiste na incidência de luz modulada sobre uma amostra, como uma folha de árvore, a absorção da luz provoca uma variação de temperatura, também de forma modulada, gerando

3 um efeito mecânico de contração e expansão, dando origem a ondas de pressão, captadas através de microfones. Da análise dos sinais captados é possível entender e monitorar, por exemplo, processos metabólicos e reações fotossintéticas. O efeito fotoacústico pertence aos chamados efeitos fototérmicos e foi descoberto por Alexander Graham Bell em Bell percebeu que ao incidir luz modulada sobre um sólido numa câmara, produzia um som que podia ser ouvido através de um tubo ligado à câmara. Posteriormente, Bell se dedica à investigar os efeitos fotoacústicos em líquidos e gases. Com o advento do microfone em 1938, desperta o interesse por experimentos qualitativos e quantitativos em gases e, surgem diversas teorias a respeito. Somente na década de 70 é que a fotoacústica volta a ser aplicada ao estudo das propriedades dos sólidos. Em 1976, surge a primeira interpretação teórica do efeito fotoacústico em sólidos, proposta por Rosencwaig e Gersho. Outros pesquisadores continuaram desenvolvendo modelos matemáticos para melhor entender a técnica e suas diversas formas de aplicação. Hoje a espectroscopia fotoacústica tem aplicações não apenas na física, mas na química, biologia, engenharia e medicina. A técnica fotoacústica começa a ser aplicada ao estudo da fotossíntese em 1976, por Adams M. J. ao obter o espectro fotoacústico de uma solução preparada a partir da clorofila extraída de folhas de espinafre. Dois anos depois Rosencwaig, mostrou ser possível obter o espectro fotoacústico de uma folha, colocando-a em uma célula fechada. Em 1986, Perondi e Miranda apresentam a Célula Fotoacústica Aberta (OPC). E poucos anos depois, a OPC foi completamente introduzida no campo de estudo da fotossíntese. Célula Fotoacústica Aberta: Segundo Mesquita (2005, p.28), o espectrômetro fotoacústico é composto por duas fontes de luz, uma lâmpada de Xenônio e uma de filamento de tungstênio. À frente a lâmpada de xenônio é colocada uma pá mecânica que serve como modulador. Para que a luz seja modulada em um comprimento de onda específico utiliza-se um monocromador, que permite controlar a resolução do comprimento de onda. Também são utilizados filtros ópticos para limitar a luz emitida pela lâmpada. Uma lente de quartzo focaliza o feixe resultante numa das entradas do cabo óptico bifurcado, que guia a luz até a célula fotoacústica. O filamento de tungstênio é usado para produzir a saturação fotossintética. Em frente a ele é colocada uma coluna de água (para cortar o espectro infravermelho), e uma lente para focalizar o feixe na outra estrada do cabo óptico. A Open Photoacustic Cell (OPC) no estudo de plantas é adequada, pois permite a utilização de uma mesma amostra várias vezes podendo inclusive acompanhar o desenvolvimento da mesma. A OPC é constituída por um microfone de eletreto comercial, cuja câmara é usada como célula fotoacústica. O microfone é composto por um diafragma de eletreto metalizado e uma placa de metal, separados por uma fina camada de ar e conectados por um resistor. As oscilações de pressão na câmara de ar provocam deflexões na membrana, gerando uma voltagem através do resistor. Esta voltagem passa por um pré-amplificador interno ao microfone. A célula é acomodada em um suporte de alumínio para facilitar a fixação na folha. As amostras vegetais são plantadas em recipientes até atingirem idade e tamanho suficiente para o estudo fotoacústico. Segundo Barja (1996, p. 25), o tamanho ideal para o estudo é de 30cm, para caber adequadamente sobre a célula fotoacústica aberta. Efeitos de Absorção: Ao iniciar o uso da técnica fotoacústica em plantas, esperava-se observar apenas o efeito térmico, resultante da transformação da energia luminosa em calor. No entanto, percebeu-se que o sinal fotoacústico é gerado pela ocorrência de dois efeitos, o térmico (como era esperado) e outro proveniente da liberação de gás oxigênio, durante a fotossíntese, que também produz uma variação de pressão na câmara fotoacústica. Este efeito é denominado efeito bárico. Parte da luz modulada incidente é absorvida pelas folhas, convertida em energia química e o restante liberado na forma de calor (ou luz -fluorescência), também de forma modulada. A resposta fotossintética (componente bárica) à luz é modulada, e para eliminá-la usa-se uma fonte de luz branca, contínua e de alta intensidade, capaz de atingir a saturação fotossintética, ou seja, o aumento de luz não provocará mais um aumento do sinal devido a liberação do oxigênio. A incidência de luz contínua (ou luz de saturação) pode gerar diferentes efeitos dependendo da freqüência de modulação da outra luz incidente. a) Efeito

4 Negativo: Se a freqüência de modulação for baixa, a adição de luz contínua, provocará a saturação fotossintética, eliminando a componente bárica de evolução modulada do oxigênio. A conversão de luz modulada em energia química se anula e o oxigênio produzido é liberado de forma contínua. O sinal fotoacústico decresce quando a luz é adicionada. b) Efeito positivo: O oxigênio é produzido nos cloroplastos e necessita de tempo para chegar a região onde ocorre a geração da onda acústica. Assim, quando a freqüência de modulação é alta, o sinal fotoacústico devido a componente bárica não estará em fase com a freqüência de modulação, o oxigênio evoluído difunde-se lentamente no inteior da folha não contribuindo para o sinal fotoacústico. Neste caso, ocorrerá um aumento na amplitude do sinal fotoacústico quando a lâmpada de saturação é, já que a energia absorvida é quase totalmente convertida em calor. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS: optou-se por realizar as medidas teste com uma muda de Camboatã Vermelho, que estava sendo cultivada pelo Viveiro Florestal da UNOCHAPECÓ e uma muda de Eucalipto Citriodora. O Camboatã vermelho é uma espécie nativa da região oeste catarinense, encontra-se em extinção e esta entre as várias espécies cultivadas pelo Programa Viveiro Florestal da UNOCHAPECÓ. O Eucalipto Citriodora, também conhecido como Eucalipto Cheiroso é muito utilizado para exploração comercial de folhas para a extração de óleo, devido ao seu cheiro. Ambos foram usados in vivo, isto é, sem destacar a folha da planta. Altura das plantas usadas estava entre 30 e 40 cm. Montagem Experimental: o equipamento compreende fonte de luz intensa e contínua (duas lâmpada de tungstêncio de 200 W), fonte de luz pulsada laser de comprimento 650 nm, filtro para infravermelho (recipiente de vidro com água), três lentes convergente, processador, conversor analógico digital, amplificador e a célula fotoacústica construída em latão e microfone de eletreto. A parte eletrônica e a célula foram construídas com auxílio de terceiros. O valor total gasto com o equipamento, não chegou a 10% do convencional. O processador permite a escolha da freqüência do laser numa freqüência que pode variar de 1 a 999Hz, evitando o uso de modulador mecânico. A fonte de luz de tungstênio foi usada para saturar a fotossíntese. A célula fotoacústica consiste em um cilindro de latão com um orifício de cerca de 1,0 cm de diâmetro onde é encaixado o microfone de eletreto, acima do microfone é colocado a amostra que é vedada com um outro cilindro, este de espessura menor. O microfone de eletreto foi conectado a um amplificador, em seguida vem o conversor analógico digital e o computador onde os dados são recebidos e analisados. As medidas foram realizadas num tempo de cerca de 60 s, sendo nos primeiros 20 s a amostra recebe luz laser numa baixa freqüência (10 Hz), depois recebe também luz intensa de cerca de 300 W/m 2 e nos últimos 20 s volta a receber apenas a luz laser de baixa freqüência. ANALISE DOS RESULTADOS: As medidas foram realizadas in vivo, utilizando a técnica OPC. Utilizamos folhas de Camboatã Vermelho e Eucalipto Citriodora. O tempo de cada medida foi de aproximadamente 60 s segundos e em ambas as amostras foi possível perceber o efeito negativo. O tratamento dos dados e plotagem dos gráficos foram realizados como o uso do software Matlab. A Figura 1 mostra a amplitude do sinal (em mv) versus tempo de incidência para o Camboatá Vermelho e a Figura 2 da amostra de Eucalipto Citriodora.

5 Intensidade da luz de 650nm: 11,3W/m 2 ; frequência de modulação: 17Hz. Intensidade luz de saturação (125W/m 2 ). Figura 1: Gráfico efeito negativo em folhas de Camboatã Vermelho Intensidade da luz de 650nm: 11,3W/m 2 ; frequência de modulação: 17Hz. Intensidade luz de saturação (250W/m 2 ). Figura 2: Gráfico efeito negativo em folhas de Eucalipto Citriodora As setas para cima e para baixo representam respectivamente o inicio e término da incidência de luz contínua de fundo sobre a amostra. Em ambos os gráficos, podemos perceber 3 etapas ou fases. Na primeira a amplitude é elevada, na segunda há um decréscimo do sinal e na terceira a amplitude do sinal volta a ser elevada. Na primeira fase, correspondente 20 e 30 primeiros segundos da Figura 1 e 2, respectivamente, há uma elevação da amplitude do sinal fotoacústico, neste momento há apenas a incidência da luz laser modulada a uma freqüência de 17Hz. As moléculas de clorofila absorvem a energia proveniente da luz de forma modulada, dando início a fase fotoquímica da fotossíntese, que tem como resultado o armazenamento de energia, liberação de oxigênio e, como vimos, de calor. A liberação de oxigênio e calor gera ondas de pressão moduladas, que são captadas pelo microfone de eletreto, ou seja, o sinal fotoacústico observado neste primeiro momento é devido a liberação modulada de calor e oxigênio de forma modulada, isto fica bastante visível na Figura 2, onde o tempo de medida foi maior. Observe que os picos parecem se repedir a cada instante nesta primeira fase, dando indícios da modulação do sinal fotoacústico. Na segunda fase, início indicado pela seta para cima, além do lazer, é ligada a luz contínua de fundo ou luz de saturação, e verifica-se um decréscimo na amplitude do sinal. Como a freqüência de modulação é baixa (17Hz), a luz contínua de fundo atua de forma a saturar a evolução do oxigênio (componente bárica). As moléculas de clorofila passam a absorver a energia continuamente, assim a liberação do oxigênio passa a ocorrer também de forma contínua, como não há variação de pressão, o sinal devido a liberação do oxigênio deixa de ser captado pelo microfone de eletreto e não contribui para o sinal fotoacústico, assim o sinal deve-se apenas a liberação de calor (componente térmica), mas o oxigênio continua sendo liberado. Ao apagar a luz contínua, indicada pela seta para baixo, deixando novamente apenas o lazer, a absorção de energia pelas moléculas de clorofila volta a ocorrer de forma modulada, a liberação de oxigênio e calor também e, volta a ser captado pelo microfone. Identifica-se este aumento do sinal fotoacústico na terceira fase. Se na primeira fase, o sinal deve-se apenas a liberação de calor, podemos perceber que esta é relativamente baixa se comparada à evolução do oxigênio, ou seja, a contribuição do oxigênio para o sinal fotoacústico é maior do que a de calor. Isso significa que durante o processo fotossintético, uma pequena parcela de energia é dissipada na forma de calor, enquanto a outra parte é armazenada durante o processo fotoquímico, processo este que identificamos através da liberação de oxigênio, para ser utilizada durante a fase química da fotossíntese que tem como resultado a produção da glicose. CONSIDERAÇÕES FINAIS: O trabalho realizado mostrou que é possível desenvolver técnicas de pesquisa com custos relativamente baixos, e que a confecção de equipamentos de aquisição de dados além de eficaz torna-se indispensável para se fazer pesquisa com

6 modestos recursos financeiros. A técnica fotoacústica apresenta-se como uma técnica muito útil ao estudo de sistemas biológicos como a fotossíntese, principalmente por possibilitar o estudo in vivo das amostras, eliminando eventuais problemas como o da desidratação das amostras, sua conservação, entre outros. A montagem experimental exigiu muito estudo, tempo além do previsto e cuidado por tratar-se de uma técnica com extrema sensibilidade, onde os dados são obtidos em escala de V e a interferência no sinal fotoacústico é eminente. Análises dos espectros fotoacústicos obtidos para folhas de Camboatã Vermelho e Eucalipto Citriodora possibilitou observar a evolução do oxigênio, através do efeito negativo. Observou-se ainda que o oxigênio e calor são liberados de forma modulada e que a contribuição da liberação do oxigênio para o sinal fotoacústico é superior a do calor. As análises também trouxeram dados significativos ao trabalho, mostrando que a montagem experimental está correta e dentro dos resultados esperados. Encontramos dificuldades por haver poucos livros sobre a técnica fotoacústica e poucos que abordem a fotossíntese do ponto de vista físico, trabalhando em sua grande maioria com Teses e Dissertações. Este trabalho é um ponto inicial para o estudo da técnica fotoacústica aplicada em plantas, pois consistiu na montagem experimental da mesma. Assim, têm-se como perspectivas de estudo o aprimoramento do equipamento a fim de observar o efeito positivo do sinal em plantas e com isso a realização estudos em outros tipos de plantas. AGRADECIMENTO: Agradecemos à Universidade Comunitária da Região de Chapecó UNOCHAPECÓ pelo auxílio financeiro (Apoio a Trabalhos de Conclusão de Curso - ATCC) e a disponibilização do Laboratório de Física da UNOCHAPECÓ onde parte dos equipamentos foram desenvolvidos. Agradecemos a essencial colaboração do engenheiro e professor Adriano Padilha. REFERÊNCIAS: BARJA, Paulo Roxo. Estudo da indução fotossintética através da técnica fotoacústica: efeitos de saturação e fotoinibição f. Dissertação (Mestre em Física) Instituto de Física Gleb Wataghin, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, Disponível em: Acessado em 19 mai FLESCH, Roger Delmar e VIEIRA, Luís Carlos. Espaçamentos e densidades de milho com diferentes ciclos no oeste de Santa Catarina, Brazil. Ciência Rural, Jan./ Feb. 2004, vol.34, nº.1, p Disponível em: Acessado em 20 out LARCHER, Walter. Ecofisiologia vegetal. São Carlos, SP: Rima, MESQUITA, Rickson Coelho. Caracterização fotoacústica de plantas crescidas sob diferentes condições de luminosidade f. Dissertação (Mestrado em Física) Instituto de Física Gleb Wataghin, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, Disponível em: Acessado em: 18 abr PEREIRA, Antonio Carlos. Contribuição por espectroscopia fototérmica ao estudo de sistemas biológicos f. Dissertação (Doutorado em ciências) Instituto de Física Gleb Wataghin, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, Disponível em: Acessado em: 18 abr RAVEN, Peter H.; EVERT, Ray F.; EICHHORN, Susan E.. Biologia vegetal. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.