Dissertação TERAPIA GÊNICA PARA ANGIOGÊNESE NA ANGINA REFRATÁRIA: ENSAIO CLÍNICO CONTROLADO FASE I/II. Imarilde Inês Giusti

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1 Dissertação TERAPIA GÊNICA PARA ANGIOGÊNESE NA ANGINA REFRATÁRIA: ENSAIO CLÍNICO CONTROLADO FASE I/II Imarilde Inês Giusti

2 2 INSTITTUTO DE CARDIOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL FUNDAÇÃO UNIVERSITÁRIA DE CARDIOLOGIA Programa de Pós-Graduação em Medicina: Área de Concentração: Cardiologia e Ciências Cardiovasculares TERAPIA GÊNICA PARA ANGIOGÊNESE NA ANGINA REFRATÁRIA: ENSAIO CLÍNICO CONTROLADO FASE I/II Autor: Imarilde Inês Giusti Orientador: Dr. Renato Abdala Karam Kalil Dissertação submetida como requisito para obtenção do grau de mestre ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Área de concentração: Cardiologia e Ciências Cardiovasculares, da Fundação Universitária de Cardiologia / Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, 2011

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4 4 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, pela vida. À minha família, meus filhos e meu marido pelo apoio, carinho e compreensão. Ao meu orientador, Dr. Renato Abdala Karam Kalil, sem ele, este trabalho não aconteceria, agradeço pela orientação, pela amizade e pelo exemplo a ser seguido. Aos colaboradores do trabalho, aos diferentes setores do Instituto de Cardiologia, que de alguma forma contribuíram para a realização do mesmo. À equipe da terapia gênica, Clarissa Garcia Rodrigues, Felipe Borsu de Salles, Roberto Sant Ana, Nance Beyer Nardi, Melissa Medeiros Markoski, Andrés Delgado Cañedo e Bruna Eibel. Aos pacientes, pela paciência com o estudo e por confiarem na equipe da terapia gênica. Ao Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul/Fundação Universitária de Cardiologia pela oportunidade na realização deste trabalho. Às pessoas que direta ou indiretamente auxiliaram no desenvolvimento e conclusão deste trabalho.

5 5 SUMÁRIO BASE TEÓRICA 1. Introdução Cardiopatia Isquêmica Tratamento da Cardiopatia Isquêmica Terapia Gênica para Cardiopatia Isquêmica Bases Moleculares da Angiogênese Papel do Endotélio Terapia Gênica com VEGF Vetor Plasmidial Vias de Administração População, Segurança, Benefícios e Potenciais Riscos do Uso da Terapia Gênica Ensaios Clínicos Controlados de Terapia Gênica Nossa Experiência com Terapia Gênica Justificativa Hipótese de Pesquisa Objetivos Objetivo Geral Objetivos Específicos Referências ARTIGO Resumo... 57

6 6 Introdução... Métodos... Análise Estatística... Resultados... Discussão... Referências... Tabela 1... Figura 1... Figura 2... Figura 3... Figura 4... Figura 5... Figura

7 7 1. INTRODUÇÃO A demonstração de que alguns fatores de crescimento vascular têm o potencial de induzir angiogênese no tecido isquêmico 1-3 tem estimulado a investigação de novas técnicas de tratamento para pacientes com doença arterial coronariana (DAC). Isso se deve à possibilidade de induzir angiogênese miocárdica e estabelecer circulação colateral, especialmente nos casos de angina refratária à terapêutica convencional e inviáveis para as técnicas de revascularização miocárdica tradicionais, percutânea e cirúrgica. A complexa cascata de eventos que ocorre durante a neovascularização em resposta à isquemia envolve diversos fatores de crescimento e receptores 4. O fator de crescimento endotelial vascular (vascular endothelial growth factor - VEGF) tem sido foco de diversos estudos 5, 6 e seus efeitos vêm sendo testados em pacientes com DAC grave Nos últimos anos, foram realizados estudos que utilizaram diferentes doses, vetores e vias de administração do VEGF. Ensaios clínicos trazem resultados controversos, muitos demonstrando melhora clínica e evidência de angiogênese 8-19 e outros não apresentando diferenças na perfusão miocárdica quando comparados aos seus controles Dessa forma, apesar de promissores, os efeitos clínicos e sobre a vascularização do miocárdio proporcionados pela terapia gênica com VEGF permanecem não esclarecidos totalmente. A terapia gênica com o VEGF representa uma potencial alternativa de tratamento para angina refratária, pela possibilidade do desenvolvimento de circulação colateral e melhora da perfusão miocárdica. O VEGF funciona tanto como um importante marcador de dano endotelial quanto como mediador de reparo. Em casos de injúria como isquemia, inflamação e infarto tem sua expressão aumentada e estimula a manutenção, mobilização e recrutamento das células

8 8 progenitoras endoteliais (CPE) da medula óssea 21. Seu potencial angiogênico estimula a produção endotelial de óxido nítrico (NO). Estas observações salientam a importância do estudo da segurança, viabilidade e os efeitos iniciais (ensaio clínico fase I/II), clínicos e sobre a perfusão do miocárdio do gene que codifica a proteína VEGF em pacientes com DAC avançada e angina refratária, não passíveis de revascularização percutânea e cirúrgica, visando a possível formação de novos vasos colaterais. No presente estudo, a administração transtorácica de VEGF 165 plasmidial representa o primeiro ensaio clínico com terapia gênica no Brasil.

9 9 2. CARDIOPATIA ISQUÊMICA As doenças cardiovasculares (DCV) são a primeira causa de morte no Brasil, especialmente entre os idosos. As doenças cerebrovasculares (DCBV) e as doenças isquêmicas do coração (DIC) totalizam mais de 60% dos óbitos por DCV. Em 2002, a mortalidade proporcional por DIC, no Brasil, foi de 30,5% das mortes por DCV, sendo que, na faixa etária acima de 60 anos, foi de 27,4% para o sexo feminino, e para o sexo masculino foi de 32,0% dos óbitos por DCV 22. Na fisiopatologia da cardiopatia isquêmica dois processos estão implicados: a oferta e a demanda de oxigênio pelo miocárdio. A isquemia miocárdica ocorre quando há desequilíbrio na oferta e na demanda de oxigênio. Por outro lado, duas situações alteram a oferta de oxigênio para o miocárdio: a isquemia e a hipoxemia. Em algumas condições, o comprometimento da oferta de oxigênio é secundário à diminuição do fluxo sanguíneo, sendo essa a fisiopatologia da maioria dos casos de infarto agudo do miocárdio (IAM) e dos episódios de angina instável. Em outras situações, como a hipertrofia ventricular, o aumento na demanda de oxigênio é o principal responsável pela isquemia miocárdica 23. Além disso, o sinergismo desses dois mecanismos é o principal fator na determinação de isquemia nos casos de angina crônica estável. Esforço físico, estresse emocional, taquicardia ou hipertensão arterial associados à obstrução coronária alteram não só a demanda como a oferta de oxigênio, desencadeando isquemia miocárdica. A hipoxemia, por sua vez, caracteriza-se pela redução da oferta de oxigênio, mas com perfusão sanguínea adequada. Alguns exemplos desse quadro são as cardiopatias congênitas cianóticas, asfixia, a insuficiência respiratória e a intoxicação por monóxido de carbono 24. Fatores que alteram a demanda e a oferta de oxigênio, portanto, são os responsáveis pela evolução do paciente para síndrome coronária aguda e angina

10 10 crônica estável. De acordo com estatísticas do American Heart Association, , a prevalência de angina na população americana é de 4,6%, afetando 58% dos pacientes com DAC 25 e crescendo rapidamente com o aumento da idade. As opções não convencionais de tratamento para angina refratária são limitadas e incluem terapia gênica, terapia celular com células tronco e revascularização transmiocárdica com laser. Alguns pacientes são extensivamente revisados e acabam fazendo algum tipo de revascularização, mesmo que parcial, com o objetivo de aliviar os sintomas. Entretanto, a longo prazo, os riscos de eventos adversos são bastante altos 26. O grau de obstrução da artéria responsável pelo episódio agudo, a ocorrência de lesões em outros vasos e o grau de circulação colateral são os determinantes mais importantes da diminuição da oferta de oxigênio; a pressão arterial sistêmica, a freqüência cardíaca e a hipertrofia e contratilidade ventricular são as variáveis mais importantes na determinação da demanda de oxigênio. Apesar da contribuição de todos esses fatores na determinação da isquemia miocárdica, a doença aterosclerótica coronária é o substrato anatômico mais importante na fisiopatogenia da cardiopatia isquêmica 24. A partir de estudos destacados da literatura 27-30, sabemos hoje da importância do processo aterotrombótico não só no desencadeamento da isquemia aguda como também na progressão da doença aterosclerótica com relação à gravidade da obstrução da luz vascular 31, 32. Dentre os principais fatores de risco, destacam-se o tabagismo, a hipertensão arterial sistêmica, a dislipidemia, diabetes melito, intolerância à glicose, resistência à insulina, insuficiência renal crônica, obesidade, sedentarismo e deficiência de estrógeno. Surgem a cada ano novos fatores de risco para a DAC, onde várias substâncias dosadas no sangue têm demonstrado relação com risco coronário maior. Entre essas, as mais estudadas são os valores totais de homocisteína, lipoproteína, marcadores da função fibrinolítica (PAI-1, t-pa e d-dímero),

11 11 fibrinogênio e marcadores inflamatórios (proteína C reativa, interleucina 6, fatores de adesão celular ICAM-1 e fator de necrose tumoral TNFα) 33, 34. A progressão da DAC causa seqüelas como necrose por infarto do miocárdio e fibrose por isquemia crônica severa, levando à perda progressiva da função contrátil e do relaxamento, à miocardiopatia isquêmica, com sintomas de insuficiência cardíaca, arritmias e morte 35. O miocárdio tem capacidade de regeneração limitada, pois embora tenham sido demonstradas células-tronco cardíacas, estas não são suficientes para compensar grandes perdas de tecido, como ocorre em infartos do miocárdio, mesmo clinicamente pequenos. Como resultado disso, isquemia irreversível (infarto) resulta em progressiva substituição das células miocárdicas mortas por fibrose (cicatriz) com redução da função sistólica e diastólica do coração e iniciando a síndrome clínica da insuficiência cardíaca com início de toda a ativação neuro-hormonal própria da doença Tratamento da Cardiopatia Isquêmica O objetivo do tratamento da angina em pacientes crônicos é aliviar os sintomas, reduzir a progressão do processo de aterosclerose, diminuir o risco de infarto do miocárdio e morte. Tradicionalmente é realizado com nitratos, beta-bloqueadores, estatinas, bloqueadores do cálcio e anti-agregantes plaquetários. Anti-anginosos menos usais como trimetazidina 36-38, ranolazina 39,40, ivabradina 41,42 e nicorandil eventualmente são associados em situações especiais. Ainda, entre as opções de tratamento da cardiopatia isquêmica estão a revascularização percutânea por cateter e a cirurgia de revascularização do miocárdio 46. Com os avanços tecnológicos e das técnicas cirúrgicas, a cirurgia de revascularização miocárdica é considerada a melhor opção para o alívio dos sintomas e para a melhora da qualidade de vida dos portadores de

12 12 DAC 46. Outra opção é a angioplastia coronária transluminal percutânea (ACTP), a qual visa desobstruir as artérias comprometidas e permitir que o sangue volte a circular livremente TERAPIA GÊNICA PARA CARDIOPATIA ISQUÊMICA 3.1. Bases Moleculares da Angiogênese Recursos de biologia molecular e terapia gênica têm sido desenvolvidos para aplicação na terapêutica cardiovascular, em situações nas quais não há opções, ou quando estas apresentam limitações, pelos métodos convencionais. A principal área de desenvolvimento de terapia gênica em cardiologia é na indução de angiogênese miocárdica, com potenciais benefícios na cardiopatia isquêmica em fase terminal, após esgotados os recursos farmacológicos, intervencionistas por cateter e cirúrgicos, ou seja, naqueles casos refratários a todas as formas de tratamento, onde restaria apenas o recurso do transplante cardíaco 48. Angiogênese, a formação de novos vasos a partir do endotélio de vasos já existentes, possui papel essencial no desenvolvimento embrionário, reparo tissular e progressão de uma variedade de processos patológicos 1, 2. A angiogênese induzida pela administração do gene que codifica a proteína VEGF destina-se a promover a formação de novos vasos, capilares e arteríolas. A idéia de que fatores angiogênicos possam promover revascularização de tecidos isquêmicos, uma estratégia chamada angiogênese terapêutica 49, foi investigada primeiramente em indivíduos com doença arterial periférica, especificamente, isquemia crítica de membros. A transferência de VEGF plasmidial trouxe alguns benefícios clínicos, como a abolição da dor em repouso e cicatrização das úlceras isquêmicas, salvando membros inferiores. Esses benefícios foram associados com evidência angiográfica de novos vasos colaterais e do aumento do fluxo

13 13 sanguíneo para a perna 50. O conceito de angiogênese terapêutica em humanos, através de ensaios clínicos fase I, levou adiante a idéia de testar esta estratégia em cardiopatas isquêmicos. Portanto, a angiogênese terapêutica é uma estratégia desenvolvida para amplificar o processo natural da angiogênese e reperfundir tecidos isquêmicos, podendo representar um novo processo de revascularização nesses pacientes de alto risco 51. O mecanismo da angiogênese pode ser iniciado por alguns fatores de natureza mecânica, por processos inflamatórios ou por hipóxia (desbalanço energético). O processo de angiogênese ocorre por estágios (Figura 1) que compreendem: dilatação do vaso, ativação de células endoteliais, ativação de plaquetas, secreção de ativadores do plasminogênio e enzimas proteolíticas, desgranulação de mastócitos, ativação de macrófagos, ruptura da membrana basal e aumento de permeabilidade com saída de fibrina e outras proteínas (estágio 1). A seguir, ocorre formação de pseudópodos, degradação da matriz extracelular, migração de células endoteliais para o espaço extravascular com proliferação das mesmas e formação de brotos de tecido vascular (estágio 2). Por fim, forma-se nova membrana basal e maturação da nova parede vascular para estabelecimento do fluxo sangüíneo, formação de tubos e conexões, estabelecendose os novos vasos (estágio 3) 52.

14 14 Figura 1 - Seqüência de eventos no processo da angiogênese. O processo pelo qual a hipóxia e a inflamação induzem à angiogênese vem sendo intensamente estudado 53, 54. A inflamação aumenta a produção do peptídeo derivado de macrófagos PR-39, este inibe a degradação do hypoxia-inducible factor 1-alfa (HIF 1-alfa) levando ao aumento da expressão do VEGF e seus receptores 55. Por outro lado, o PR-39 aumenta a produção de fatores de crescimento dos fibroblastos (FGF), os quais têm poder angiogênico. Ainda por outro caminho, a inflamação induz a produção de citoquinas promotoras de angiogênese 56. Fatores mecânicos podem atuar ativando o mesmo mecanismo e resultando em angiogênese 57 (Figura 2).

15 15 Figura 2 - Mediadores bioquímicos envolvidos no processo pelo qual a hipóxia e a inflamação levam à angiogênese. HIF: hypoxia-inducible factor 1; VEGF: vascular endothelial growth factor; TGF: transforming growth factor; TNF: tumor necrosis factor; FGF: fibroblast growth factor; IL: interleucina 57. As duas famílias de fatores identificados e isolados que participam do processo acima descrito, são do VEGF e do FGF. O membro melhor identificado da família do VEGF é VEGF- A, que consiste de 5 isoformas, resultantes de divisões alternativas de um gen único, ou sejam: VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 189 e VEGF 206. A família FGF compreende pelo menos 9 polipeptídeos, incluindo FGF básico e FGF ácido. Diferentemente do VEGF, FGF atua na mitogênese de células endoteliais, de fibroblastos e de células musculares lisas 56. Ainda, o fator

16 16 de crescimento do hepatócito (HGF) é um potente mitógeno para uma grande variedade de células, sendo angiogênico, antiapoptótico e possuindo propriedades antifibróticas 58, 59. A disponibilidade maior de FGF fez com que o emprego desse gene tenha sido mais estudado. Entre os estudos experimentais, cabe destacar o relatado por Kawasuji e colaboradores em um modelo de infarto agudo do miocárdio, onde se demonstrou a eficácia do bfgf em aumentar o número de vasos capilares na zona limítrofe e no epicárdio da área infartada, no aumento do fluxo sangüíneo nessas áreas e na melhora da fração de ejeção do ventrículo esquerdo, 7 dias após o infarto 60. Estudo de longo prazo, de tratamento com FGF-1 ácido como adjunto de revascularização cirúrgica do miocárdio, em injeção intramiocárdica, por controles cinecoronariográficos, demonstrou maior densidade de contraste no miocárdio das regiões tratadas desde o primeiro exame, após 3 meses, mantendo-se de forma semelhante após 3 anos. A fração de ejeção ventricular esquerda melhorou significativamente no grupo tratado, em relação ao controle. O mesmo ocorreu na melhora da função segmentar da parede ventricular esquerda da região apical, tratada com FGF Papel do Endotélio O endotélio sintetiza importantes substâncias desempenhando papel fundamental sobre o controle vascular, tanto em situações fisiológicas quanto em processos patológicos como as síndromes coronarianas. Sabe-se que a monocamada de células endoteliais atua como uma superfície não aderente para plaquetas e leucócitos produzindo uma variedade de importantes fatores regulatórios como o NO 62. Dessa forma, influencia não somente o tono vascular, mas também o seu remodelamento, por meio da produção de substâncias promotoras e inibidoras do seu crescimento 63.

17 17 A disfunção nas células endoteliais leva a uma perda das propriedades antitrombóticas da parede vascular e corresponde ao início do processo aterosclerótico 62. Pacientes com doença coronariana têm importante disfunção endotelial e diminuição da disponibilidade de NO, particularmente quando a DAC é severa e difusa 64,65. A reconstrução endotelial ocorre pela migração e proliferação de células endoteliais maduras circulantes. Entretanto, essas células têm baixo potencial proliferativo e sua capacidade de reparo é limitada. Evidências indicam que a circulação periférica contém subtipos celulares da medula óssea com propriedades similares aos angioblastos embrionários. As CPE possuem capacidade proliferativa e de diferenciação em células endoteliais maduras, podendo ser induzidas por diferentes citocinas ou fatores de crescimento, como por exemplo, VEGF, adquirindo diferentes fenótipos 62. As CPE caracterizam-se pela expressão de diversos marcadores, como CD133, CD34 e KDR, entre outros. Durante a diferenciação, diminuem os níveis de CD133 e aumenta a expressão de CD31, CD34, KDR, fator de Von Willebrand, entre outros. As CPE possuem a habilidade de homing em sítios de lesão vascular e contribuem para a neoangiogênese 66. CPE são consideradas poderosos marcadores biológicos para a função vascular. Os mecanismos que estimulam a proliferação e migração dessas células ainda são parcialmente conhecidos 62. A aplicação de genes recombinantes ou fatores de crescimento sob forma de proteína recombinante é eficaz tanto pela injeção intramiocárdica como pela via intracoronariana. A primeira, ainda que implique em toracotomia, tem como vantagem a entrega localizada e com menor extravasamento sistêmico. O principal alvo do VEGF é a célula endotelial. O receptor comum para o VEGF-1 e VEGF-2 é o KDR 67, que faz a transdução do sinal angiogênico. O papel do receptor do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGFR-1) (Flt-1) na angiogênese é controverso. Hipóxia aumenta a expressão de KDR e a produção de VEGF pelas células

18 18 endoteliais; este mecanismo com o loop autócrino, juntamente com a proliferação de células endoteliais após estímulo, pode amplificar e prolongar a resposta ao VEGF administrado. Um importante papel adicional do VEGF é que ele aumenta o número de células endoteliais progenitoras circulantes, um efeito que foi documentado em camundongos e seres humanos 66,68. Estudos experimentais recentes em mamíferos de médio porte como modelo de isquemia miocárdica investigaram o efeito do VEGF 165 intramiocárdico na proliferação de vasos com musculatura lisa - arteriogênese, visto que a perfusão tecidual depende principalmente da árvore arteriolar. Além disso, foi avaliado o efeito do tratamento no crescimento capilar, perfusão miocárdica e função miocárdica. Cinco semanas após o tratamento, o grupo tratado com VEGF 165 mostrou alta densidade de pequenos vasos com musculatura lisa, alta densidade de capilares e melhora na função miocárdica, com diferença significativa em relação ao grupo controle. Esse estudo mostra um efeito arteriogênico do VEGF 165 em um modelo de mamífero com cardiopatia isquêmica, encorajando seu uso como promotor de crescimento arteriolar em pacientes com doença coronariana grave 69. Não está claro o método mais adequado para avaliar os efeitos na perfusão tecidual. A angiografia simples não é capaz de detectar mudanças em nível microvascular, mas a ecocardiografia miocárdica contrastada, em conjunto com microesferas radiomarcadas, foi utilizada com sucesso para avaliar os benefícios da terapia com VEGF Para a proteção de miocárdio isquêmico, é conhecida a função angiogênica através de fatores pró-angiogênicos como VEGF, FGF e HGF, os quais podem ser usados para o tratamento da isquemia 71. Atualmente salienta-se também o uso de enzimas antioxidantes que inibem a ativação de células endoteliais tanto para tratamento de infarto agudo do miocárdio como para imunossupressão no transplante cardíaco, além de transferência de genes anticoagulantes visando à estabilização da placa de ateroma. Esses tratamentos são apresentados como forma de

19 19 prevenção de eventos agudos, visto que seu tempo de ação ultrapassa o tempo previsto para a intervenção durante o evento clínico. Em um estudo piloto de terapia gênica em pacientes com DAC, Yang et al. 72 relataram a crescente evidência dos efeitos benéficos do HGF no infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca e doença arterial obstrutiva periférica. O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da administração intracoronariana de um vetor de adenovirus que codifica o gene HGF humano (Ad- HGF) sobre os níveis séricos de citocinas e mobilização de células CD34 (+) e CD117 (+) em pacientes com doença cardíaca. Diante dos achados, concluiu-se que a terapia gênica com HGF pode desempenhar um papel importante na regulação das citocinas inflamatórias e indução da mobilização de CPE em pacientes com DAC. Por outro lado, na terapia gênica de resgate do miocárdio, a manipulação de proteínas reguladoras do cálcio e de receptores beta-adrenérgicos sinalizam melhora na contratilidade miocárdica 73. Atualmente, estuda-se a associação de terapia gênica e terapia celular frente a diferentes patologias cardíacas. Um exemplo recente é o estudo de Matsumoto et al. 74, que avaliaram a expressão de VEGF após transplante de células tronco mesenquimais (MSC) e verificaram o possível aumento de efeitos cardioprotetores destas células seguido da angiogênese, na recuperação do miocárdio isquêmico. Diante disso, demonstra-se a possibilidade da análise cada vez mais apurada da expressão de biomarcadores diante de tais terapias TERAPIA GÊNICA COM VEGF 165 Com o intuito de induzir a angiogênese miocárdica, a terapia gênica utilizando o VEGF poderia representar uma nova modalidade de tratamento para a DAC. Isso se deve à possibilidade de desenvolver novos vasos arteriais ou promover a reformação dos vasos existentes 76.

20 20 O VEGF 165 contém 165 aminoácidos e funciona interagindo com receptores específicos das células endoteliais, iniciando a cascata de eventos que culmina com a migração de células endoteliais, proliferação e agregação em microtúbulos que acabarão por formar uma rede de sistemas arteriais e venosos. Transferência de genes representa uma maneira de transportá-los para o coração, onde o DNA codificador de VEGF é liberado na célula miocárdica, a qual começa secretar VEGF. Nos ensaios realizados até o momento, não existem dados concretos sobre a dose adequada e segura de fator angiogênico a ser administrada. Na maior parte dos estudos com VEGF 165, a dose variou entre μg. A disponibilidade de vetores com tropismo pelo miocárdio, capazes de uma expressão protéica longa e estável, e o isolamento de células progenitoras com potencial angiogênico e regenerativo oferece possibilidades de desenvolvimento de terapia baseada em proteção e regeneração do miocárdio isquêmico e insuficiente. A terapia gênica em doenças cardiovasculares não visa a substituir um gene anormal, mas supra-regular a expressão de uma proteína útil aumentando o conteúdo de DNA. Sua efetividade depende do gene, do vetor e da forma de administração utilizados 77. Vetores genéticos são todas as moléculas de DNA com potencial de replicação autonômica dentro da célula hospedeira, na qual seqüências de DNA podem ser inseridas e ampliadas. A origem do vetor permite classificar em plasmidiais, bacteriófagos ou virais 78. Eles são utilizados para transportar genes para células receptoras. Possuem não apenas marcadores para facilitar seu reconhecimento, como também seqüências replicadoras. Em modelos animais, o uso de plasmídeos demonstrou uma expressão duradoura após vários meses, apesar de baixa taxa de transfecção efetiva 79. A aplicação de adenovírus apresenta taxas de transfecção, durando de dias a semanas, com contraditória curta expressão gênica. Ademais, anticorpos circulantes,

21 21 freqüentemente encontrados na população adulta, podem reduzir a taxa de transfecção efetiva de 0,04% até 5,0% de células positivas em análise histológica 80. Além disso, o uso de vetores virais requerem cuidados de biossegurança, medidas desnecessárias com vetores não-virais. Estudos apontam eventos temporários relacionados com utilização de adenovírus, tais como febre, ou elevação sérica de proteína C reativa, das enzimas hepáticas e da titulação de anticorpos 81. Hao et al. 82, publicaram em 2007 um estudo experimental sobre angiogênese miocárdica por VEGF 165 comparando vetores adenovirais com plasmidiais. Estes autores demonstraram benefícios equivalentes em termos de função ventricular (p<0,05) para plasmídeos e adenovírus após quatro semanas, entretanto, neste trabalho a técnica TUNEL, que detecta quebras do DNA que ocorrem durante o processo de apoptose, demonstrou um aumento da freqüência de apoptose de cardiomiócitos no grupo adenovírus (p<0,02). A terapia gênica sofreu um revés importante quando da ocorrência de um óbito em sujeito de pesquisa, provavelmente devido à alta carga viral administrada, tendo havido cancelamento de vários projetos clínicos e retorno à pesquisa laboratorial. Desde 2000, poucos projetos de aplicação clínica foram desenvolvidos. Entretanto, nenhuma complicação de gravidade notável foi observada nos projetos que não utilizaram vetores virais. As formas de administração por lipossomas ou por DNA plasmidial desnudo não estão relacionadas à morbidade nos relatos disponíveis na literatura 82. A formação de novos vasos responde ao estímulo de fatores angiogênicos, os quais regulam a migração endotelial, proliferação, sobrevida e atividade proteolítica. Entre os fatores descritos na literatura, o VEGF e as angiopoietinas (Ang) têm emergido como reguladores críticos do processo pró-angiogênico 3,7,83. Essas moléculas promovem a formação de novos vasos e sua morfogênese, por meio de um complexo processo de eventos angiorregulatórios 8,81.

22 22 VEGF, membro da família do VEGF A, é um fator de crescimento específico do endotélio 9,10. Ele age, principalmente, ativando dois receptores do tipo tirosina quinase Flt-1 (fms-like tyrosine kinase-1, VEGF receptor-1) 11 e KDR (kinase-insert domain-containing receptor, VEGF receptor-2) 12, mas também pode ativar outros receptores como neuropilin-1 e VEGF 165 tem sido intensamente pesquisado. Inicialmente administrado por injeção intramuscular direta do DNA plasmidial, em doença arterial periférica de membros inferiores, demonstrou produzir melhora da circulação colateral e da perfusão das extremidades 84. Mais recentemente foi conduzido um estudo clínico para avaliar a segurança e a bioatividade da transfecção intramiocárdica de DNA plasmidial em pacientes considerados inoperáveis por cardiopatia isquêmica avançada. O gene foi injetado diretamente no miocárdio, por minitoracotomia esquerda, em 20 pacientes, como única terapêutica. Não ocorreram complicações. Todos os 16 pacientes acompanhados até 90 dias apresentaram redução significativa da angina e 100% dos que completaram 6 meses estavam livres de angina. A cintilografia miocárdica mostrou redução dos defeitos isquêmicos em 13 de 17 pacientes aos 60 dias 16,17,85. Em 1998, Losordo et al. 18 conduziram o primeiro ensaio clínico testando terapia gênica com VEGF 165 em pacientes com angina refratária. Este estudo demonstrou as primeiras evidências de segurança e dados observacionais sobre sintomas e perfusão miocárdica. Em estudo subseqüente, Laitinen et al. 86, demonstraram um método menos invasivo de administração VEGF 165 plasmidial, via infusão intra-coronariana, sendo este método, seguro e executável. O estudo KAT 81 (Kuopio Angiogenesis Trial), teve como objetivo avaliar a segurança da terapia gênica com VEGF 165 intracoronária, quando administrada ao tempo da angioplastia coronariana com stent, avaliando o quanto a terapêutica com VEGF 165 pode prevenir a reestenose e melhorar a perfusão miocárdica. Foram randomizados 103 pacientes sintomáticos que iriam

23 23 realizar angioplastia coronariana para receber infusões intracoronárias de VEGF 165 adenoviral, VEGF 165 plasmidial ou placebo, no momento da angioplastia. Concluíram que a terapia com VEGF 165 durante angioplastia parece segura, mas os investigadores não encontraram diferenças na taxa de reestenose 6 meses após o tratamento. Em relação à perfusão miocárdica, entretanto, houve aumento em 6 meses de acompanhamento nos pacientes submetidos a administração de VEGF 165 adenoviral 81. O Euroinject One Trial 7 foi um estudo randomizado, duplo-cego, placebo-controlado em pacientes com DAC sintomática, que não eram candidatos a revascularização cirúrgica. Oitenta pacientes foram eleitos para receber injeção de VEGF 165 plasmidial ou plasmídeo placebo na área miocárdica isquêmica identificada por mapeamento eletromecânico (MEM) e SPECT. O plasmídeo foi administrado por injeção via endocárdica utilizando-se o sistema NOGA. Após 3 meses de acompanhamento, a perfusão miocárdica avaliada em estresse e a classe de angina (CCS) não foram diferentes entre os dois grupos, mas escores de movimentação regional da parede miocárdica e a função ventricular esquerda melhoraram no grupo tratado com VEGF Ao final do estudo, uma análise utilizando um método alternativo de interpretação do escore de movimentação regional da parede miocárdica e da perfusão miocárdica revelou alguma evidência de melhora nos pacientes tratados com VEGF Ripa et al. 83 realizaram um estudo piloto com o uso combinado de terapia gênica com VEGF 165 e mobilização de células tronco em pacientes com DAC, sendo estes, sintomáticos e não candidatos à revascularização. Dezesseis pacientes receberam injeções intramiocárdica de VEGF 165 plasmidial seguido da administração, uma semana após, do fator de estimulação de colônias de granulócitos (G-CSF) visando à mobilização de células progenitoras da medula óssea no grupo tratado. O grupo controle foram os 16 pacientes tratados com VEGF 165 e os 16 tratados com plasmídeo placebo do estudo Euroinject One Trial. O número de células progenitoras

24 24 (identificadas via CD34) aumentou consideravelmente após o tratamento com G-CSF, mas não houve melhora nos desfechos primários de mudança na perfusão miocárdica de estresse 83. Recentemente, relato de Reilly apresentou resultados de terapia gênica com VEGF em pacientes sem outras opções terapêuticas. Foram 30 pacientes com angina classe III ou IV que receberam injeção intramiocárdica via toracotomia de VEGF 2. Esses pacientes foram seguidos para eventos clínicos depois de um ano por registros hospitalares, visitas ou contato telefônico. Um paciente teve óbito perioperatório. A média de seguimento foi de 751±102,5 dias. Houve 4 óbitos (13,8%), 5 infartos do miocárdio (17,2%) e 7 procedimentos de revascularização (24,1%). Também houve 15 hospitalizações em 12 pacientes. No fim do seguimento nenhum paciente se encontrava em classe IV de angina, 3 pacientes (11,5%) estavam em classe III e 23 pacientes (88,5%) estavam em classe I ou II. Esse estudo permitiu associar a terapia gênica com VEGF 2 com a melhora dos sintomas de angina na maioria dos pacientes após o primeiro ano de tratamento. Eventos clínicos maiores como óbito, infarto do miocárdio e novos procedimentos de revascularização foram incomuns durante o primeiro ano, mas tornaram-se mais frequentes após esse período. A maioria desses eventos em longo prazo seriam resultado da progressão da doença de base em áreas cardíacas afastadas dos locais de infusão de terapia gênica 88. Em abril de 2008, Marc Ruel publicou um estudo realizado na Universidade de Otawa, no Canadá, onde investigou a associação entre VEGF 165 e L-arginina. Participaram do estudo 19 pacientes cardiopatas isquêmicos graves que foram randomizados da seguinte forma: grupo 1: Placebo para injeção intramiocárdica de VEGF placebo para suplementação pós-operatória de L-arginina; grupo 2: Injeção intramiocárdica de VEGF placebo para suplementação pósoperatória de L-arginina; grupo 3: Placebo para injeção intramiocárdica de VEGF suplementação pós-operatória de L-arginina e grupo 4: Injeção intramiocárdica de VEGF suplementação pós-operatória de L-arginina. A suplementação com L-arginina foi realizada via

25 25 oral por três meses. Foram avaliadas mudanças na perfusão e contratilidade miocárdica anterior através de tomografia por emissão de pósitrons (PET scan) e ecocardiografia. Pacientes que receberam a combinação de VEGF e L-arginina demonstraram melhora na perfusão da parede anterior observada no PET scan (p=0,02) e melhora da contratilidade da parede anterior (p=0,02) em três meses quando comparados ao começo do estudo. Os resultados sugerem segurança e eficácia na intervenção. De fato, foi demonstrado que a L-arginina é clinicamente segura e tem efeitos benéficos sobre o NO 19. Em estudo multicêntrico recente (Northern Trial), Stewart e cols (2009) 20, realizaram um estudo duplo-cego, controlado por placebo. Este envolveu sete centros do Canadá e um total de 93 pacientes com CCS 3 ou 4, os quais foram randomizados para receber g de VEGF 165 plasmidial ou placebo por via endocárdica sob orientação do cateter eletroanatômico NOGA. Não houve diferença entre o grupo tratado com VEGF e placebo em relação à perfusão miocárdica no período basal, 3 e 6 meses, avaliados por SPECT. Observou-se redução significativa da área isquêmica observada em ambos os grupos. Melhoras no tempo do teste ergométrico e sintomas anginosos foram observados em ambos os grupos em 3 e 6 meses, não havendo diferença entre os grupos 20. A eficácia da angiogênese terapêutica por injeção intramiocárdica de pck-vegf 165 em modelo suíno de infarto agudo do miocárdio foi relatada por Choi e colaboradores em Aos 30 dias após o infarto e injeção de pck-vegf 165 na sua zona de transição, não houve diferença nos parâmetros de perfusão segmentar, espessamento parietal e contratilidade entre os grupos controle e tratado. Aos 60 dias, entretanto, o grupo tratado mostrou melhora significativa, tanto em relação ao 30º dia (p<0,05) nos parâmetros citados, como em relação ao grupo controle para perfusão segmentar (p=0,018), contratilidade (p=0,004) e espessura (p=0,068). A análise

26 26 histológica mostrou aumento significativo na microvasculatura do grupo tratado em relação ao controle (p<0,001) 89. Evidencia-se desse modo a aplicabilidade clínica do VEGF 165 em humanos, visto que estudos experimentais mostram resultados favoráveis e estudos iniciais em humanos não relatam efeitos adversos relacionados. Ensaios atuais relatam que o uso de altas doses de rhvegf, quando comparado com baixas doses e com placebo, melhora a perfusão miocárdica em pacientes com angina estável severa e fornece evidências de um efeito positivo dosedependente 90, 91. Também como alternativa a pacientes sem outras possibilidades terapêuticas foi desenvolvido o estudo The VIVA Trial, designado a avaliar a segurança e eficácia da infusão intracoronariana e intravenosa de rhvegf (recombinante humano de fator de crescimento endotelial vascular). Assim, 178 pacientes foram randomizados para receberem placebo, baixa dose de rhvegf ou alta dose de rhvegf por infusão intracoronariana no dia 0, seguido por infusão intravenosa nos dias 3, 6 e 9. Teste ergométrico em esteira e avaliações da classe de angina e da qualidade de vida foram realizados no início dos procedimentos, dia 60 e dia 120. Imagens de perfusão miocárdica foram obtidas no início dos procedimentos e no dia 60. Esse estudo mostrou que rhvegf é seguro e bem tolerado. Nas mensurações feitas no dia 60, rhvegf não ofereceu melhora além do placebo em nenhum dos testes. Porém no dia 120, altas doses de rhvegf resultaram em significativa melhora na angina dos pacientes e tendência favorável no tempo de teste de esteira ergométrica e na freqüência de episódios de angina 90. Quanto à via de injeção do VEGF, não se pode ainda estabelecer qual o método mais adequado. Foi demonstrada segurança e melhora na perfusão miocárdica em pacientes tratados com VEGF adenovírus injetado por cateter durante ACTP após 6 meses de seguimento 81. Por outro lado, a injeção intramiocárdica apresentou melhora na contratilidade da parede ventricular tanto na avaliação pelo método NOGA, quanto pela ventriculografia podendo indicar um

27 27 provável efeito anti-isquemia, mesmo sem apresentar evidência de melhora na perfusão miocárdica induzida por estresse 7. Na pesquisa experimental há sugestões de outros papéis para o VEGF. Foi descoberto efeito mitogênico em cardiomiócitos adultos, induzido por terapia gênica com VEGF. Estudo posterior pesquisou hiperplasia de cardiomiócitos induzida pelo VEGF através de citocinese de cardiomiócitos. Cinco semanas após indução de isquemia e injeção intramiocárdica de VEGF, o grupo tratado apresentou 22% mais cardiomiócitos por unidade de volume além de um número significativamente maior de cardiomiócitos oligonucleados (1 ou 2 núcleos) quando comparado com o grupo controle. Desse modo, a transferência gênica de VEGF induziu citocinese de cardiomiócitos em porcos com miocardiopatia isquêmica crônica, como revelado pela hiperplasia de cardiomiócitos. Esse estudo confirma o já reportado efeito mitogênico de VEGF em cardiomiócitos adultos e dá suporte à hipótese que o VEGF pode ter um papel terapêutico em doenças caracterizadas por perda de células miocárdicas 92. Quanto à angiogênese por terapia celular, estudo experimental de Huang et al. 93 investigou a ação das célula-tronco mesenquimais (MSCs) do miométrio e a contribuição da progesterona sobre a indução à angiogênese e a melhora da perfusão em miocárdio isquêmico. Constatou-se a significativa capacidade de indução de angiogênese, principalmente nos vasos arteriolares e melhora da função cardíaca após tratamento. É de suma importância relatar as limitações dos modelos pré-clínicos e as diferenças entre os modelos animais e os pacientes incluídos em ensaios clínicos de terapêutica cardiovascular. Os animais utilizados em estudos pré-clínicos são geralmente jovens e saudáveis, enquanto os pacientes são tipicamente idosos com múltiplas comorbidades. Estudos clínicos e epidemiológicos indicam que a idade é um forte preditor de doença avançada 94, 95 da mesma forma, animais com idade têm menos probabilidade de se recuperar de doenças vasculares e

28 28 isquêmicas 96. Esse comprometimento parece evoluir, pelo menos em parte, quanto as deficiências no recrutamento de células angiogênicas e quanto à expressão do fator de crescimento 97, 98. A eficácia da terapia gênica pode ser prejudicada pela espécie, idade e em relação as diferentes condições de saúde entre os modelos animais e populações clínicas, mas também por diferenças biológicas na expressão genética. Além disso, a incapacidade para quantificar precisamente a expressão do gene prejudica o projeto experimental 48. Os estudos realizados até o momento não apresentavam o número de pacientes necessário para quantificar o potencial benefício da terapia gênica, com parâmetros inequívocos como a mortalidade ou o salvamento do membro, no caso de isquemia periférica. Em vez disso, os pesquisadores têm procurado identificar outros parâmetros e desfechos que podem fornecer evidências objetivas da bioatividade e melhora clínica Vetor Plasmidial Transferência gênica para o miocárdio tem sido utilizada como estratégia alternativa para se obter uma expressão local sustentada das proteínas angiogênicas 99. Vetores comuns para transporte incluem plasmídeos carreadores de cdna nu e vetores virais como adenovírus, lentivírus e retrovírus. Vantagens e desvantagens em relação ao vetor empregado incluem o tamanho do gene inserido, o sítio de incorporação no núcleo, a duração da expressão, a eficiência da transferência e o grau de resposta imune do organismo 100. O vetor plasmidial é expresso por apenas alguns dias após administração e o vetor viral apresenta expressão do gene por algumas semanas 101. Assim, os estudos clínicos que tentam tratar a fase final da doença isquêmica através da terapia gênica podem ser limitados por duração inadequada da exposição ao agente angiogênico 48.

29 29 O vetor ideal seria aquele que combinaria baixa imunogenicidade e um perfil de segurança satisfatório, com alta eficiência de transfecção e expressão do transgene para períodos de tempo específicos 48. Vetores plasmidiais não têm limite de tamanho de gene a ser inserido e induzem mínima resposta imune, o que resulta em expressão transgênica sustentada. A desvantagem é a baixa taxa de transferência do gene codificador do fator angiogênico. Em contraste, vetores virais têm alta eficiência na transferência dos genes de fator angiogênico para as células alvo, mas podem induzir significativa resposta imune do organismo hospedeiro, o qual limita a expressão transgênica sustentada 102. A transferência de VEGF 165 plasmidial tem se mostrado segura, segundo a literatura. Em séries de terapia gênica, como já citado anteriormente, a única morte acontecida foi reportada num paciente de 18 anos em setembro de Neste caso, o óbito foi devido a um processo inflamatório contra o vetor usado (vetor viral baseado em adenovírus, em doses altas). O paciente era portador de um distúrbio metabólico, de origem genética, denominada deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC), que tem como principal conseqüência a não eliminação de amônia e foi convidado pelo seu pediatra para participar de um projeto de pesquisa fase I, envolvendo terapia gênica para este distúrbio, no Institute for Human Gene Therapy (IHGT) da Universidade da Pennsylvania/EUA, em conjunto com a empresa Genovo. Foi administrada uma infusão, na artéria hepática, do gene de correção da OTC, utilizando vetor adenoviral. Ele teve uma séria reação imunológica atribuída ao vetor e faleceu quatro dias após, quando foi constatada sua morte encefálica, sendo o primeiro paciente a morrer em um ensaio clínico de terapia gênica 103. Já outra paciente tratada com uma dose similar (a dose mais alta do tratamento) não apresentou efeitos colaterais. Uma das explicações desta resposta imunológica foi que, provavelmente, o paciente tinha sido infectado anteriormente com um adenovírus do mesmo

30 30 sorotipo ou algum outro que apresentou reação cruzada. Casos de leucemia desenvolvida em 2 de 10 pacientes com a doença SCID-XI na França, também aconteceram em procedimentos de terapia gênica com vetores virais. O plasmídeo pode ser aplicado na sua forma mais pura, diluído em solução fisiológica e, por este motivo, a metodologia é conhecida como DNA desnudo, já que ele não está coberto por nenhum material, sejam estes materiais compostos catiônicos ou as estruturas virais dos vetores virais 104. Por outro lado, este plasmídeo atua na forma epissomal, ou seja, ele não se integra no genoma. Este é um ponto importante, pois os problemas relacionados com a ativação de protooncogenes durante a integração são mínimos. Ao mesmo tempo, a sua não-integração permite que a expressão do transgene (proteína VEGF 165 ) seja transitória devido a sua degradação e/ou diluição ao longo do tempo. Vários estudos utilizando plasmídeos epissomais mostraram que a expressão do transgene é mantida entre 1 e 2 meses, o que representa uma vantagem deste sistema no tratamento com VEGF Vias de Administração A efetividade da terapia gênica depende dos genes, dos vetores e da forma de administração. Na terapêutica cardiovascular, as formas possíveis são: injeção por cateter intraventricular, injeção pericárdica, via epicárdica, injeção intramiocárdica, intra-arterial coronariana associada ou não a angioplastia e adventicial em vasos ou enxertos de veia safena. Na indução de angiogênese miocárdica, as vias mais utilizadas têm sido a epicárdica por lipossomas e a intramiocárdica 78. Há precauções em relação à injeção intra-arterial, pela possibilidade de difusão dos vetores na corrente sangüínea, embora haja estudos, tanto isolados

31 31 como multicêntricos, com administração intracoronária e intravenosa de FGF e VEGF, utilizando proteína recombinante e vetores adenovirais. Estudos anteriores sobre terapia gênica sugerem que a administração intracoronária e periférica entregam de forma inadequada quantidades do vetor para o sítio de destino 105, 106. Já a injeção intramuscular oferece a possibilidade de uma oferta mais eficiente em áreas focais de músculo isquêmico População, Segurança, Benefícios e Potenciais Riscos do Uso da Terapia Gênica Quase todos os ensaios clínicos de terapia gênica têm como população de estudo pacientes em fase terminal da doença isquêmica, cujas opções terapêuticas convencionais já se esgotaram, uma vez que o possível maior risco em relação ao benefício associado aos novos tratamentos são mais aceitáveis. Entretanto, os pacientes com doença cardiovascular avançada, muitas vezes têm sofrido décadas de deterioração sistêmica, onde a terapia pode não conduzir a uma melhoria mensurável, mesmo quando o tratamento é benéfico 48, 107. Mais de pacientes foram incluídos em ensaios clínicos controlados de terapia gênica, abrangendo mais de uma década e até agora, com exceção dos casos relatados anteriormente e que tem explicações específicas, nenhum sinal de segurança adversa foi detectado. Relatórios de retinopatia, câncer, ou outras doenças que podem ser impulsionadas pelo crescimento vascular foram percebidos como igualmente distribuídos em grupos tratado e placebo. Conclusões mais definitivas sobre riscos e complicações exigirão maiores tempo de acompanhamento e número de pacientes submetidos à terapia 48. Quinze anos se passaram desde os primeiros relatos de terapia gênica em humanos. O amplo número de estudos pré-clínicos demonstram a bioatividade dos genes transplantados e

32 32 vários ensaios clínicos indicam que a terapia é segura, viável, e potencialmente eficaz, embora não tenham produzido evidências conclusivas de benefício. Assim, para continuar a desenvolver esta abordagem terapêutica promissora, devemos avaliar criticamente os resultados experimentais e os protocolos para identificar fatores que podem ter prejudicado a eficácia da terapia ou dados confundidores de interpretação 48. A terapia gênica pode resultar na desregulação da expressão da proteína inoculada e a expressão contínua do VEGF tem sido associada com a formação de tumores vasculares intramurais e na diminuição da sobrevida em modelos animais 108. Com o avanço da engenharia genética e o maior conhecimento das técnicas de purificação, espera-se que tais complicações sejam controladas 108. Existem questionamentos em relação à segurança da transferência de fatores angiogênicos, e também em relação ao tempo de expressão 109, onde se sabe que os plasmídeos carreadores de proteínas de fatores angiogênicos, por terem expressão mais curta e não se incorporarem ao DNA da célula à qual vão se ligar, têm menor risco deste efeito adverso. A gênese, crescimento e manutenção da neovascularização ocorrem através de interações complexas e entre mecanismos envolvidos na vasculogênese, angiogênese e arteriogenêse 110,111. As direções futuras da terapia gênica apontam prováveis combinações de fatores angiogênicos, ou fatores individuais (HIF-1α) que ativam diversas vias de neovascularização. As combinações de terapia celular e de fatores angiogênicos, bem como o uso de biomateriais para melhorar o microambiente são outras estratégias promissoras para o reparo isquêmico tecidual ENSAIOS CLÍNICOS CONTROLADOS DE TERAPIA GÊNICA Na tabela abaixo, procuramos sintetizar a experiência existente, nesta relação de ensaios clínicos controlados envolvendo terapia gênica visando à terapêutica cardiovascular.

33 33 Autor Tratamento Administração Grupo ativo (n)/ Placebo (n) Características pacientes Phase I/II VEGF 2 Intramiocárdica 12/7 Doença arterial VEGF plasmidial percutânea via coronariana, não Losordo mapeamento passíveis de et al 10 eletromecânico revascularização, angina refratária, CCS Ensaio Clínico (3/4) Controlado Mäkinen VEGF 165 Percutânea intraarterial VEGF-ad (18) Doença arterial et al 84 adenoviral e seguida de VEGF- P (17) periférica adequada plasmidial angioplastia Placebo (19) para angioplastia Ensaio Clínico Controlado RAVE VEGF 121 Intramuscular Alta dose (40) Doença arterial Rajagopalan adenoviral Baixa Dose (32) periférica, limitação ao et al 112 Placebo (33) exercício, claudicação Ensaio Clínico Controlado Acompanhamento Desfechos 12 semanas Mudança da CCS e tolerância ao exercício 3 meses Angiografia digital 12 semanas Mudança do pico e do tempo de andar em relação à linha de base Resultados Melhora da CCS - grupo VEGF 2 versus placebo (-1.3 versus -0.1, P=0.04); tolerância ao exercício (91.8 versus 3.9 segundos) Angiografia digital revelou aumento da vascularização distalmente do local de tranferência de genes no grupo VEGF- P e na região isquêmica no grupo VEGFad (VEGF-ad P=0.03; VEGF-P P=0.02) A mudança do pico e do tempo de andar não diferiram entre os grupos alta dose (1.5+/- 3.1 minutos), baixa dose (1.6+/-1.9 minutos) e placebo