Leonardo Pereira Franchi

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1 Leonardo Pereira Franchi Citotoxicidade e genotoxicidade de nanotubos de carbono purificados e não purificados, sintetizados por deposição química de vapor, em linhagem de fibroblastos de pulmão de hamster Chinês (V79) Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção de título de Mestre em Ciências. Área de Concentração:Genética Orientadora: Profª. Dra. Catarina Satie Takahashi Ribeirão Preto 2010

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3 Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. FICHA CATALOGRÁFICA Franchi, Leonardo Pereira Citotoxicidade e genotoxicidade de nanotubos de carbono purificados e não purificados, sintetizados por deposição química de vapor, em linhagem de fibroblastos de pulmão de hamster Chinês (V79). Ribeirão Preto, p. Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Universidade de São Paulo. Área de concentração: Genética. Orientadora: Profª. Dra. Catarina Satie Takahashi 1. Citotoxicidade. 2. Genotoxicidade. 3. Nanotubos de carbono. 4. Ensaio Cometa. 5. Teste do micronúcleo.

4 Apoio e Suporte Financeiro Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro das seguintes entidades e instituições: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FAEPA-HC/FMRP-USP) Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP) Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FFCLRP-USP)

5 SUMÁRIO RESUMO...I ABSTRACT...II 1. INTRODUÇÃO Nanociência, nanotecnologia e nanopartículas Nanotoxicologia e Nanogenotoxicologia Nanotubos de carbono Métodos de síntese e purificação de nanotubos de carbono Nanotubos de carbono e penetração celular Aplicações dos nanotubos de carbono Interações entre CNT e constituintes do meio de cultura Toxicidade de nanotubos de carbono OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS Nantubos de carbono e substâncias químicas utilzadas Nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT) Nanotubos de carbono do tipo cup-stacked (CSCNT) Dispersão dos nanotubos de carbono Controle positivo - Doxorrubicina (DXR) Controle negativo Citocalasina B Cultura de células da linhagem V Viabilidade celular Enaio clonogênico Ensaio Cometa Ensaio Cometa para detecção de danos oxidativos Teste do micronúcleo...25

6 3.6.1 Índice de Divisão Nuclear (IDN) Análise estatística dos dados RESULTADOS Viabilidade celular Efeito dose-resposta (Viabilidade celular) Valores de IC 50 (Viabilidade celular) Ensaio clonogênico Concentrações testadas nos experimentos de genotoxicidade Ensaio Cometa em V Teste do micronúcleo em células V Índice de Divisão Nuclear (IDN) Frequência de micronúcleos (MN) Frequência de pontes nucleoplasmáticas (PN) DISCUSSÃO Aspectos gerais Citotoxicidade de nanotubos de carbono Ensaios de viabilidade celular Ensaio clonogênico Genotoxicidade de nanotubos de carbono Detecção de quebras de fita do DNA e danos oxidativos Detecção de danos cromossômicos pelo teste de micronúcleo Disposições finais CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...62 ANEXO A (Gráficos de Viabilidade celular)...04

7 ANEXO B (Gráfico de Ensaio clonogênico)...10 ANEXO C (Gráfico de Índice de Divisão Nuclear)...89 ANEXO D (Gráfico da Frequência de Micronúcleos)...39 ANEXO E (Gráfico da Frequência de Pontes Nucleoplasmáticas)...31

8 RESUMO Muitas nanoestruturas vêm sendo desenvolvidas, e atualmente uma das áreas de maior atividade é o estudo de nanotubos de carbono (CNT). Os CNT consistem exclusivamente de átomos de carbono arranjados em uma série de anéis benzeno condensados em uma estrutura tubular, com diâmetro em escala nanométrica. Existem diferentes tipos de nanotubos, dentre eles podem-se destacar os: (i) nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT) e, (ii) nanotubos de carbono "cup-stacked" (CSCNT), ainda pouco estudados, que consistem de múltiplas camadas de grafeno arranjados em forma de cone, as quais exibem pontas abertas em sua superfície externa e um canal central vazio. Muitas aplicações biológicas foram propostas para os CNT incluindo biosensores, veiculadores de drogas e vacinas entre outros biomateriais. Contudo, antes que estes materiais possam ser incorporados, há a necessidade de se conhecer seus efeitos citotóxicos e genotóxicos. No presente trabalho, avaliaram-se os efeitos de amostras purificadas (MWCNT e CSCNT_pu) e amostras não purificadas de CNT (CSCNT_np contendo Co e Mn como resíduos metálicos e CSCNT_Fe contendo Ferro como resíduos), sintetizadas pelo método CVD, sob a viabilidade celular (kit XTT Roche), capacidade de formação de colônias e, indução de danos no DNA (ensaio Cometa e teste do Micronúcleo) em células V79. Após 24 h do tratamento, observou-se uma redução significativa (p<0,05) da viabilidade celular para todos os CNT testados em concentrações maiores ou iguais a 25 µg/ml. Apesar desta citotoxicidade inicial, com o aumento do tempo pós-exposição as células V79 mostraram uma recuperação da viabilidade celular. Além disso, CSCNT_pu e CSCNT_np apresentaram o maior efeito sofre a viabilidade celular, que podem ser explicadas pelas características físico-químicas destes tubos e da presença dos catalisadores metálicos cobalto e manganês. A capacidade de formar colônias também foi afetada pelos CNT testados. Após 7 dias de exposição, o número de colônias foi reduzido (p<0,05) em cerca de: 35 e 52% por 25 e 50 µg/ml de MWCNT; 29% por 50 µg/ml de CSCNT_pu; e 55, 66, 94 e 99% por 6.25, 12.5, 25 e 50 µg/ml de CSCNT_np, respectivamente. CSCNT_Fe não demonstrou reduções significativas no número de colônias. MWCNT e CSCNT_np avaliados pelo ensaio Cometa não induziram um aumento significativo de

9 quebras no DNA. Já quando os danos oxidativos foram avaliados, por meio do emprego das enzimas hogg1 e Endo III observamos um aumento significativo de danos no DNA. Em baixas concentrações (1.5 a 12.5 µg/ml) MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np e CSCNT_Fe não afetaram o índice de divisão nuclear. MWCNT induziu (p<0,05) uma frequência de 42 micronúcleos nas concentrações de 6.25 e 12.5 µg/ml. Levando-se em conta que não houve um aumento proeminente de quebras no DNA induzidas (detectados pelo ensaio Cometa) por MWCNT, pode ser definido que uma atividade clastogênica/aneugênica caracteriza o mecanismo de ação de MWCNT. MWCNT também aumentou discretamente a frequência de pontes nucleoplasmáticas, e um aumento significativo foi observado na concentração de µg/ml de CSCNT_pu. Indicando que estes CNT estão envolvidos na indução de quebras e rearranjos cromossômicos em células V79. Em conjunto, os resultados apontam para uma resposta geral positiva na indução de danos no DNA.

10 ABSTRACT Many nanostructures have been developed, and currently the area of major activity is the study of carbon nanotubes (CNT). The CNT consisting of carbon atoms arranged in a series of benzene rings condensed in a tubular structure with diameters in the nanometer scale. There are different kinds of nanotubes, among them it is possible highlight: (i) multiwalled carbon nanotubes (MWCNT), and (ii) cup-stacked carbon nanotubes (CSCNT), yet little studied, consisting of multiple graphene layers arranged in a cone shape, with open edges on its outer surface and a center channel empty. Many biological applications have been proposed for the CNT including biosensors, drug and vaccines delivery and other biomaterials. However, before these materials can be incorporated, there is a need to know their cytotoxic and genotoxic effects. In this study, we evaluated the effects of purified samples (MWCNT and CSCNT_pu) and not purified samples (CSCNT_np - containing Co and Mn as metallic residues, and CSCNT_Fe containing iron as residues), synthesized by CVD method, on cell viability (kit XTT Roche), colony-forming ability and induction of DNA damage (Comet assay and micronucleus test) in V79 cells. After 24 h of treatment, we observed a significant reduction (p <0.05) of cell viability, for all CNT tested, at concentrations greater than or equal to 25 µg/ml. Despite this initial cytotoxicity, with increasing time post-exposure, V79 cells showed a recovery of cell viability. In addition, CSCNT_pu and CSCNT_np had the greatest effect on cell viability, which can be explained by physical and chemical characteristics of these tubes and the presence of metal catalysts. The ability to form colonies was also affected by the CNT tested. After 7 days of exposure, the number of colonies was reduced (p <0.05): 35 and 52% by 25 and 50 µg/ml of MWCNT, 29% by 50 µg/ml of CSCNT_pu, and 55, 66, 94 and 99% by 6.25, 12.5, 25 and 50 µg/ml by CSCNT_np, respectively. CSCNT_Fe not showed significant reductions in the number of colonies. MWCNT and CSCNT_np evaluated by Comet assay did not induce a significant increase in DNA breaks. However, when the oxidative damage was evaluated through the use of enzymes Endo III and hogg1 a significant increase in DNA damage was observed. At low concentrations (1.5 to 12.5 µg/ml) MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np and CSCNT_Fe not affect the nuclear division index. MWCNT induced (p

11 <0.05) frequency of 42 micronuclei at concentrations of 6.25 and 12.5 µg/ml. As we not observed an increase of single or double DNA strand breakage (Comet assay) induced by MWCNT, it can be defined a clastogenic/aneugenic activity as mechanism of action of MWCNT. MWCNT also slightly increased the frequency of nucleoplasmatic bridges, and a significant increase was observed at a concentration of µg/ml of CSCNT_pu. Indicating that CNT are involved in the induction of chromosomal breaks and rearrangements in V79 cells. Together, the results indicate a generally positive response in the induction of DNA damage.

12 1. INTRODUÇÃO 1.1 Nanociência, nanotecnologia e nanopartículas: A idéia de ciência em escala nanométrica surgiu em um seminário do físico, ganhador do prêmio Nobel, Richard Feynman em 1959, e a extraordinária possibilidade da nanociência em relação à manipulação molecular foi discutida por Drexler em O rápido desenvolvimento em nanotecnologia levou, assim como avanços tecnológicos, à predição de grandes benefícios e também de grandes perigos à humanidade e aos ecossistemas. Nanopartículas (NP) podem ser definidas como substâncias que contenham pelo menos uma dimensão menor do que 100 nm (Colvin, 2003). Em geral as nanopartículas podem ser categorizadas como materiais baseados em carbono tais como fulerenos e nanotubos de carbono; nanopartículas inorgânicas baseadas em metais óxidos (óxido de zinco, óxido de ferro, dióxido de titânio, óxido de cério); metais (ouro, prata e ferro); e pontos quânticos (sulfido de cádmio, selenido de cádmio) (Colvin, 2003). A mistura de NP de diferentes origens também pode ser realizada. Estes materias apresentam-se de diferentes formas, como, por exemplo, esferas, tubos, hastes e prismas. Assim, a nanotecnologia visa a inclusão e a integração destas estruturas nanométricas como componentes de materiais e sistemas (Ju-Nam & Lead, 2008). Em algumas estimativas, a nanotecnologia promete exceder os impactos da Revolução Industrial e está projetado que em 2015 se torne um mercado de um trilhão de dólares. As NP já estão sendo usadas em materiais esportivos, pneus, roupas resistentes a manchas, protetores solares, cosméticos e eletrônicos, e também poderá ser amplamente utilizado na medicina em aplicações terapêuticas e para diagnósticos (como contrastes para imagens e como carreadores de drogas) (NEL et al., 2006). Em 2004, a produção anual, de NP alcançou 1000 toneladas. Estima-se que atualmente existam cerca de 800 produtos de uso diário baseados em nanotecnologia e que muitos novos nanoprodutos entrarão no mercado nos próximos anos (Rejeski & Lekas, 2008).

13 O principal objetivo em nanociência é tentar entender como os materiais se comportam quando o tamanho está próximo à dimensão atômica. Uma das metas da ciência é a miniaturização e, consequentemente a nanotecnologia vem recebendo considerável atenção. Além da possibilidade de novas aplicações e dispositivos das nanoestruturas, a grande popularidade deste campo refere-se aos fenômenos que ocorrem na escala nanométrica, sendo estes de interesse de físicos, químicos, biólogos, engenheiros mecânicos e elétricos, e cientistas computacionais (Cohen, 2001). Com a diminuição do tamanho aumenta-se exponencialmente a porcentagem dos átomos que se encontram na área de superfície das partículas, consequentemente tornando estes materiais altamente reativos. Esta relação superfície/volume, juntamente com o pequeno tamanho e forma, confere propriedades específicas distintas do material massivo de mesma composição química (Auffan et al., 2009). E assim novas propriedades podem surgir, tais como catalisadores desejáveis para reações químicas (Oberdörster et al., 2005). Nanopartículas com tamanhos menores que 20-30nm são caracterizadas por um excesso de energia em sua superfície e são termodinamicamente instáveis (Auffan et al., 2009). Além das propriedades físico-químicas serem atribuídas ao pequeno tamanho das NP, propriedades incomuns também se devem à composição química (pureza, cristalinidade, propriedades elétricas, etc.), estrutura da superfície (reatividade da superfície, grupos da superfície, cobertura orgânica ou inorgânica, etc.), solubilidade, forma e agregação. Embora pareçam impressionantes a partir do ponto de vista físico-químico, as novas propriedades de nanomateriais levanta preocupações a cerca de efeitos adversos em sistemas biológicos (Nel et al., 2006). 1.2 Nanotoxicologia e Nanogenotoxicologia: Embora os produtos baseados em nanomateriais beneficiem seus usuários e o crescimento da economia global, como consequência haverá um aumento da exposição de pesquisadores, trabalhadores e consumidores aos materiais potencialmente perigosos os quais podem causar efeitos nocivos (Singh et al., 2009). Trabalhadores envolvidos na síntese, transporte ou manuseio de nanopartículas já estão sendo expostos a estes materiais que são produzidos principalmente em forma de pó a granel (Hussain, 2009).

14 As NP estão sendo designadas para uma ampla variedade de aplicações, de cunho terapêutico, diagnóstico, eletrônico, etc. Assim, com uma necessidade óbvia da avaliação toxicológica de partículas e fibras na escala nanométricas, nasce o campo da Nanotoxicologia, atualmente definida como a ciência de nanodispostivos e nanoestrururas que lida com seus efeitos em organismos vivos (Donaldson et al., 2007). A exposição às NPs pode ocorrer por inalação, contato com a epiderme e ingestão. A via de inalação tem sido a rota mais estudada quando comparado com as outras (Borm & Kreyling, 2004). No entanto, como também estão sendo designadas para aplicações terapêuticas e diagnósticas pode ocorrer a exposição ao trato digestivo e aos vasos sanguíneos poderá ocorrer (Donaldson et al., 2007). Na verdade, alguns estudos já demonstram que NP não são inerentemente seguras e que afetam o comportamento biológico em nível celular, subcelular e protéico (Service, 2004; Colvin, 2003; Royal Society, 2004). Além disso, ao entrarem no organismo as NPs podem depositar-se em órgãos alvos, e assim, acionar respostas nocivas (Nel et al., 2006; Yang et al., 2010). Se os nanomateriais podem deslocar-se através do corpo existe uma variedade de mecanismos diretos e indiretos não desejáveis que podem ser deflagrados, entre eles aqueles que podem promover danos à molécula de DNA. Nanomateirais são capazes de penetrar em células por diferentes mecanismos, e subsequentemente entrar no núcleo: por difusão através da membrana nuclear (se forem pequenos o suficiente); transporte através do poro nuclear; ou podem entrar no núcleo por acaso quando a mitose ocorre durante o processo de divisão celular no momento em que a membrana nuclear se dissolve e se forma novamente em cada célula filha resultante (Singh et al., 2009). Uma vez que as NP encontram-se dentro do núcleo, então uma interação direta entre elas e o DNA ou a proteínas relacionadas ao DNA podem levar a danos físicos no material genético. Chen e von Mikecz (2005) mostraram que NP de dióxido de silica entram no núcleo e provocam a formação de aglomerados de proteínas nucleares que podem levar à inibição da replicação, transcrição e proliferação celular. Alternativamente, danos no DNA podem ocorrer por mecanismos indiretos, nos quais não há interação física com a molécula de DNA, mas com proteínas envolvidas com processo de divisão celular. Além disso, podem induzir outras respostas celulares que

15 induzem genotoxicidade, tais como estresse oxidativo, inflamação e sinalização celular errada (Singh et al., 2009). A presença de resíduos dos catalisadores metálicos (usados no processo de síntese), e a grande área de superfície dos nanomateriais podem promover a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). Atualmente, a geração de EROs é considerada a maior causadora de toxicidade das NP (Donaldson et al., 2007). Como consequência, a exposição às nanopartículas pode afetar, por meio da formação de EROs, a cascata de sinalização celular que controla a proliferação celular, processos inflamatórios e morte celular. O ataque oxidativo ao DNA tem se mostrado um dos efeitos que governam a genotoxicidade de nanopartículas (Karlsson et al., 2008; Papageorgiou et al., 2007). 1.3 Nanotubos de carbono: Uma das áreas de maior atividade em nanociência é o estudo de nanotubos de carbono (CNT) (Service, 2004) que desperta imenso interesse para o emprego como dispositivos e materiais biomédicos. Muitas aplicações para os CNT foram propostas incluindo biosensores, veiculadores de drogas, vacinas entre outros biomateriais (Lin et al., 2004). Os CNT foram descobertos por Iijima em 1991, representando uma forma alotrópica do carbono com uma nanoestrutura que pode ter a proporção do comprimento em relação ao diâmetro maior do que (Shvedova et al., 2009) Os CNT consistem exclusivamente de átomos de carbono unidos por ligações covalentes que estão arranjados em uma série de anéis benzeno condensados em uma estrutura tubular (Lacerda et al., 2006). Dependendo de sua forma estrutural, podem apresentar comportamento metálico ou semi-condutor (Klumpp et al., 2006) e ainda apresentar-se como materiais de superfícies hidrofóbicas. O diâmetro destas estruturas varia de 0,8 a 100 nm, enquanto o comprimento pode alcançar a escala de micrômetros (Kim et al.,2002; Popov, 2004). Existem diferentes tipos de CNT (Figura 1), dentre eles podem ser destacados: SWCNT CNT de paredes simples composto por uma única folha de grafeno; MWCNT CNT de paredes múltiplas, que possuem várias folhas de grafeno arranjadas de forma

16 concêntrica; e os CSCNT - CNT do tipo "cup-stacked", ainda pouco estudados, que consistem de múltiplas camadas de grafeno arranjados em forma de cone, as quais exibem pontas abertas em sua superfície externa e um canal central vazio. Além disso, a superfície dos CSCNT apresenta-se menos hidrofóbicas quando comparadas às dos nanotubos de paredes bem organizadas MWCNT e SWCNT (Moraes et al., 2008). Figura 1. Nanotubos de carbono: a) paredes simples (SWCNT); b) paredes múltiplas (MWCNT); c) do tipo "cup-stacked" (CSCNT). [Figura adaptada de Choi et al., (2005)]. 1.4 Métodos de síntese e purificação de nanotubos de carbono: Existe uma variedade de técnicas de síntese de CNT (Awasthi et al.,2005; Kingston & Simard, 2006). Dentre elas podem ser citadas como principais as seguintes: método de deposição química de vapor (CVD), descarga por arco elétrico e ablação por laser. Todos estes métodos de crescimento consistem basicamente na decomposição de compostos de carbono em carbono atômico, seguido pelo crescimento de nanoestruturas de carbono sobre partículas catalisadoras, tais como Co, Mo, Ni, Fe, etc. (Montoro & Rosolen, 2006). O método CVD é um dos mais utilizados devido às condições experimentais serem de um custo inferior à dos outros métodos descritos, além de se poder ter um controle maior dos elementos envolvidos e, sobretudo, as condições térmicas requeridas que estão abaixo dos 1000 C. O método CVD envolve a reação de decomposição de um vapor ou gás precursor, como fonte de carbono, geralmente um hidrocarboneto, na presença de um catalisador metálico em atmosfera inerte. As partículas catalisadoras ficam depositadas sobre um substrato (por exemplo, Al 2 O 3, zeólito, Si, MgO) ou materiais de carbono (Rosolen et al., 2006). Gases como metano (CH 4 ), (Reyhani et al., 2007), acetileno (C 2 H 2 ),

17 propileno (C 3 H 6 ) (Huang et al., 2003) e líquidos como o xileno (C 6 H 4 (CH 3 ) 2 ) (Andrews et al., 1999), são algumas fontes de carbono utilizadas no processo de CVD. O método CVD possui muitas vantagens em relação a outros, pois pode sintetizar nanotubos com alta pureza, alto rendimento, crescimento seletivo e alto alinhamento (Andrews et al., 1999), sendo a síntese de CSCNT somente observada, até o momento, por meio desse método (Rosolen et al., 2006). O método de descarga de arco elétrico foi utilizado na obtenção dos primeiros CNT registrados (Iijima et al., 1992). Este método baseia-se em uma descarga elétrica gerada entre dois eletrodos de grafite, que são mantidos a uma pequena distância um do outro (menos que 1mm), para que a corrente passe e gere um plasma, aquecendo a grafite que logo depois é condensado na forma de fuligem que contém CNT. O processo ocorre em uma câmara de aço selada, geralmente em um gás inerte. A temperatura do plasma entre os eletrodos é próxima a 4000 C e, nesse sistema, a grafite é sublimada do eletrodo positivo e depositada no eletrodo negativo ou nas paredes da câmara. O material depositado contém nanotubos, normalmente do tipo MWCNT (MacKenzie et al., 2008). No método de ablação por laser a grafite é vaporizada através da irradiação direta de laser sobre a grafite na presença de atmosfera inerte (Guo et al., 1995). O carbono é vaporizado da superfície de um bastão sólido de grafite, em fluxo de hélio ou argônio de velocidade de 0,2 2 cm/s e pressão de 500 torr. Geralmente a vaporização pode variar de 1200 a 4000 C que é próxima à temperatura de fusão do grafite (MacKenzie et al., 2008). Este método produz MWCNT sem a adição de catalisadores metálicos, enquanto, estes são necessários para a síntese de SWCNT (Guo et al., 1995). Contudo, todos os métodos de produção de CNT podem gerar impurezas tais como nanopartículas de grafite, carbono amorfo, fuligem, fulerenos e resíduos dos catalisadores metálicos. E a quantidade de impurezas comumente aumenta com a diminuição do diâmetro dos CNT. Diante de todas essas considerações a respeito da síntese dos CNT, em muitas das suas possíveis aplicações tecnológicas, as impurezas presentes durante o processo de síntese tornam-se um grande problema, já que podem alterar o comportamento dos nanomaterais. Por exemplo, nas aplicações biológicas os catalisadores utilizados no crescimento dos CNT podem estar envolvidos na toxicidade destes materiais.

18 Neste contexto, a purificação dos CNT representa uma importante etapa. E na tentativa de se obterem nanotubos com maior grau de pureza, vários procedimentos de purificação são apresentados na literatura (Rinaldi et al., 2010; Lu et al., 2010). Esses métodos podem ser divididos em três categorias principais: purificação química, física ou uma combinação de ambos. O método químico purifica os CNT baseados na idéia de oxidação seletiva - onde as impurezas carbonáceas são oxidadas a um ritmo mais rápido que os nanotubos de carbono, e da dissolução de impurezas metálicas por ácidos. Este método pode efetivamente remover carbonos amorfos e partículas metálicas, exceto aquelas presas em partículas de grafite poliédricas (Banerjee et al., 2005). Em geral, a oxidação química inclui a oxidação em fase gasosa (usando ar, O 2, Cl 2, H 2 O, etc.); oxidação em fase líquida (tratamentos com ácidos, etc.); e oxidação eletroquímica. Contudo, o método químico sempre influencia na estrutura dos CNT devido a oxidação envolvida (HOU et al., 2008). A desvantagem deste método reside no fato de que ele frequentemente abre as pontas dos nanotubos, produz cortes, gera danos estruturais na superfície e introduz grupos funcionais oxigenados ( OH, C=O, COOH) (Banerjee et al., 2005; Niyogi et al., 2002). A oxidação em fase gasosa é caracterizada por abrir as pontas do nanotubos ou destruir a estrutura dos CNT sem aumentar defeitos nas paredes ou introduzir grupos funcionais. A oxidação em fase líquida introduz grupos funcionais e defeitos, preferencialmente, nas paredes dos tubos, e pode cortar os CNT em pequenos pedaços com diferentes comprimentos. A oxidação eletroquímica é adequada para a purificação de arranjos de CNT sem destruir o alinhamento. O problema mais sério desta técnica é que a estrutura dos nanotubos de carbono pode ser destruída pelos reagentes e, portanto, limita suas aplicações em algumas áreas, por exemplo, como dispositivos eletrônicos (Hou et al., 2008). O método físico separa CNT das impurezas baseados nas diferenças de tamanho, gravidade, solubilidade e propiedades magnéticas. Em geral, o método físico é usado para remover folhas de grafite, nanoesferas de carbono, agregados ou separar CNT com diferentes índices de diâmetro/comprimento. Algumas técnicas como cromatografia e eletroforese podem separar os CNT de acordo com suas diferenças em comprimento ou

19 condutividade (Hou et al., 2008). Em princípio, o método físico não requer oxidação e, portanto previne os CNT de danos. No entanto, este método é sempre complicado, demorado e menos efetivo em remover as impurezas. O terceiro tipo de purificação combina os méritos da purificação física e química, e é comumente denominado de purificação de multi-passos. Este método pode levar à produção de CNT de alta qualidade com alto rendimento, sendo efetivo na remoção de impurezas carbonáceas e metálicas. Este método tem sido amplamente utilizado recentemente. E o mais importante, pode-se seletivamente abrir pontas, cortar e adicionar grupos funcionais nas paredes dos CNT e ainda separá-los de acordo com o comprimento ou condutividade (Hou et al., 2008). O ponto chave deste método geral é como combinar diferentes métodos de acordo com o requerimento e qualidade que se deseja dos CNT. Embora, considerável progresso tenha sido feito, alguns méritos das técnicas físico-químicas não foram completamente usadas e combinadas. Por exemplo, alguns métodos físicos capazes de remover partículas metálicas (separação magnética, extração Sc CO 2, etc.) são raramente reportadas em combinação com purificação em fase gasosa. Essa combinação pode melhorar muito o rendimento da purificação de fase gasosa, devido à eliminação precoce de partículas de metal, que podem catalisar a oxidação dos CNT (Pillai et al., 2007). 1.5 Nanotubos de carbono e penetração celular: Devido à sua estrutura tubular e a relação área de superfície/volume, os CNT podem facilmente penetrar várias barreiras biológicas em mamíferos, plantas e microorganismos (Liu et al., 2009; Kang et al., 2008). A visão geral é que os nanotubos de carbono são absorvidos pelas células por endocitose dependente de clatrina (Kam et al., 2006). SWCNT revestido de proteínas ou DNA mostraram-se entrar nas células de forma dependente de energia. Embora a maioria dos dados publicados esteja de acordo com o modelo de endocitose, a internalização celular independente de energia também foi relatada (Kostarelos et al., 2007). Embora muitos progressos tenham sido feitos no entendimento de como os CNT atravessam a membrana lipídica de um determinado tipo de célula, os detalhes dos

20 mecanismos propostos ainda são debatidos. Tais considerações são importantes na medida em que a incapacidade de compreender os mecanismos de captação de materiais em nanoescala e sua influência sobre a toxicidade pode criar um nível de imprevisibilidade tóxica (Wick et al., 2007). Levando-se em conta a natureza hidrofóbica dos CNT e com base nos resultados de Raffa et al. (2010) pode-se concluir que, quando as células são cultivados com meio de crescimento contendo CNT, estes adsorvem espontaneamente sobre a membrana celular e o processo de internalização ocorre por inserção e difusão de nanotubos através das membranas celulares. Já no modelo de internalização celular proposto por Mu et al. (2009) os CNT de carbono são divididos em duas classes, agrupados e individualizados. Agrupamentos de CNT são absorvidos pelas células por endocitose dependente de energia. E estes agrupamentos de MWCNT, nos endossomos, podem liberar nanotubos únicos, os quais então atravessam a membrana do endosomo e escapam para o citoplasma. Alternativamente, CNT bem dispersos (individualizados) atravessam a membrana celular e entram nas células diretamente. Os pesquisadores relataram a presença de MWCNT curtos no interior do núcleo celular. Além disso, os autores observaram que os MWCNTs são recrutados para os lisossomos para posterior excreção da célula. Assim, dois mecanismos principais têm sido amplamente considerados: (1) endocitose/fagocitose e (2) nanopenetração. Endocitose representa o engolfamento de uma partícula extracelular pela célula, por exemplo, vírus (~ 100 nm, em tamanho), através da criação de uma vesícula que é, então, integrada à célula. Fagocitose é semelhante à endocitose, mas geralmente envolve a captação de partículas maiores, tais como bactérias (~ 1 µm), e é característico de um subgrupo de células imunes - fagócitos (p.ex., neutrófilos, macrófagos, células dendríticas). Estes processos são dependentes de energia e são impedidos em baixas temperaturas e em ambientes com baixos níveis de ATP (Mukherjee et al., 1997; Marsh & McMahon, 1999). Vários estudos indicam a endocitose/fagocitose como o mecanismo de absorção celular de nanotubos de carbono (Kam et al., 2004; Kam et al., 2006; Liu et al., 2005). Nanopenetração é um processo passivo independente de energia, onde os nanotubos se difundem através da membrana celular. Também foi postulado que os

21 nanotubos de carbono poderiam se comportar similarmente a peptídeos de penetração celular (PPCs), que representam seqüências poli-catiônicas que aumentam absorção de proteínas em células de mamíferos (Pantarotto et al., 2004). A carga de superfície também desempenha um papel importante no governo da absorção celular de nanomateriais. A membrana plasmática é carregada negativamente (devido aos fosfolipídios na superfície externa), assim como o ambiente intracelular, assim os nanomateriais aniônicos (carregados negativamente) podem sofre endocitose em uma taxa mais baixa do que aqueles que são catiônicos (carga positiva) (Gratton et al., 2008). Outro fato importante a cerca de como CNT atravessam a membrana de células se baseia no comprimento e formato dos CNT (Kostarelos, 2003; Nel et al., 2006). Por exemplo, os nanotubos de carbono mais curtos (~ 0,22 µm de comprimento) foram encontrados melhor integrados aos fagócitos e macrófagos do que nanotubos mais longos (0,8 µm). Verificou-se que a maioria dos nanotubos de carbono curtos injetados no tecido subcutâneo em ratos estavam no citoplasma dos macrófagos após 4 semanas, enquanto os nanotubos de carbono mais longos foram encontrados ainda livres e flutuantes provocando inflamação (Sato et al., 2005). Poland et al. (2008) chegaram a conclusões semelhantes após injeção intraperitoneal de CNT de comprimento longo e curto em camundongos. No entanto, comparando-se os trabalhos, nota-se que o comprimento atóxico afirmado no estudo de Poland et al. (2008) foi de ~ 10 µm, sendo pertinente ressaltar a possível influência de defeitos ao longo do comprimento dos CNT sobre sua toxicidade. Uma das principais fontes de discrepância nos estudos pode originar-se das diferenças entre defeitos e densidades de energia dos diversos CNT utilizados nos experimentos. Outro ponto de destaque é sobre a localização subcelular dos CNT. Nanotubos foram encontrados principalmente no citoplasma, endossomo e lisossomo. Relatos descrevem que os nanotubos de carbono penetram nas células, sem entrar no núcleo (Lacerda et al., 2006; Zhang et al., 2007 Kang et al., 2008), enquanto outros relatos constataram que SWCNT entram no núcleo (Pantarotto et al., 2004; Porter et al., 2007; Mooney et al., 2008; Cheng et al., 2009) e essa entrada pode ser reversível (Cheng et al., 2009). Yang et al. (2010) descreveu que os lisossomos e as mitocôndrias são os principais alvos dos SWCNT.

22 1.6 Aplicações dos nanotubos de carbono: As propriedades notáveis de CNT que os tornam interessantes incluem a condutividade elétrica e térmica, força, tenacidade, elasticidade, resistência e durabilidade. CNT podem melhorar materiais já existentes tornando-os mais leves e/ou resistentes ou mais resistentes ao desgaste, os quais podem ser utilizados em várias aplicações que vão de artigos de esporte (ex.: raquetes de tênis) a compósitos para aeronaves (Firme III & Bandaru, 2010). Por apresentarem características de flexibilidade, os nanotubos podem ser usados em instrumentos de microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de tunelamento. As vantagens é que melhoram a resolução quando comparados com o silício convencional. Por serem estruturas cilíndricas, geométricas, rígidas, ocas e de diâmetros em escala nanométrica, tem sido cogitado o uso para estocagem de líquidos ou gases em seu interior, através do efeito de capilaridade (Wang & Chen, 2007). Nanotubos de carbono tem sido também a promessa para a construção cívil. A incoporporação de CNT no cimento permitiu a formação de um concreto mais resistente. O cimento é um material de construção comumente utilizado devido ao seu baixo custo e alta resistência à compressão (Li et al., 2007). Nanotubos de carbono têm sido utilizados como complemento da matriz de compósitos do cimento para melhorar comportamentos mecânicos e elétricos do material, bem como os comportamentos eletromecânicos e eletromagnéticos. Tendo o melhor desempenho entre os materiais de carbono, espera-se que os nanotubos de carbono possam melhorar significativamente o desempenho dos compósitos de cimento (Li et al., 2007). Outro grande interesse é o emprego de CNT na produção ou melhoria de biomateriais, tais como próteses para artroplastia, placas ou parafusos para fixação da fratura, suporte para a regeneração óssea, sistemas de entrega de drogas, sensores químicos e biológicos, etc. O grupo de pesquisa liderado pelo Prof. Rosolen obteve sucesso na utilização de nanotubos de carbono como filtros para cigarros. Utilizando CNT em forma de pequeno filtro, conseguiu-se zerar as substâncias de alcatrão e nicotina de dois maços de cigarros, numa simulação com uma máquina fumante. Com o auxílio de espectrometria de massa e infravermelho comprovou-se a excelente capacidade de remoção de nicotina, alcatrão e

23 outros gases existentes na fumaça pelos nanotubos. A descoberta pode abrir perspectivas não só para a área de saúde, mas para a utilização de CNT como filtros para indústrias que despejam diariamente toneladas de substâncias nocivas no ar e na água (Upadhyayula et al., 2009). SWCNT e MWCNT foram utilizados como vetores de agentes de contrastes para imagens por ressonância magnética e se mostraram também bastante efetivos (Sitharaman et al., 2005; Richard et al., 2008). Estudos posteriores mostram que a liberação dos agentes é extremamente sensível ao valor de ph em uma escala de 7,0-7,4. Por causa da diferença no valor do ph entre tumor e tecidos normais, acredita-se que os nanotubos serão um excelente candidato para o diagnóstico precoce de tumor (Hartman & Wilson, 2007). Curiosamente, a absorção óptica intrínseca de SWCNT tem sido usada para matar células cancerosas fototérmicamente com radiação NIR (espectroscopia no infravermelho próximo) (Kam et al., 2005). Nanotubos de carbono tem sido cogitado para aplicação na engenharia de tecidos ósseos (Sahithi et al., 2010). Esta idéia baseia-se no fato dos CNT serem leves, fortes, e poderem ser formulados para imitar as estruturas nanométricas iniciais dos componentes dos ossos, tais como a hidroxiapatita e o colágeno. Além disso, as funções das células ósseas são estimuladas com corrente elétrica e, portanto, materiais condutores (como os CNT) também podem desempenhar um importante papel na promoção da atividade dos osteoblastos (células formadoras de osso) (Supronowicz, 2002). O uso de nanotubos de carbono como substratos/suportes para o crescimento de células neurais também tem sido uma área de investigação ativa. Nanotubos de carbono sem-funcionalização ou funcionalizado com grupos químicos diferentes, tem se mostrado biocompatíveis com adesão celular neuronal e crescimento. Nanotubos de carbono funcionalizados podem modular o desenvolvimento neuronal de forma graduada. Sendo que células neurais, como as células-tronco e as gliais, foram cultivadas com sucesso sobre substratos de CNT (Lee & Parpura, 2009). As superfícies exteriores dos nanotubos de carbono podem absorver diversas moléculas e ligar-se a vários grupos químicos para solubilização e/ou direcionamento, enquanto a cavidade interior é capaz de encapsular pequenas moléculas e íons (Cai et al, 2008). Sendo assim, uma das maiores investidas para a aplicação de nanotubos é como

24 transportador molecular. Sendo capaz de transportar peptídios, proteínas, ácidos nucléicos e outras moléculas bioativas; servirá como um efetivo veículo de agentes terapêuticos no tratamento de tumores (Cai et al, 2008). As características marcantes para um sistema eficiente de administração de drogas ( Drug delivery ) incluem a sua capacidade de executar de forma controlada e orientada a entrega de medicamentos, as quais os nanotubos de carbono têm mostrado possuir (Foldvari & Bagonluri, 2008). Três métodos de interação entre nanotubos de carbono e componentes farmacologicamente ativos são possíveis em sistemas de entrega de drogas. O primeiro método de interação é como um absorvente poroso para prender componentes ativos dentro de uma malha ou conjunto de CNT. O segundo é através da ligação funcional do composto com as paredes exteriores dos CNT. A terceira abordagem envolve o uso dos canais de CNT como nanocateteres (Foldvari & Bagonluri, 2008). Zhang et al. (2009) desenvolveram um sistema de entrega controlada de drogas, baseados em SWCNT, o qual transportava a droga doxorrubicina (DXR). A droga se liga aos nanotubos em ph fisiológico (ph 7,4) e só é liberada em um ph mais baixo, por exemplo, ph lisossomal e ou ph característico de determinados tumores. Ácido fólico foi usado como agente de direcionamento para células HeLa, e assim seletivamente liberar DXR no interior do ambiente ácido dos lisossomos. Os pesquisadores observaram inibição da proliferação de células HeLa e concluiram que o sistema global de drogas em nanoescala é mais seletivo e eficaz do que o próprio fármaco livre, e deve resultar em redução de toxicidade geral e, consequentemente, reduzir os efeitos colaterais de pacientes, e também permitir uma menor quantidade da droga a ser aplicada. Kam e Daí (2005) utilizaram SWCNT como um sistema de entrega de proteínas. Foi desenvolvido um complexo de nanotubo-proteína citocromo C, e os pesquisadores observaram a indução de apoptose em uma linhagem celular de fibroblastos (NIH-3T3) cultivada conjuntamente com o complexo. SWCNTs também foram utilizados com sucesso para entrega de acetilcolina no cérebro para o tratamento da doença de Alzheimer induzida em camundongos (Yang et al., 2010). A utilização de SWCNT como vetor para transfecção de sirna em células HeLa foi demonstrada por Kam et al. (2005). O transporte e a entrega do sirna em células HeLa

25 foi realizado com sucesso. Além disso, o silenciamento dos genes lamina A/C foi mais eficiente com CNT do que com o agente de transfecção lipofectamina. 1.7 Interações entre CNT e constituintes do meio de cultura: Células de mamíferos são cultivadas em meios de cultura contendo soro bovino fetal. Estes meios de cultura contem uma grande quantidade de proteínas séricas e uma variedade de componentes orgânicos e inorgânicos. Devido às propriedades físico-químicas de CNT estes constituintes podem ligar-se aos CNT e serem internalizados pelas células (Zhu et al., 2009). A interação entre MWCNT e proteínas séricas foi demonstrada por Zhu et al. (2009). O pesquisador relata que a interação, entre MWCNT e proteínas do soro presentes no meio de cultura, começa imediatamente após a mistura, com cinética de adsorção, indicando que as proteínas do soro adsorvidas nos CNT atingem valores máximos em pouco menos de 5 min. E que após o equilíbrio, MWCNT aumentou seu peso em cerca de 45%. Estes CNT contendo proteínas apresentam propriedades físico-químicas diferentes dos nanotubos puros. Zhu et al. (2009) encontrou variações no comportamento biológico, induzido por proteínas séricas adsorvidas aos CNT. As taxas de absorção de MWCNT foram cerca de 3-4 vezes maior em meio sem soro do que em meio de cultura com soro. E a citotoxicidade foi ~10% mais elevada em meio sem soro. Além disso, qualquer superfície hidrofóbica é um local preferencial para a deposição de biomoléculas e, portanto, sendo inerentemente hidrofóbico, CNT bem dispersos irão absorver a maioria das biomoléculas dos nutrientes presentes no meio de cultura (Hussain et al., 2009). Neste sentido, outra questão interessante surge das observações feitas por Casey et al. (2008). SWCNT foram dispersos em meio de cultura comercial e então removidos do meio por ultracentrifugação e filtração. Foi demonstrada a capacidade de depleção de constituintes do meio de cultura por SWCNT. O esgotamento de nutrientes do meio de cultura, causado devido à adsorção de biomoléculas sobre SWCNT, aparecem como uma explicação dada pelos autores, para a citotoxicidade de SWCNT em células A549. Tal depleção privaria as células de nutrientes essenciais ocasionando assim um tipo de

26 citotoxicidade indireta, e que deve ser diferenciada de uma citotoxicidade inerente aos nanomateriais. Em contrapartida, o uso de meio sem soro para evitar as interações entre partículas e proteínas tem levantado questões a respeito da relevância biológica destes experimentos por Jones e Grainger (2009), uma vez que uma exposição in vivo não poderia ocorrer na ausência de proteínas. 1.7 Toxicidade de nanotubos de carbono: Shvedova et al. (2003) investigaram os efeitos de SWCNT sobre queratinócitos imortalizados (HaCat), e células epiteliais dos brônquios. As exposições aos SWCNT resultaram em geração de ROS, peroxidação de lipídios, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e mudanças na morfologia celular. Pantarotto et al. (2004) estudaram a citotoxicidade de SWCNT-funcionalizados por citometria de fluxo (FACS). Utilizando-se reagentes fluorescentes específicos para detecção de apoptose e necrose descobriu-se que na concentração de 10 µm os SWCNT induziram 80% de morte celular. Cui et al. (2005) investigaram a citotoxicidade de SWCNT e, mostraram que estes CNT inibiram a proliferação de células renais embrionárias humanas (HEK 293) através da indução de apoptose e diminuíram a capacidade de adesão celular. Nestes experimentos células HEK 293 foram cultivadas em meio contendo concentrações de SWCNT variando de 0.78 µg/ml a 200 µg/ml. Análise do ciclo celular mostrou que 25µg/mL de SWCNT induziu parada do ciclo na fase G 1. Os autores ainda verificaram, por análise de microarray, que SWCNT pode induzir a super-expressão de genes associados ao ciclo celular, tais como p16, bax, p57, hrk, cdc42 e cdc37, a sub-expressão de genes do ciclo celular, tais como cdk2, cdk4, cdk6 e ciclina d3, e sub-expressão dos genes associados a transdução de sinal, tais como mad2, jak1, ttk, pcdha9 e erk. CNT não purificados usualmente contêm catalisadores metálicos como, por exemplo, ferro, níquel, cobalto e manganês os quais poderiam explicar a geração de radicais livres e estresse oxidativo (Klumpp et al., 2006). Contudo, Tamura et al. (2004) conduziram uma investigação sobre os efeitos citotóxicos de CNT purificados sobre neutrófilos isolados de sangue humano. Após

27 exposição por 1h com CNT purificados, observou-se um aumento significativo de ânions superóxidos e produção de TNF-α (uma citocina pró-inflamatória) pelas células. Também foi observado diminuição da viabilidade celular. Os tipos de nanotubos usados nos estudos são de extrema importância. A comparação da citotoxicidade induzida por diferentes materiais compostos de carbono em macrófagos alveolares mostrou que SWCNT provoca o maior efeito tóxico quando comparado com MWCNT (Oberdörster et al., 2005). Zhu et al. (2007) realizaram o primeiro estudo sobre a genotoxicidade de CNT. Os pesquisadores investigaram os efeitos de MWCNT em células-tronco embrionárias de ratos. Os danos ao DNA induzidos por MWCNT foram indicados por análises de Western blot da enzima de reparo por excisão de base 8-oxoguanina-DNA-glicosilase (OGG1), esta enzima repara bases guaninas que sofreram lesões produzidas por ROS. A análise demonstrou que após o tratamento houve um aumento da expressão de OGG1. Também foram feitas análises para duas proteínas de reparo de quebras bifilamentares de DNA, Rad51 e XRCC4 envolvidas em reparo por recombinação homóloga e junção de extremidades não homólogas, respectivamente e, as duas proteínas foram superexpressas em resposta ao tratamento com MWCNT. Além disso, Zhu et al. (2007) também analisaram o nível de expressão da proteína p53 e, observaram que após 2h de exposição houve um aumento de expressão da proteína. E por fim, foi encontrado que o tratamento com MWCNT causou um aumento de 2 vezes a freqüência de mutação nas células-tronco embrionárias de ratos. Portanto, existe uma variedade de aplicações, incluindo aplicações biomédicas, para os CNT (Cohen, 2001; Lin et al., 2004; Bianco et al., 2005). Contudo, antes que estes materiais possam ser incorporados como implantes biomédicos, veículos carreadores de drogas/vacinas ou biosensores, entre outros materiais, há a necessidade de se estabelecer sua biocompatibilidade e de se conhecer seus efeitos citotóxicos e genotóxicos. Assim, no presente trabalho realizou-se uma avaliação citotóxica/genotóxica comparativa entre diferentes tipos de CNT purificados e não purificados, sintetizados pelo método de deposição química de vapor, em células da linhagem V79 (Fibroblasto de pulmão de Hamster Chinês).

28 2. OBJETIVOS 2.1 Objtetivo geral O presente estudo teve como objetivo principal traçar um quadro da atividade citotóxica e genotóxica entre diferentes amostras de nanotubos de carbono (purificadas e não purificadas), sintetizados por meio de deposição química de vapor, possibilitando um diagnóstico mais preciso no que se refere aos seus efeitos tóxicos. 2.2 Objetivos Específicos 1) Estudar os efeitos citotóxicos de nanotubos de carbono de paredes múltiplas e do tipo cup-stacked na linhagem de células V79 (fibroblasto de pulmão de Hamster Chinês). Esses efeitos foram avaliados por ensaios de viabilidade celular (XTT) e sobrevivência clonogênica; 2) Estudar os efeitos genotóxicos de nanotubos de carbono de paredes múltiplas e do tipo cup-stacked. Esses efeitos foram avaliados pelo ensaio Cometa (com a utilização de enzimas para detecção de danos oxidativos) e teste do micronúcleo.

29 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Nanotubos de carbono e substâncias químicas utilizadas: Os nanotubos de carbono utilizados foram sintetizados pela doutoranda Elaine Yoshiko Matsubara sob orientação do Prof. Dr. José Maurício Rosolen, do Departamento de Química da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP. Foram utilizadas quatro amostra diferentes de nanotubos de carbono (MWCNT, CSCNT_pu, CSCNT_np e CSCNT_Fe), todas sintetizadas pelo método de deposição química de vapor: Nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT): Os MWCNT usados foram sintetizados pela decomposição de etanol sobre os catalisadores metálicos cobalto e manganês incorporados ao substrato de MgO a 650 ºC. Após a síntese, as partículas catalíticas foram removidas por imersão da amostra em HCl concentrado por 20 minutos em temperatura ambiente e então lavados, exaustivamente, com água MiliQ, e secas à temperatura de 100 ºC. Esta etapa foi aplicada para remover as partículas e o substrato usado no crescimento dos CNT. Os MWCNT usados tinham diâmetro de 25 a 60 nm Nanotubos de carbono do tipo cup-stacked (CSCNT): Utilizou-se três tipos de amostras de nanotubos do tipo cup-stacked, todas usando uma mistura de etanol e metanol como fonte de carbono: Uma das amostras foi sintetizada com ferro como catalisador (CSCNT_Fe). Esta amostra não foi purificada após o processo de síntese, e possui diâmetro de aproximadamente 150 nm; Os outros dois tipos foram sintetizados com cobalto e manganês como catalisadores metálicos. Uma parte da amostra não foi purificada (CSCNT_np), enquanto a outra foi submetida ao processo de purificação com HCl para remoção das partículas catalisadoras (CSCNT_pu), diâmetro aproximado de 60 nm.

30 Portanto, CNT purificados (MWCNT e CSCNT_pu) e não purificados (CSCNT_np e CSCNT_Fe ) foram analisadas quanto a citotoxicidade e genotoxicidade neste trabalho Dispersão dos nanotubos de carbono: Uma propriedade inerente de muitos nanomateriais é a sua hidrofobicidade e, portanto, uma propensão a se aglomerar, especialmente, sob condições fisiológicas. Com relação à exposição humana, por conseguinte, é provável que na maioria das circunstâncias nanomateriais estejam sob a forma de agregados, em vez de unidades individuais. Além disso, dado que testes de (geno)toxicidade, tanto in vivo quanto in vitro, envolvem a administração em uma solução aquosa ou em um meio aquoso (com exceção para estudos de inalação), a probabilidade é que as respostas à exposição será uma consequência da forma aglomerada de nanomateriais (Singh et al., 2009). Vários métodos vêm sendo utilizados para aumentar a hidrofilicidade dos nanomateriais, seja através do uso de surfactantes ou modificação química (funcionalização) de suas superfícies. Como resultado a estas modificações, as respostas (geno)tóxicas também são alteradas. Algumas tentativas de solubilizar CNT através da modificação da superfície relataram toxicidade reduzida, ocasionados pela funcionalização (Sayes et al., 2006; Singh et al., 2006). Em contrapartida, outros estudos mostraram que CNT foram mais citotóxicos quando estabilizados com um surfactante (Kuo et al., 2007). O uso de surfactantes pode gerar um falso cenário de exposição, pois não estariam presentes na maioria das situações de exposições fisiológicas. Há também a possibilidade de que os surfactantes podem causar um resultado positivo por si só. Assim, os surfactantes podem instaurar outro grau de complexidade que podem confundir os resultados finais. Portanto, a forma aglomerada do material pode ser mais representativa do local de trabalho ou cenários de exposição do consumidor (Singh et al., 2009). Considerando as questões citadas acima, no presente trabalho optou-se por realizar a dispersão dos CNT por sonicação. Para isso foi utilizado um sonicador com sonda (Vibra- Cell, SONICS) operando na frequência de 20 KHz, potência 130w, amplitude 80%, por um tempo de 60s. A dispersão foi feita em água miliq na concentração de 0,5 mg/ml, mas trabalhos da literatura (Jacobsen et al., 2008; Pacurari et al., 2008; Wirnitzer et al., 2009) utilizaram soluções estoque ainda mais concentradas.

31 Os CNT foram esterilizados por autoclavagem antes do processo de sonicação. A dispersão era realizada, imediatamente, antes dos tratamentos das culturas. Desta dispersão foram feitas diluições seriadas nos meios de culturas para o tratamento das células. Há que se ressaltar que o processo de sonicação para dispersão de CNT, envolve a quebra e a inserção de defeitos nos nanotubos que podem reduzir o seu comprimento (Glória et al., 2007). Geralmente, durante a sonicação os CNT podem ser quebrados em sítios defeituosos (Raffa et al., 2008). Para os experimentos de sobrevivência clonogênica foram utilizados frascos de cultura (TPP) de 25 cm 2 de área, contendo 5 ml de meio de cultura. Já para os experimentos de viabilidade celular, teste do micronúcleo e ensaio Cometa foram utilizadas placas de cultura (TPP) de 12 poços, contendo 1 ml de meio de cultura. Cada poço tem área de 3,5 cm 2. As concentrações utilizadas nos testes são apresentadas em duas formas diferentes: (massa/volume: µg/ml) usualmente a medida mais utilizada em experimentos de cito- e genotoxicidade; (massa/área: µg/cm 2 ) medida recomendada para estudos in vitro que envolvem partículas e fibras (Oberdörster et al., 2005). Será apresentado nos gráficos e tabelas dentro de colchetes [µg/cm 2 ] Controle positivo - Doxorrubicina (DXR): A doxorrubicina é um antibiótico da família das antraciclinas utilizado para tratamento de neoplasias malignas. Seu uso em ensaios para mutagênese e antimutagênese deve-se a sua capacidade de provocar danos ao DNA e aos cromossomos (Antunes & Takahashi, 1999; Quiles et al., 2002). Os mecanismos propostos para a ação citotóxica ou citostática da doxorrubicina são: intercalação na fita de DNA e como conseqüência a inibição da síntese de macromoléculas; formação de radicais livres o que provoca danos no DNA, peroxidação lipídica, ligação no DNA e alquilação; DNA cross-linking ; interferência na abertura da dupla fita de DNA, interferência na atividade da helicase; ação direta na membrana celular; inibição da topoisomerase II; indução de morte celular por apoptose (Gewirtz, 1999).

32 Assim, o agente DXR foi usado como controle positivo, na concentração de 0,15 µg/ml tratamento por 2 h, dos experimentos de genotoxicidade. Utilizou-se a forma comercial Doxolem : Cloridrato de doxorrubicina (Figura 2) (Registro CAS # e , Eurofarma Laboratórios Ltda, Campo Belo SP, Brasil e Zodiac Produtos Farmacêuticos S/A, Pindamonhangaba SP, Brasil). Figura 2: Estrutura molecular da doxorrubicina Controle negativo: Água MiliQ autoclavada foi utilizada como controle negativo dos experimentos Citocalasina B: A citocalasina B (CitB) é um inibidor de polimerização da proteína actina requerida para a formação do anel de microfilamentos que induzem a contração do citoplasma e clivagem da célula em duas células filhas (citocinese) (Carter, 1967). No teste do micronúcleo, o uso da CitB leva ao bloqueio da citocinese, mas não da divisão nuclear, resultando em um acúmulo de células binucleadas, a partir de células que passaram por apenas um ciclo de divisão (Fenech & Morley, 1985). A CitB ( Sigma), foi diluída em dimetilsulfóxido (DMSO Sigma) a fim de se obter uma solução de uso na concentração de 1 mg/ml. Esta solução foi mantida ao abrigo da luz em refrigeração a 4 C até o momento de seu uso na concentração final de 5 µg/ml de meio de cultura. 3.2 Cultura de células da linhagem V79:

33 Sistemas testes de curta duração são amplamente utilizados na detecção de agentes mutagênicos e antimutagênicos ambientais (Kuroda et al., 1992). Entre esses sistemas, destaca-se a cultura de células de mamíferos in vitro, como a cultura de linfócitos de sangue periférico humano, as linhagens celulares provenientes de hamster Chinês, como por exemplo, as células CHO (células de ovário) e células V79 (fibroblasto de pulmão) (Takahashi, 2003). Entre as vantagens desses sistemas-teste, destacam-se a facilidade na padronização das condições experimentais (temperatura, ph, composição do meio de cultura, densidade populacional) devido à uniformidade metabólica e comportamental do material, possibilidade dos tratamentos das células serem realizados em várias fases do ciclo celular, rapidez; economia, boa reprodutibilidade, organização dos cromossomos e de seu DNA igual às células in vivo (Rabello-Gay et al., 1991) Portanto, para a avaliação dos efeitos citotóxicos e genotóxicos dos CNT foram utilizadas culturas de células V79. As linhagens celulares foram estocadas em nitrogênio líquido (-195 C) em alíquotas de 1x10 6 células/ml em uma solução de congelamento (50% meio de cultura, 50% soro bovino fetal e 10% glicerol). Para a realização dos experimentos, as células foram descongeladas e cultivadas em 10 ml de meio de cultura Ham-F10+D-MEM na proporção 1:1 (Sigma) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Cultilab), 1,2 g/l de bicarbonato de sódio (Reagen), antibióticos (0,06 g/l penicilina, 0,10 g/l de estreptomicina (Sigma), 1% de Kanamicina (Gibco) e 1% de Ciprofloxacina (forma comercial Hifloxan Halexistar) e HEPES (2,38 g/l Serva), em frascos de cultura de 25 cm 2 de área, a 37 C, 5% CO 2. As células utilizadas estavam entre a 3ª e a 8ª passagem. Células desta linhagem possuem ciclo celular de horas. De acordo com as explicações de Jones e Grainger (2009), optamos por utilizar culturas de células V79 em meio de cultura Ham-F10+D-MEM (1:1) suplementado com 10% de soro bovino fetal para todos os testes realizados. Jones e Grainger (2009) propõem que a utilização de meio sem soro usado sem um objetivo específico pode produzir uma condição altamente artificial de cultura que não é particularmente relevante ao "mundo real" do cultivo de células. Além disso, visando-se exposições prolongadas 24 e 48 h (justificadas pela característica de biopersistência de nanomateriais), o efeito da ausência de soro pode ter consequências drásticas para a viabilidade celular.

34 3.3 Viabilidade celular: Para a realização destess experimentos foi utilizado o Cell Proliferation Kit II (Roche Applied Science). O princípio da técnica é baseado na clivagem do sal amarelo tetrazolium XTT pelas células metabolicamente ativas formando um corante formazam alaranjado. Assim, essa conversão ocorre somente nas células viáveis. Portanto, esse experimento tem a finalidade de determinar a quantidade de células viáveis após a exposição aos CNT. As células foram expostas por 24h a diferentes diluições de CNT (200; 100; 50; 25; 12,5 µg/ml) sendo cada tratamento feito em duplicata em placas de cultivo de 12 poços. Após a exposição, os poços foram lavados por 2x com solução de Hank's. E nos tempos de 24 h, 48 h (5x10 4 céls. semeadas) e 120 h (1x10 4 céls. semeadas) após o tratamento (Figura 3), avaliou-se a viabilidade celular. Após os respectivos tempos de incubação, lavou-se as culturas com solução de Hank' 's. Imediatamente após a lavagem foram adicionadas às células 500 µl de meio DMEMM sem fenol vermelho, e então, 60 µl da solução XTT/electron (na proporção de 50:1) permanecendo em cultura por 30 minutos. Passado este tempo o volume foi transferido para uma cubeta e foi realizada a leitura colorimétrica em um espectrofotômetro. O resultado da absorbância, medida em 492 e 690 nm, é diretamente proporcional ao número de células viáveis em cada tratamento. Figura 3: Esquema representativo dos protocolos de tratamento para análise de viabilidade celular com Cell Proliferation Kit II. As culturas celulares foram expostas aos CNT por 24h, e o efeito deste tratamento foi analisado nos tempos de 24, 48 e 120 h após a exposição.

35 A partir da curva de dose-resposta obtida com o ensaio, calculou-se a IC 50 (IC 50 representa a concentração de uma substância requerida para inibir 50% da viabilidade celular in vitro). O valor foi estimado por meio de regressão não linear utilizando-se o programa estatístico GraphPad Prism versão 5.0 para Windows (GraphPad Software, San Diego California). 3.4 Ensaio clonogênico: Ensaio clonogênico ou teste de sobrevivência clonogênica é um ensaio in vitro baseado na capacidade de uma única célula crescer e se tornar uma colônia. A colônia é definida como sendo composta por pelo menos 50 células. O ensaio, essencialmente, testa a capacidade de cada célula na população sofrer divisões ilimitadas. É o método para detecção de morte celular reprodutiva (Franken et al., 2006). Foi utilizado o método de plaqueamento antes do tratamento (Franken et al., 2006). Células em crescimento exponencial foram semeadas em um número de 300 células/frasco 25cm 2. Após o período de 8 h da semeadura, tempo suficiente para que as células se fixassem ao frasco de cultura e menor que o tempo de duplicação das células (para garantir que somente células únicas fossem tratadas), as células foram expostas a diferentes concentrações de CNT (50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/ml) por 7 dias. Cada tratamento foi feito em triplicata. As células foram incubadas em estufa a 37ºC, 5% CO 2. Após este período as colônias formadas foram fixadas (metanol/ácido acético/água na proporção 1:1:8 v/v), e coradas com Giemsa. A contagem foi realizada com o auxílio de uma lupa. A partir da curva de dose-resposta obtida com este ensaio, também calculou-se a IC 50 como citado no item anterior. 3.5 Ensaio Cometa: O ensaio cometa, ou técnica da eletroforese celular em microgel, tem demonstrado sensibilidade como uma técnica para a avaliação do dano e reparo no DNA em uma variedade de tipos celulares, induzidos por uma variedade de agentes químicos e físicos.

36 Em comparação com outros métodos também sensíveis, o ensaio é relativamente preciso e econômico no uso de materiais (Rojas et al., 1999). O teste foi desenvolvido por Singh et al. (1988), seu princípio básico é o da lise de membranas celulares e proteínas nucleares (incluindo as histonas), e subseqüentemente, da descompactação do DNA sob condições alcalinas (Singh, 2000). Em seguida ocorre a indução da migração eletroforética do DNA liberado em matriz de agarose. Quando visto ao microscópio, o DNA migrado adquire a forma aparente de um cometa, com cabeça - a região nuclear, e a cauda - que contém fragmentos ou fitas de DNA que migraram na direção do ânodo (Klaude et al., 1996). A versão alcalina do teste é usada para detectar quebras de fita simples e duplas e, sítios álcali-lábeis nas moléculas de DNA, que são induzidas, por exemplo, por radiações ionizantes, agentes alquilantes, oxidantes, etc. Antes do ensaio cometa foi realizado um teste de viabilidade celular com azul de tripan 0,4%. Pela utilização de um contador manual, contaram-se 100 células em microscópio de luz transmitida. A coloração permite diferenciar células viáveis (não coradas) de células não viáveis (coradas em azul), sendo consideradas aptas para a análise do cometa aquelas culturas que apresentaram uma viabilidade celular acima de 70%. As células (1x10 5 ) foram expostas por 24 h a uma amostra purificada (MWCNT) e outra não purificada (CSCNT_np), em placas de 12 poços. Após o tratamento as culturas foram lavadas 2x com solução de Hank s. As células, então, foram suspendidas por tripsinização e 500 µl da suspensão celular foi transferido para um microtubo de 1,5 ml, submetidos à centrifugação de rpm, a 4ºC, por 5 minutos. Em seguida, desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet, sendo acrescentados 160 µl de agarose de baixo ponto de fusão (37 C) 0,5%, misturando-se levemente. O material de cada microtubo foi transferido para duas lâminas recém preparadas com a primeira camada de agarose de ponto de fusão normal 1,5%. Foram colocadas as lamínulas sobre o material e, em seguida, estas foram levadas à geladeira por 5 minutos sendo as lamínulas retiradas após esse tempo. As lâminas foram mergulhadas em solução de lise (NaCl 2,5 M, Na2EDTA 100 mm, Tris 10 mm, Triton X-100 1% e DMSO 10%, ph 10,0) por 24 horas, permanecendo em geladeira durante todo o tempo. As lâminas foram retiradas da solução e mergulhadas

37 em solução tampão de eletroforese (NaOH 0,3 M e Na 2 EDTA 1 mm, ph > 13) por 25 minutos a 4ºC, sendo assim, levadas para a cuba de eletroforese. Transcorridos 25 minutos em corrente eletroforética (25 V [1 V/cm, 300 ma] a 4 C), as lâminas foram mergulhadas em solução de neutralização (Tris-HCl 0,4 M, ph 7,5) por 15 minutos. Após a neutralização, as lâminas foram secas à temperatura ambiente, e então, fixadas em etanol 100%. Para a coloração do material, foram adicionados 30 µl de solução de iodeto de propídeo (concentração final de 2,5 µg/ml) sobre a lâmina, sendo esta recoberta por uma lamínula. O material foi analisado em microscópio de fluorescência (ZEISS, filtro nm e barreira de filtro de 590 nm), em aumento de 40x. Foram analisadas 50 células/lâmina, sendo observadas as células com contorno circular (núcleos sem danos de DNA) ou em forma de cometa (núcleos com danos no DNA), no qual a extensão da cauda reflete a distância de migração dos fragmentos de DNA, seguida de captura de imagem digital (Câmera Axiovision Zeiss). As imagens obtidas foram analisadas pelo programa TryTek Comet ScoreTM, FreeWare v1.5, onde se obtém a quantificação de danos no DNA, baseado nos pixels dos fragmentos Ensaio Cometa para detecção de danos oxidativos: O Ensaio Cometa detecta primordialmente quebras no DNA. No entanto, com a modificação de algumas etapas de seu procedimento, existe a possibilidade de se detectar outros tipos de lesões no DNA, como bases oxidadas, principal modificação provocadas pelas EROs. Com esta finalidade, as lâminas foram incubadas com endonucleases de reparo que permite a expressão de danos específicos de base na forma de quebra de fita simples. Assim foram ulilizadas as enzimas hogg1 e Endo III para detecção de danos oxidativos no DNA como proposto por Speit et al. (2004). A detecção de danos oxidativos pelo ensaio cometa ocorre com o acréscimo de uma etapa ao protocolo padrão (descrito no item anterior) do ensaio cometa. Depois da etapa de lise, as lâminas devem ser imersas, 3 vezes, em tampão F (HEPES 40 mm; KCl 0,1 M; EDTA 0,5 mm e 0,2 mg/ml, ph 8,0) por 5 minutos cada, a 4 C. Em seguida foram

38 adicionados sobre as lâminas 50 µl de enzima diluída em tampão F (0,1 U/gel). As lâminas foram então cobertas por lamínulas e incubadas em uma câmara úmida (Hybrite) por 30 minutos para hogg1 e 45 minutos para EndoIII, a 37 C. E então seguiu-se o protocolo padrão, citado no item anterior. 3.6 Teste do micronúcleo: O estudo do dano genético ao nível cromossômico é essencial para a genética toxicológica, pois as mutações cromossômicas são um importante evento da carcinogênese. Entre os métodos mais utilizados para avaliar danos cromossômicos destaca-se o teste do micronúcleo (MN). Matter e Schimid (1971) estabeleceram o teste do micronúcleo (MN) em células de medula óssea de camundongos, sendo sua versão in vitro utilizando cultura de linfócitos periféricos humanos, proposta como um teste para a detecção de agentes carcinogênicos (Heddle, 1976). Segundo Salvadori et al. (2003), essa versão evoluiu rapidamente no campo da genética toxicológica por ser um método simples para a avaliação de vários tipos de danos citogenéticos, além das contínuas inovações em seu protocolo que sinalizam para a ampliação da aplicabilidade do teste. O micronúcleo (MN) pode ser definido como uma pequena massa nuclear delimitada por membrana e separada do núcleo principal que se forma durante a telófase da mitose ou meiose, quando o envoltório nuclear é reconstituído ao redor das células filhas. Desse modo, são resultantes de fragmentos cromossômicos acêntricos ou de cromossomos inteiros que se perderam do núcleo principal. Assim sendo, o MN representa perda de cromatina em consequencia de dano cromossômico estrutural (fragmento) ou dano no aparelho mitótico (Fenech, 1997) (Figura 4). Outro marcador importante de danos possível de se observar com este teste são as pontes nucleoplasmáticas (PN). As PN são marcadores de instabilidade genômica que se expressam como ligações contínuas entre os núcleos das células binucledas. São resultantes de rearranjos cromossômicos envolvendo mais de um centrômetro (ex. cromossomos dicêntricos) ou cromátides que migram para pólos opostos da célula durante a anáfase (Figura 4).

39 Figura 4. Diagrama mostrando a origem do micronúcleo (MN) a partir de um fragmento cromossômico ou de um cromossomo inteiro (a). Formação de ponte nucleoplasmática (PN) a partir de um cromossomo dicêntrico nos quais os centrômeros são puxados para pólos opostos da célula. [Adaptado de Fenech (2000)]. A contagem de micronúcleos e pontes nucleoplasmáticas nos ensaios in vitro foi realizada em células binucleadas obtidas com a adição de citocalasina B (CitB), o que permite uma medida mais precisa da freqüência destes danos citogenéticos (Fenech, 1997). A técnica de obtenção de células binucleadas foi introduzida por Fenech e Morley (1985), e permite a análise destes danos na primeira divisão celular após o tratamento com o agente a ser testado. Neste estudo foi realizada a técnica para a observação de micronúcleos e pontes nucleoplasmáticas (PN) em células V79 binucleadas: Foram semeadas em 1x10 5 células para tratamento por 24 h, e 5x10 4 para o tratamento por 48 h com os CNT (Figura 5). Após os tratamentos as culturas foram lavadas por 2x com Hank s, tripsinizadas e centrifugadas por 5 minutos a 900 r.p.m. O pellet foi então ressuspenso em solução hipotônica gelada (KCl-0,075 M), adicionou-se 3 gotas de formaldeído e homogeneizou-se cuidadosamente com pipeta Pasteur. Esta suspensão celular foi centrifugada novamente por 5 minutos a 900 r.p.m. e ressuspendida em 3 ml de fixador (metanol/ácido acético 3:1 v/v). Esta operação é repetida por mais duas vezes e, o