VI DESENVOLVIMENTO DE UM TESTE DE TOXICIDADE CRÔNICA UTILIZANDO A BACTÉRIA LUMINESCENTE Vibrio fischeri

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1 22º Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental 14 a 19 de Setembro Joinville - Santa Catarina VI DESENVOLVIMENTO DE UM TESTE DE TOXICIDADE CRÔNICA UTILIZANDO A BACTÉRIA LUMINESCENTE Vibrio fischeri Veridiana Chapiewsky Harmel Bióloga e Mestranda em Engenharia Ambiental na Universidade Regional de Blumenau. Jörg Henri Saar Microbiológo pela Universidade de Tübingen; doutor em biologia (Universidade de Tübingen, Alemanha e Centre de la Recherche Scientifique, França, pós-doutor pela Universidade Federal de Minas Gerais; professor da Universidade do Vale do Itajaí; diretor técnico da empresa Umwelt Assessoria Ambiental Adilson Pinheiro(1) Engenheiro Civil pela Universidade Federal de Santa Catarina; Mestre em Engenharia de Recursos hídricos e Saneamento pelo Instituto de Pesquisas Hidráulicas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul; doutor em Física e Química do Ambiente pelo Institut National Polytechnique de Toulouse (França); professor da Universidade Regional de Blumenau. Endereço(1): Rua Antonio da Veiga, 140, Caixa Postal 1507.CEP: Blumenau SC - Fone: (47) , pinheiro@furb.br RESUMO Testes de biotoxicidade são experimentos, nos quais organismos vivos são colocados frente à amostras diversas e suas reações são controladas. A bactéria luminescente Vibrio fischeri é conhecida e utilizada em testes de toxicidade aguda. Sua manipulação é pratica e segura, sendo o teste rápido e eficaz. O objetivo deste trabalho é a sua utilização em testes de

2 toxicidade crônica, que visa a reação dos organismos em um período de tempo maior. Para a aferição da luminescência foi utilizado o luminímetro Lumistox (Dr. Lange). O principal ponto para a possível realização do teste foi o desenvolvimento do meio de reconstituição onde as bactérias sobreviveram durante o período do ensaio. Foram realizados ensaios preliminares para estabelecer a composição do meio de reconstituição e após foram realizados ensaios com agentes-teste de toxicidade conhecida (dicromato de potássio e sulfato de zinco), efluentes industriais e águas superficiais. Para fins de comparação, o teste de toxicidade aguda foi realizado paralelamente com as amostras. Os resultados foram expressos em CE 20 e CE 50 e fator de diluição. A análise do crescimento relativo de biomassa foi realizada por espectrofotometria. A manutenção da luminescência no sistema foi mantida graças a adição de indutores específicos. A composição do meio foi variada levando em consideração a disponibilidade de fonte de carbono e o composto glicerol considerado o ideal para a estabilidade da luminescência. A sensibilidade do teste crônico foi comprovada para algumas amostras, apresentando valores maiores que no teste agudo convencional, sendo que em alguns casos a amostra não apresentou toxicidade crônica. Para estes casos devem ser levados em consideração diversos fatores que podem influenciar no resultado como a quantidade de nutrientes na amostra, como no caso de efluentes industriais, por exemplo. Uma amostra de água superficial apresentou toxicidade crônica. Houve crescimento de biomassa em algumas amostras devido a quantidade de nutrientes presentes na mesma. O Meio de reconstituição, ponto chave neste teste crônico, foi desenvolvido. As bactérias mantiveram a luminescência durante o período do ensaio. O teste de toxicidade crônica se mostrou sensível para diferentes amostras, mostrando sua eficácia como complemento nos testes de biotoxicidade. Há a necessidade de padronização do teste bem como de seus parâmetros, com uma quantidade maior de ensaios, principalmente para águas superficiais. PALAVRAS-CHAVE: Biotoxicidade, Vibrio fischeri, bioluminescência, meio de reconstituição; INTRODUÇÃO Os estudos toxicológicos constituem importantes ferramentas para o monitoramento ambiental, pois as informações que fornecem a respeito dos ambientes degradados trazem subsídios para comparações com estudos paralelos em habitats menos afetados. Fator este, que pode ajudar a avaliar os danos e identificar as causas dos impactos, além de auxiliar o entendimento das relações entre poluição e suas conseqüências biológicas. A área de biotoxicidade está em desenvolvimento recente e, está em constante crescimento visto a preocupação mundial com a qualidade das águas e a exigência por parte dos órgãos de fiscalização por esse tipo de análise. (FATMA 2002). Testes de toxicidade consistem em expor organismos teste representativos no ambiente à várias concentrações de uma ou mais substâncias durante determinado período de tempo para determinação de seu potencial tóxico, sendo os efeitos detectados através de respostas nos organismos (CETESB, 1990). Somente os sistemas biológicos (organismos ou parte deles) podem detectar os efeitos tóxicos das substâncias (IAP, 1997). Os testes de

3 toxicidade diferem em sua duração de tempo, sendo agudos ou crônicos. No efeito agudo, trata-se de uma resposta severa e rápida dos organismos às substâncias, já o efeito crônico se traduz pela resposta a um estímulo que continua por períodos de tempo mais extensos, que podem abranger parte ou todo o ciclo de vida dos organismos. (CETESB, 1990). Diversos organismos são utilizados para a realização dos testes. No bioensaio crônico, os organismos mais utilizados, atualmente, são microcrustáceos, entre eles Cerodaphnia dubia. A utilização da bactéria luminescente Vibrio fischeri em testes agudos é amplamente difundida e utilizada. Nessas bactérias, a emissão de luz é afetada quando elas entram em contato com substâncias tóxicas. A vantagem da fotobactéria V. fischeri sobre os demais bioindicadores, além de sua elevada sensibilidade, é conseqüência de sua resposta rápida, permitindo a obtenção de resultados com velocidade. Um ensaio de toxicidade aguda completo com fotobactérias pode ser concluído em menos de duas horas. A bactéria bioluminescente Vibrio fischeri não está sendo utilizada no Brasil para realização de ensaios de toxicidade crônica. Houve o desenvolvimento de um teste de toxicidade crônica com Vibrio fischeri pela empresa alemã Dr. Bruno Lange (LANGE, 1996), mas não é aplicado em ampla escala. A vantagem da bactéria Vibrio fischeri em testes de toxicidade crônica, seguindo o mesmo raciocínio de um teste agudo, objetiva diminuir o tempo de realização do teste e torná-lo mais prático. O teste crônico visa obter informações sobre as reações dos organismos num período de tempo prolongado, que inclua parte ou todo ciclo de sua vida. Com os organismos atualmente utilizados, o teste se torna demorado, pois os ciclos de vida dos bioindicadores duram meses ou até anos como no caso de peixes. Já se tratando da bactéria Vibrio fischeri, 24 horas significam várias gerações em sua existência, podendo assim indicar reações não somente no comportamento, mas no crescimento e na reprodução. Apesar de utilizarem metodologias parecidas, o teste agudo não pode ser direcionado integralmente para a realização de um teste crônico. No teste agudo, a composição do meio de reconstituição não tem o objetivo de manutenção da viabilidade celular durante longos períodos de tempo, mas sim por um curto período. Esta manutenção da viabilidade celular se torna um grande desafio no desenvolvimento do teste crônico com a bactéria Vibrio fischeri. Criar um meio de reconstituição, onde as bactérias sejam capazes de sobreviver e emitir luz durante o período do teste ou mais, consiste na possibilidade posterior de confrontar as bactérias com os agentes-testes para verificação das reações durante um período maior de tempo. MATERIAIS E MÉTODOS Para os testes utilizou-se o organismo-teste Vibrio fischeri, que é uma bactéria não patogênica, marinha, bioluminescente, anaeróbia facultativa, Gram-negativa pertencente a família Vibrionaceae que vive em associação com peixes. Um luminímetro (Lumistox 200, empresa Dr. Lange) foi utilizado para aferição da luminescência em ambos os testes. Como as fotobactérias vivem em grandes profundidades, exigem temperaturas baixas para sua sobrevivência fora de seu habitat. Para a manutenção da temperatura utiliza-se um termobloco, que é parte integrante do aparelho Lumistox com temperatura constante a 15 o

4 C. As bactérias são acondicionadas em frascos Eppendorf e armazenadas em freezer a uma temperatura de 30 º C negativos em alíquotas de 0,1 ml. Quando utilizadas para o teste devem ser descongeladas em água corrente por 2 minutos e colocadas no meio de reconstituição numa alíquota de 12 ml. Ficam nesse local o tempo necessário para se reestruturar e metabolizar os compostos do meio, conseqüentemente, emitindo luz. Após o tempo determinado para cada teste são colocadas em alíquotas de 0,5 ml nos tubos de leitura. Nesses tubos ficam o tempo determinado para haver estabilização da temperatura. Todos procedimentos foram baseados em norma ISO/DIS e DIN Ensaios de Toxicidade Crônica Estabelecimento do meio de reconstituição O meio de reconstituição é a base para as bactérias sobreviverem durante o período do ensaio. No teste crônico esse meio deve fornecer os compostos necessários a manutenção da viabilidade celular para haver a emissão de luz pelas bactérias, ao contrário do que acontece no teste de toxicidade aguda onde a duração do ensaio é curta e não visa a manutenção da viabilidade celular para emissão de luz por longos períodos. No primeiro momento do trabalho foram realizados ensaios com diversos meios de reconstituição onde as bactérias teriam condições para sobreviver e emitir luz durante o período de 24 horas. A composição do meio de estabilização é um fator essencial para a manutenção da luminescência do bioindicador. Meios foram testados variando sua composição, sendo escolhido o mais apropriado que fornecesse uma emissão de luz estável por parte das bactérias. As leituras se procederam de hora em hora, conforme disponibilidade, para projetar curvas e pontos de luminescência no decorrer do período dos ensaios. Nesta fase, não foram utilizados agentes-testes para inibição da luminescência, tendo em vista que o objetivo principal era sua manutenção e estabilidade. Método de Ensaio A leitura do teste crônico, neste trabalho, se procede em tempo 0, para verificação da luminescência, tempo 0,5 h e tempo 24 horas; As bactérias foram alojadas nas cubetas de leitura isentas de toxicidade, com a temperatura estabilizada a 15o C. Faz-se então a primeira leitura da luminescência e posteriormente são adicionados 0,5 ml de solução-teste a cada tubo de leitura contendo 0,5 ml de bactérias. Para cada diluição há duas cubetas de leitura, sendo que os resultados serão calculados como média das duas aferições. A leitura e a adição da solução-teste são realizadas no sentido da esquerda para direita em intervalos de 30 segundos cada. Para o teste crônico em fase experimental optou-se por determinar dois tubos de leitura como controle em duplicata. No teste agudo convencional são utilizados um tubo controle mensurado em duplicata. Para testar o meio de reconstituição formulado foram realizados testes de toxicidade crônica com agentes químicos conhecidos, efluentes industriais e águas superficiais e comparados com os respectivos testes agudos. Cálculo dos resultados

5 Toxicidade Aguda Os testes de toxicidade aguda são calculados através do software Lumisoft (Dr. Lange) que acompanha o aparelho utilizado. Para a comparação com o teste de toxicidade crônica optou-se por calcular os resultados, neste trabalho, através do programa estatístico Excel (Microsoft). A metodologia e os parâmetros analisados são os mesmos ao do teste crônico, para o cálculo dos resultados, sendo que no teste agudo não se obtém a cinética em 24 horas. Toxicidade Crônica A análise dos resultados foi feita através da determinação dos valores de CE20, CE 50 e FDb a partir dos dados das cinéticas mensurados no luminímetro e calculados no software Microsoft Excel, para as cinéticas em 0,5 h e 24 horas. Para cada diluição da solução teste foi calculada a média entre esses dois valores dos tubos de leitura. A média dos valores mensurados em cada diluição é expressa por Md= (Valor 1 + Valor 2) / 2 onde Md é a média na diluição "x", Valor 1 é o primeiro valor mensurado com solução teste e Valor 2 é o segundo valor mensurado da mesma diluição. Assim consecutivamente para cada diluição. A média do tubo controle (Mc) também foi calculada, nos tempos de 0,5 e 24 horas. Cálculo do efeito inibitório nos tempos 0,5 h e 24 h: I0,5 = 1- (Md/Mc) utilizando-se das médias calculadas em tempo 0,5 h, convertendo o resultado para percentual. I24 = 1- (Md/Mc) utilizando-se das médias calculadas em tempo 24 h. I0,5 e I24 são os efeitos inibitórios de uma solução teste após o tempo de contato de 0,5 e 24 horas, respectivamente, em %. Calculados os efeitos inibitórios em cada nível de diluição pode-se determinar a relação concentração efeito. Com o objetivo de ajustar os valores para sua real progressão, definiuse a curva logarítmica como modelo a ser usado, sendo que esta apresenta um menor erro residual quando comparada com as outras curvas (linear, exponencial, etc.). Além disso, ela é comumente usada para este tipo de cinética. A concentração do agente teste que causará inibição da luminescência terá relação inversa ao fator de diluição. Quanto menor a concentração maior será o fator de diluição. Para uma melhor compreensão de valores reais, utiliza-se o parâmetro fator de diluição. O fator de diluição para bactérias é expresso por FDb = 100 /CE20 ou CE50, dependendo da inibição desejada. Preparo da amostra A solução bruta (agente-teste) foi preparada para que fatores como ph, sólidos suspensos ente outros não interferissem nos resultados. As diluições foram ajustadas para uma concentração de 20g/L de NaCl de modo a criar condições fisiológicas para a manutenção da viabilidade das bactérias marinhas, o ph foi ajustado para , e houve centrifugação da amostra se houvesse necessidade de retirada de sólidos suspensos. As amostras da

6 solução-teste devem permanecer por no mínimo 15 minutos no termobloco para estabilização da temperatura antes de serem colocadas em contato com as bactérias. Controle de crescimento de biomassa O crescimento relativo de biomassa nas amostras foi verificado através de espectrofotometria à Abs 585 nm confrontado com o meio de reconstituição livre de células.a biomassa inicial é mensurada em tempo 0, considerando 100% de crescimento. Após as 24 horas do ensaio são mensuradas as biomassas de cada diluição e comparadas com a biomassa inicial em percentagem. RESULTADOS E DISCUSSÃO A necessidade primordial que se apresentou no início deste trabalho foi a formulação de um meio de reconstituição capaz de manter a viabilidade das bactérias durante um período prolongado. Os primeiros ensaios realizados foram voltados para este objetivo principal. Sabe-se que certas espécies de bactérias luminescentes emitem luz na suspensão celular somente quando a densidade celular alcança um limiar (quorum) > 107cel/ml. Isso ocorre porque a bactéria somente imitirá luz quando elas tiverem acumulado extracelularmente um limiar de concentração do sinal específico da espécie, autoindutores. (WHITE,1995).Vibrio fischeri cresce em ambientes com elevadas densidades celulares (aproximadamente 1011 cel/ml) nos organismos marinhos onde vive em simbiose. Produzem luz porque estão em concentrações que induzem luminescência através da síntese de um autoindutor que serve como sinal de densidade (quorum-sensing-signal) cuja estrutura se apresenta a seguir. (WHITE,1995). Levando em conta essa influência foram adicionados indutores ao meio de reconstituição e posteriormente testados variando também as formulações do meio original como mostram os resultados na figura 01. Com a modificação do meio nesse sentido a manutenção da luminescência foi eminente, não somente nas 24 horas, bem como em mais de 40 horas de duração do teste, levando em alguns pontos ao crescimento dos organismos teste e aumento da luminescência. O indutor teve influência evidente na manutenção da luminescência ao longo do ensaio. A manutenção da luminescência foi garantida, mas dependendo da quantidade de fonte de carbono utilizada as bactérias emitem uma maior ou menor luminescência inicial. Figura 01 Valores de luminescência dos meios testados com diversas leituras ao longo do tempo, utilizando-se um indutor na sua composição.

7 Testes de Sensibilidade Utilizando Substâncias Testes Foram testados dois produtos químicos de toxicidade conhecidas: Dicromato de potássio (K2Cr2O7) e Sulfato de zinco (ZnSO4 7H2O) No primeiro ensaio realizado com substância teste conhecida foi utilizado o Dicromato de Potássio que é padronizado para ensaios de sensibilidade para bactérias no teste agudo. Os resultados obtidos no ensaio crônico são apresentados na figura 02. Estes resultados foram obtidos para a concentração inicial da amostra de 625mg/l. Figura 02 Concentração de dicromato de potássio comparados com a inibição da luminescência no teste crônico e agudo Para o ensaio com dicromato ocorreu o esperado, que seria uma inibição bastante significativa levando em conta que esta substância é de toxicidade elevada e conhecida. As bactérias não tiveram crescimento celular sendo que a concentração relativa de biomassa ficou abaixo em todas as diluições se comparadas com a inicial medida. A substância teste apresentou níveis elevados de toxicidade. Esses níveis foram superados no ensaio de toxicidade crônica evidenciando assim sua sensibilidade, que para este caso foi maior que a do teste agudo. Utilização do Sulfato de Zinco. Na figura 03 são apresentados os resultados desde ensaio. Ele foi realizado para a concentração inicial da amostra de 1250mg/l Figura 03 Concentração de sulfato de zinco comparado com a inibição da luminescência no teste crônico, tempo 30 min 24 horas e, no teste agudo. O ensaio agudo para esta substância foi mais sensível apresentando maior toxicidade. Sabese que os ensaios de toxicidade com Vibrio fischeri não são sensíveis a determinados metais. As bactérias provavelmente conseguem reverter o efeito tóxico inicial e manter a luminescência demonstrando que ao longo do tempo o efeito tóxico não se torna tão representativo.

8 Houve um aumento significativo nos valores de biomassa mensurados. Este fato pode ser indicador de um crescimento aparente mostrando que as bactérias conseguiram se adaptar ao meio, sobrevivendo e emitindo luz. O sulfato de zinco apresentou uma toxicidade significativa no teste agudo. As bactérias estando em meio rico em nutrientes podem encontrar força metabólica para defesa. A toxicidade somente é evidente em altas concentrações evidenciando o efeito cumulativo intracelular, não oferecendo muitas condições de defesa. Utilização de Efluentes Industriais Com o objetivo de testar a sensibilidade do teste crônico para amostras em que a composição não fosse conhecida, optou-se por utilizar efluentes de indústrias têxteis. Foram analisadas três amostras sendo uma de entrada em estação de tratamento e duas de saída da estação que são saídas para corpos receptores, sendo aqui apresentada a que obteve resultados mais significativos. A amostra coletada na saída da estação de tratamento de efluentes apresenta as seguintes características: ph 8,28 DQO 103 mg/l DBO5 24 mg/l Nitrogênio Total 2,05 mg/l Fósforo Total 0,657 mg/l Neste ensaio o teste de toxicidade aguda não acusou nenhuma toxicidade. Em contrapartida, o ensaio crônico demonstrou que, com o passar das horas, o efluente causava um efeito tóxico sobre as bactérias apesar do crescimento significativo de biomassa. O crescimento de biomassa se deve provavelmente a grande quantidade de nutrientes presentes no efluente. As concentrações efetivas e o fator de diluição resultantes são apresentados da tabela 01. Figura 04 Concentração do efluente industrial comparado com inibição da luminescência no teste crônico. Tabela 01 - Resultado dos valores de CE20, CE 50 e Fator de Diluição para bactérias.

9 Bioensaio CE 20 CE 50 FDB Agudo (convencional) Crônico ( 30 minutos) Crônico ( 24 horas ) Os valores de toxicidade no teste crônico acusaram efeito de toxicidade, um parâmetro que não poderia ser possível identificar somente com o teste agudo. ( = não detectado ) Ensaios com Águas Superficiais Os testes com águas superficiais foram realizados com fins de experiência preliminar, sendo aqui apresentado, o ensaio que obteve resultado mais significativo. A amostra no Rio Itajái-açú foi coletada logo após a desembocadura do Ribeirão Garcia, aproximadamente 50 metros. As condições reinantes eram as seguintes: Condição Climática: Sol

10 Chuvas nos dias anteriores: Sim Temperatura ambiente: 30.9 º C ph da amostra no momento da coleta: 7,0 Características organolépticas: odor forte de esgoto Data e hora da coleta: 28/01/03-16:20 h Presença de sólidos no tubo de coleta após algum tempo. Os resultados são apresentados na figura 07. Observamos neste ensaio o mesmo fato ocorrido no anterior utilizando águas superficiais. Os valores de inibição oscilaram entre as diluições sendo que nas maiores houve uma inibição elevada. Muitas substâncias quando em grandes sistemas, como um rio, ficam aderidas a compostos maiores, ficando assim camufladas. Uma possível explicação para este fato seria de que diluindo a amostra, confrontamos as bactérias com essas substâncias possivelmente nocivas. Neste momento nos confrontamos com os limites e dificuldades de um teste de toxicidade, levando em consideração diversas varáveis, principalmente se tratando de um teste crônico. As variáveis que poderiam explicar esse caso são diversas e por fim difíceis de serem identificadas. O crescimento relativo de biomassa também não foi significativo neste ensaio. Ao contrário dos efluentes, neste meio as bactérias não encontram nutrientes suficientes para a proliferação. As concentrações efetivas e o fator de diluição resultantes são apresentados da tabela 02. Figura 05 Resultado do ensaio de toxicidade crônica nos tempos 0,5 e 24 horas e no ensaio agudo de águas superficiais Tabela 02 - Resultado dos valores de CE20, CE 50 e Fator de Diluição para bactérias, com águas superficiais. Bioensaio CE 20 CE 50

11 FDB Agudo (convencional) 669 >> Crônico ( 30 minutos) >> >> Crônico ( 24 horas ) O ensaio crônico alcançou uma faixa de toxicidade significativa para esta amostra. O fator que causa a toxicidade em uma amostra complexa como águas superficiais ou efluentes industriais não é possível ser identificado precisamente. O fato interessante seria que algo naquele sistema pode causar danos a biota local. CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES O trabalho apresentou resultados positivos, pois o meio de reconstituição, fator base para o desenvolvimento do teste, foi formulado, testado e aprovado, mantendo a luminescência das bactérias durante mais de 24 horas. O fator essencial na manutenção da luminescência foi a adição do indutor ao meio de reconstituição. Com a luminescência estável, foi possível comprovar a sensibilidade do teste crônico utilizando-se amostras de toxicidade conhecida, efluentes e águas superficiais. A análise de biomassa é recomendada, pois se tratando de um teste crônico um dos objetivos é a verificação do desenvolvimento dos organismos, crescimento ou morte

12 celular, bem como reprodução. Com análise de biomassa no sistema obtive-se um percentual de crescimento relativo da biomassa ao final do ensaio. Por apresentar uma sensibilidade mais elevada do que os testes agudos, o teste crônico com a bactéria Vibrio fischeri tem em um dos seus objetivos servir de ferramenta no monitoramento da toxicidade de águas superficiais, porém precisa ser padronizado com uma série maior de ensaios para esse fim. O desenvolvimento de um teste de toxicidade exige tempo e inúmeras experimentações para sua padronização e fixação de parâmetros. Este trabalho foi o primeiro passo para o desenvolvimento deste teste crônico com a bactéria luminescente Vibrio fischeri. A formulação de um meio de reconstituição onde as bactérias foram capazes de emitir luz durante o período do ensaio foi o ponto significante para dar continuidade aos ensaios. Promover uma proposta de padronização, e identificação da viabilidade do teste para monitoramento de águas superficiais pode desenvolver uma proposta científica de trabalho interessante. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CETESB. Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental. Procedimentos para utilização de testes de toxicidade no controle de efluentes líquidos. São Paulo, p. LANGE, Dr Bruno. GmbH: Lumistox 200. Operatig Manual. Ver 2,0, ago IAP. Instituto Ambiental do Paraná. Manual de avaliação de impactos ambientais. Curitiba, 1997, 90p. Norma DIN Test fahren mit Wasser organismem. (Gruppe L) teil / L Portaria FATMA no. 017/02-18/04/2002. ISO / DIS International Organization for Standardization. Water quality - determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminecescentbacteria test) WHITE, David. The physiology and biochemistry of prokaryotes. 2o. ed. New York: Madison Avenue, 2000.