DNA recombinante_ Desconheço a origemda apostila. Mas, é muito Boa!

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1 Conteúdo I. CONCEITOS BÁSICOS 2 1. INTRODUÇÃO 2 2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR 3 3. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 3 4. CONSTRUÇÃO DO DNA RECOMBINANTE 7 5. DNA LIGASE Tipo de fragmento de DNA que ão ligado pela DNA ligae 8 6. TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA Conceito de tranformação induzida Mecanimo de captação do DNA 11 II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR PLASMÍDEO FAGOS Biologia do fago Genoma do fago Controle de expreão do gene do fago O uo do fago como vetor de clonagem molecular COSMÍDEO VÍRUS Clonagem no víru SV BACTERIÓFAGO M Clonagem no bacteriófago M Etratégia de clonagem em vetore da érie M13mp FAGOMÍDEOS Clonagem no fagomídeo VETORES PARA TRANSFORMAÇÃO DE LEVEDURAS 30 III. CONSTRUÇÃO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE BIBLIOTECA DE CDNA Síntee de cdna de fita dupla Preparo do cdna para a ligação com o vetor BIBLIOTECA GENÔMICA Preparo do DNA do inerto Vetore utilizado na contrução biblioteca genômica 43 IV. DETECÇÃO E ANÁLISE DO CLONE RECOMBINANTE QUANDO O GENE DE INTERESSE É EXPRESSO NO HOSPEDEIRO O USO DE SONDAS MOLECULARES DE ÁCIDOS NUCLÉICOS PARA IDENTIFICAR O GENE DE INTERESSE ANÁLISE DO DNA E RNA POR ELETROFORESE EM GEL E BLOTTING COMO OS GENES CLONADOS SÃO UTILIZADOS? MAPA DE RESTRIÇÃO 57 V. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) 58 VI. SEQUENCIAMENTO DE DNA 61 VII. EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS INTRODUÇÃO EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EM E.COLI Subclonagem em plamídeo de expreão Análie do plamídeo e eleção do ubclone correto PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EM E. COLI Produção de proteína híbrida Produção de proteína intacta EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EM ORGANISMOS EUCARIOTOS 72 1

2 4.1. Expreão em célula de mamífero Expreão em fungo SISTEMA DE EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE INSETO UTILIZANDO BACULOVÍRUS COMO VETOR EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE DROSOPHILA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS: APLICAÇÕES E PERSPECTIVAS Biblioteca de expreão e identificação de nova proteína atravé de anticorpo ou outro ligante epecífico A utilização da tecnologia do DNA recombinante no conhecimento de receptore de membrana Expreão de proteína para intervenção terapêutica 81 VIII. ANÁLISE DE EXPRESSÃO ATRAVÉS DE MICROARRANJOS DE DNA 84 IX. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 88 I. CONCEITOS BÁSICOS 1. INTRODUÇÃO Até a década de 70, o DNA era o componente celular mai difícil de er analiado. Sua equência de nucleotídeo de enorme tamanho e monotonia química era geralmente analiada atravé de meio indireto como a equência de proteína e análie genética. A partir da década de 70 nova tecnologia foram deenvolvida permitindo o iolamento e a purificação de gene epecífico num proceo chamado de clonagem gênica. Na verdade, muita deta técnica ão proveniente da Microbiologia, Bioquímica, Imunologia e Genética Microbiana e permitiram que a análie do DNA ganhae um novo enfoque. O DNA tornou-e então, a molécula mai fácil de er analiada, endo poível iolar regiõe epecífica, obtê-la em grande quantidade e determinar a ua eqüência numa velocidade de milhare de nucleotídeo por dia. A Tecnologia do DNA recombinante, como e convencionou denominar ete conjunto de técnica, tem uma ampla aplicação. Ela pode er uada para etudar mecanimo de replicação e expreão gênica, na determinação da eqüência de um gene e coneqüentemente da proteína que ele codifica, ou no deenvolvimento de cultura microbiana capaze de produzir ubtância útei tai como a inulina humana, hormônio de crecimento, vacina e enzima indutriai em grande quantidade. Sua aplicação comercial ou biotecnológica parece ter um potencial inegotável. 2

3 Como coneqüência do deenvolvimento deta tecnologia é atualmente poível realizar invetigação de paternidade e o diagnótico de doença genética e infeccioa atravé da análie de DNA. 2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR A origem do termo clonagem vem da Genética Bacteriana que conidera uma colônia de bactéria como um clone porque todo o indivíduo ão geneticamente idêntico à bactéria inicial. A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular, a qual conite no iolamento e propagação de molécula de DNA idêntica. A clonagem molecular compreende pelo meno doi etágio importante. Primeiro, o fragmento do DNA de interee chamado de inerto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de vetor para formar o que e chama de DNA recombinante. Segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hopedeira compatível, num proceo chamado de tranformação. A célula hopedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de tranformante ou célula tranformada. Um único tranformante, em condiçõe ideai, ofre muito ciclo de divião celular, produzindo uma colônia que contém milhare de cópia do DNA recombinante. 3. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Em 1953 foi decrito um etranho fenômeno no qual a eficiência da replicação de um bacteriófago (víru de bactéria) dependia da célula hopedeira na qual ele etava inerido. Algum tempo depoi percebeu-e que a inabilidade de certo fago crecerem em determinada linhagen bacteriana era devido a preença de nucleae altamente epecífica que clivavam o eu DNA. Ito pode er encarado como um itema de defea bacteriano que degrada DNA que lhe é etranho (retrição). A bactéria protege eu próprio DNA deta degradação camuflando-o atravé da metilação de alguma bae epecífica (modificação). Como coneqüência, ete itema é frequentemente decrito como fenômeno da retrição/modificação e exite em um grande número de bactéria. A enzima de retrição ou endonucleae de retrição ão dividida em vária clae, dependendo da etrutura, da atividade e do ítio de reconhecimento e clivagem. A 3

4 enzima do Tipo II, a mai importante na Tecnologia do DNA Recombinante, ão proteina monomérica ou dimérica e clivam o DNA no memo ítio do eu reconhecimento. O ítio de reconhecimento dete tipo de enzima é normalmente uma eqüência palindrômica, ito é, ela tem um eixo de imetria e a eqüência de bae de uma fita é a mema da fita complementar, quando lida na direção opota (Figura 1). a) Clivagem no eixo de imetria b) Clivagem imétricamente ituada ao redor do eixo de imetria...tc GA......AG CT......GAA TTC......CTT AAG Molécula com extremidade abrupta Molécula com extremidade coeiva Figura 1. O doi tipo de clivagem feito por enzima de retrição. A eta indicam o ítio de clivagem e a linha pontilhada repreentam o centro de imetria da equência. Eta enzima reconhecem eqüência epecífica de 4 a 8 pare de bae (pb) na molécula de DNA e fazem doi corte, um em cada fita. Há 2 tipo ditinto de clivagen: a) o doi corte ocorrem no eixo de imetria da eqüência epecífica, gerando extremidade abrupta, ou b) o corte ão feito imetricamente, porém, fora do eixo de imetria, gerando extremidade coeiva. Ete doi tipo de clivagen e ua coneqüência etão motrado na Figura 1. Atualmente, mai de 1000 enzima de retrição já foram identificada. A nomenclatura deenvolvida foi baeada na abreviação do nome do microrganimo do qual a enzima foi iolada. A primeira letra repreenta o gênero e a outra dua a epécie, eguido de um algarimo romano (ou outra letra) que indica a ordem da decoberta ou a linhagem da qual ela foi iolada. Por exemplo, a enzima de retrição denominada de EcoRI é purificada de uma Echerichia coli que carrega um fator de tranferência de reitência RI, enquanto que a Hind III é iolada da Haemophilu influenzae, linhagem d III. 4

5 A Tabela 1 motra a eqüência palindrômica e o local de clivagem de alguma enzima de retrição. Note que alguma enzima deixam terminaçõe coeiva enquanto que outra fazem corte abrupto ou não coeivo. Microrganimo Enzima Sequência Alvo Echerichia coli EcoRI G A A T T C C T T A A G Bacillu amyloliquefacien H BamHI G G A T C C C C T A G G Bacillu globigii BglII A G A T C T T C T A G A Haemophilu aegyptiu HaeII P u G C G C P i P i y C G C G Pu Haemophilu aegyptiu HindIII A A G C T T T T C G A A Providencia tuartii PtI C T G C A G G A C G T C Streptococcu albu G SalI G T C G A C C A G C T G Thermu aquaticu TaqI T C G A A G C T Brevibacterium albidium BalI T G G C C A A C C G G T Haemophilu aegyptiu HaeIII A G G C C T T C C G G A Serratia marcecen SmaI C C C G G G G G G C C C Tabela 1. Alguma endonucleae de retrição: origem e ítio de clivagem. A eta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-e, repectivamente, a qualquer purina e pirimidina. O interee por eta enzima de retrição aumentou em 1973 quando e percebeu que ela poderiam er uada para fragmentar o DNA deixando extremidade de fita imple de DNA que permitiam a ligação do fragmento. Ito ignificava que a recombinação poderia er efetuada em tubo de enaio. Além dito, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA 5

6 humano ou de qualquer outra epécie, abrindo a poibilidade de clonar gene humano ou iolar proteína de cultura bacteriana. Uma importante coneqüência da epecificidade deta enzima de retrição é que o número de clivagen feito por cada uma dela no DNA de qualquer organimo é definido e permite o iolamento de fragmento dete DNA. Portanto, cada enzima de retrição gera uma família única de fragmento quando cliva uma molécula de DNA epecífica. Enzima que reconhecem ítio de retrição compoto por 4 pare de bae clivam o DNA em média a cada 256 nucleotídeo (4 4 =256). Aquela que reconhecem ítio com 6 e 8 pb clivam o DNA em média a cada 4096 e pb, repectivamente. No entanto, eta média pode ofrer variaçõe ignificativa, dependendo principalmente da compoição de bae do DNA analiado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um ítio de retrição contendo 8pb, incluindo nucleotídeo CpG, que raramente ocorre no DNA de mamífero. A família de fragmento gerado por digetão com enzima de retrição é geralmente detectada pela eparação dete fragmento por eletroforee em gel de agaroe. O fragmento migram em função de eu peo moleculare endo que o menore migram mai rapidamente (Figura 2). Pare de bae Sentido da migração Figura 2. Molécula de DNA de tamanho diferente podem er eparada por eletroforee. Molécula menore movem-e mai rapidamente que molécula maiore, tornando-e portanto eparada em banda. O DNA é corado com brometo de etídio, uma molécula que fluorece quando iluminada com luz Ultra Violeta. 6

7 4. CONSTRUÇÃO DO DNA RECOMBINANTE Uma enzima de retrição particular reconhece omente uma eqüência única de bae. DNA de origen diferente ob a ação da mema enzima de retrição produzem fragmento com o memo conjunto de extremidade fita imple. Portanto, fragmento de doi diferente organimo (por exemplo, bactéria e homem) podem er ligado por renaturação da regiõe de fita imple. Além dito, e a ligação for "elada" com a enzima DNA ligae, depoi do pareamento de bae, o fragmento erão ligado permanentemente. A técnica de DNA recombinante tem um interee epecial e uma da fonte de DNA clivado for um plamídeo. TGCA ACGT Plamídeo de E.coli DNA humano TGCA TGCA ACGT ACGT Enzima Enzima GCA T T ACG DNA ligae TGCA ACGT TGCA ACGT Plamídeo híbrido Figura 3. Contrução de uma molécula de DNA híbrida a partir de fragmento de diferente organimo obtido com o uo de enzima de retrição. A figura 3 motra uma molécula de DNA de plamídeo que tem omente um ítio de clivagem para uma determinada enzima de retrição. A mema enzima é uada para clivar DNA humano. Se o fragmento de DNA humano ão miturado com o DNA plamidial linearizado, permitindo a ligação entre ele, uma molécula de DNA plamidial contendo DNA humano pode er gerada. Ete plamídeo híbrido pode er inerido numa bactéria atravé de tranformação e então o inerto erá replicado como parte do plamídeo. 7

8 Geralmente, antibiótico ão acrecentado ao meio da cultura para elecionar omente a linhagen que portam o plamídeo (o plamídeo uado para eta finalidade porta reitência a pelo meno um antibiótico). 5. DNA LIGASE Conforme mencionado anteriormente, eta enzima promove a ligação do fragmento de DNA em vetore previamente clivado por endonucleae de retrição. A DNA ligae requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma da cadeia de DNA e um grupo fofato na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligae capaz de elar fragmento de DNA com dupla fita. DNA ligae iolada de E.coli e de outra bactéria requer NAD+, enquanto que a iolada do bacteriófago T4 requer ATP como cofator. O DNA 3 OH + - O P O 5 DNA - O DNA-Ligae ATP ou NAD O DNA 3 O P O 5 DNA - O Figura 4. DNA ligae cataliza a junção de dua fita de DNA que ão parte da molécula da duplahélice Tipo de fragmento de DNA que ão ligado pela DNA ligae a) Fragmento com extremidade coeiva A extremidade coeiva produzida por vária enzima de retrição permitem que doi fragmento de DNA ejam mai facilmente ligado. Ito porque ocorre inicialmente o pareamento da fita imple da extremidade coeiva da dua diferente molécula, atravé da formação de ponte de hidrogênio pela complementariedade da bae. 8

9 Finalmente, a ligação covalente (fofodiéter) do fragmento é realizada pela DNA ligae (ver figura 4). b) Fragmento com extremidade não coeiva DNA portando extremidade não coeiva ão ligado com muito meno eficiência que aquele que tem extremidade coeiva. Uma concentração muito maior de DNA ligae e memo do DNA envolvido é neceária para que a molécula com extremidade não coeiva ofram reação de ligação. No entanto, a ligação dete tipo de fragmento é facilitada pela tranformação prévia da extremidade não coeiva em coeiva. Ete procedimento pode er feito atravé de doi proceo: a) Adição de polideoxiadenina na extremidade 3' de um fragmento de DNA e polideoxitimina na extremidade 3' de um outro fragmento de DNA, atravé da enzima deoxinucleotidil-tranferae-terminal ou implemente tranferae. Eta enzima, uma DNA polimerae incomum, adiciona nucleotídeo à extremidade 3 -OH de fragmento fita imple proeminente de uma cadeia de DNA. Para gerar ete tipo de extremidade proeminente a molécula é tratada previamente com uma exonucleae 5 -epecífica para remover algun nucleotídeo terminai. Apó a mitura do doi tipo de fragmento complementare e anelamento do memo, a molécula ão unida preenchendo-e o epaço exitente com o auxílio da DNA pol I e elando-o com DNA ligae (Figura 5) b) Adição de adaptadore à extremidade não coeiva. O adaptadore ão oligonucleotídeo intético que contém ítio de clivagem para uma ou mai enzima de retrição. Ele ão unido ao DNA com o auxílio da DNA ligae (Figura 6). Alternativamente, no lugar de modificar a extremidade não coeiva, pode-e optar pela utilização de T4 ligae em grande concentração, o que permitirá a ligação entre molécula de DNA em proeminência. 6. TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA 6.1.Conceito de tranformação induzida 9

10 O proceo de tranformação contitui um evento de alta importância na técnica de manipulação gênica. A tranformação natural decrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradore, em 1944, é um evento raro. No entanto, em 1970, Mandel e Higa encontraram que a E.coli tornou-e marcadamente competente para tranformação com DNA exógeno, quando a bactéria foi upena em cloreto de cálcio gelado e ubmetida a um curto choque térmico à 42oC. Ete memo autore também verificaram que a bactéria crecida até a fae log eram mai competente do que aquela iolada de outro etágio do crecimento Exonucleae epecífica Deoxinucleotídio tranferae terminal +datp +dttp AAAA TTTT AAAA TTTT Epaço preenchido com DNA Pol I. DNA ligae para completar a ligação Figura 5. Fragmento de DNA com extremidade não coeiva podem er tranformada em coeiva pela adição de poli (A) e poli (T). 10

11 Vetor GAATTC CTTAAG DNA a er inerido + GAATTC CTTAAG Adaptador Sintético T4 DNA ligae EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI G CTTAA AATTC G AATTC G G CTTAA Figura 6. Fragmento de DNA com extremidade não coeiva podem er tranformado em coeiva pela adição de adaptadore e poterior tratamento com a enzima de retrição que reconhece o adaptador. O procedimento do cloreto de cálcio que é uado até hoje produz uma eficiência de tranformação da ordem de 105 a 107 tranformante por micrograma de DNA (a eficiência de tranformação é geralmente exprea como o número de célula tranformada, obtido a partir de um micrograma de DNA plamidial intacto). O tamanho e a conformação da molécula do DNA, afetam o proceo de tranformação. Plamídeo pequeno ão mai facilmente incorporado pela célula bacteriana competente; DNA linear é pobremente incorporado, talvez pelo fato de ofrer degradação pela enxonucleae preente no epaço periplamático Mecanimo de captação do DNA O mecanimo de captação da molécula do DNA pela bactéria competente ainda é deconhecido. Uma hipótee é que a molécula do DNA paam atravé de canai ituado na chamada zona de adeão, que ão locai onde a membrana interna e externa da célula bacteriana unem-e formando poro. Ete poro ó etão preente durante o crecimento bacteriano (fae de crecimento exponencial). 11

12 - - DNA recombinante_ Deconheço a origemda apotila. Ma, é muito Boa! Em condiçõe naturai, a captação do DNA torna-e difícil devido a repulão eletrotática exitente entre a carga negativa da camada de fofolipídeo da membrana bacteriana e do grupo fofato da molécula do DNA. O papel do cálcio é explicado pela hipótee de que a 0oC a fluidez da membrana celular é critalizada, etabilizando a ditribuição do fofato carregado. O íon Ca +2 formam um complexo com ete grupamento, cobrindo a carga negativa e aim facilitando a atração eletrotática com a molécula do DNA na zona de adeão. O choque térmico, complementa ete proceo de captação, provavelmente criando um debalanço térmico entre o interior e o exterior da célula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA atravé da zona de adeão. A figura 7 ilutra ete proceo. DNA genômico Célula Bacteriana - Zona de adeão Plamídeo Bicamada lipídica (interna) Camada peptido glucan Bicamada lipídica (externa) Fofolipídeo Íon de cálcio Figura 7. Mecanimo molecular propoto para explicar a tranformação de E. coli com uma molécula de DNA exógeno. 12

13 II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR Apó o iolamento de uma informação genética, por exemplo um fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzima de retrição, ete fragmento deverá er inerido numa outra molécula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informação genética em centena de cópia. Ete proceo de amplificação é obtido atravé do uo de molécula de DNA que ão o chamado vetore de clonagem molecular. Atualmente, o tipo báico de vetore uado na metodologia do DNA recombinante apreentam caracterítica epeciai que o tornam excelente veículo de clonagem em diferente ituaçõe. A eguir, vamo apreentar o principai tipo de vetore atualmente em uo na biologia molecular. 1. PLASMÍDEO Plamídeo ão pequena molécula de DNA dupla fita, contendo o elemento neceário para a ua replicação e pelo meno um gene que confere reitência a antibiótico. Ete elemento genético extra cromoomai variam de 5 a 400 kilobae e comumente etão preente em dua ou mai cópia por célula. O plamídeo preente num grande número de cópia ão uado como veículo de clonagem dede que capacitem a amplificação do egmento do DNA nele clonado. Um plamídeo para er um bom vetor de clonagem deve conter a eguinte propriedade: a) pouir uma origem de replicação (O), ou eja, uma eqüência de DNA que permita que o vetor eja replicado na célula hopedeira; b) apreentar doi ou mai ítio único de clivagem para endonucleae de retrição. O conjunto dete ítio, denominado de Múltiplo Sítio de Clonagem (MSC), é o local onde o inerto é incorporado ao vetor de clonagem; c) pouir um gene que codifica um produto que ditingue a célula tranformada da célula não tranformada. Por exemplo, muito vetore de clonagem carregam o gene que confere reitência à ampicilina (Amp R ). A célula tranformada com tai vetore ão capaze de crecer num meio contendo o antibiótico, enquanto que a célula não tranformada acabam morrendo. 13

14 A figura a eguir ilutra a principai caracterítica etruturai de um plamídeo. O AmpR MSC Figura 8. Etrutura molecular de um plamídeo típico uado em clonagem molecular. Etão repreentado o gene de reitência (Amp R ), a região de múltiplo ítio de clonagem (MSC) e a origem de replicação (O). Um do pao fundamentai no proceo de clonagem molecular é o uo de enzima de retrição que produz extremidade compatívei durante a clivagem do DNA a er clonado (inerto) e a do DNA receptor (vetor). Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, eta molécula híbrida deverá er introduzida numa célula hopedeira geralmente bactéria, por um proceo chamado de tranformação, para que o vetor poa ofrer replicaçõe e conequentemente amplificar o número de cópia do inerto. A bactéria tranformada erá facilmente reconhecida pela aquiição de um novo fenótipo dado pelo plamídeo, ou eja, capacidade de crecer em meio contendo antibiótico. 2. FAGOS Um do vetore mai utilizado no proceo de clonagem molecular é o denominado bacteriófago, o qual comporta-e como um víru da E.coli. Ante de analiarmo o uo dete elemento como veículo de clonagem molecular, vamo motrar reumidamente a ua propriedade biológica e etruturai. 2.1 Biologia do fago 14

15 O fago é um paraita obrigatório da E.coli, o qual neceariamente deve injetar o eu DNA na bactéria hopedeira para a ua multiplicação. Apó a infecção da E.coli o genoma do fago pode eguir dua via: a) No primeiro cao denominado etado lítico, o DNA do fago permanece na bactéria como uma molécula independente, havendo a ativação de algun gene do fago e a concomitante inativação de outro, dentro de um programa etritamente definido. Como reultado o cromoomo do fago é replicado ativamente, ocorre a íntee da proteína da capa e da cauda e formam-e nova partícula virai. Em aproximadamente 45 minuto apó a infecção a célula hopedeira é liada havendo a liberação de cerca de 100 novo fago. b) A outra via que o cromoomo do fago pode eguir é o denominado etado liogênico. Nete cao, o DNA do fago é integrado no cromoomo da bactéria paando a er chamado profago. No etado liogênico, todo o gene do profago etão inativo com exceão do gene que produz a proteína repreora. A bactéria hopedeira carregando o profago multiplica-e e ete é replicado paivamente e ditribuído para a bactéria decendente. Em condiçõe naturai a opção entre eguir o etado lítico ou liogênico depende da condiçõe do meio. Aim, via de regra, em meio rico em nutriente o etado lítico é preferencial, por exemplo o fago na bactéria E.coli intetinal. Por outro lado, em meio pobre de nutriente como é o cao da E.coli no olo, o fago prefere o etado liogênico. Em condiçõe experimentai, o etado a er eguido depende de um balanço entre o fatore do meio intra e extra celular e de fatore genético da bactéria hopedeira e do bacteriófago. 2.2 Genoma do fago O bacteriófago é uma partícula viral contituída de aproximadamente 50% de proteína e 50% de DNA. O DNA do fago, na forma como ele é iolado da partícula viral, é uma molécula linear com dupla fita de aproximadamente pare de bae. A extremidade da molécula contêm uma fração de DNA fita imple com cerca de 12 nucleotídeo, o quai ão complementare na equência de bae e atravé dela é que o DNA aume a forma circular quando ele é injetado na célula hopedeira. Eta extremidade ão denominada de ítio co. O genoma do fago codifica para aproximadamente 50 proteína, cujo gene tem um cronograma de expreão bem definido, o que determina a intalação do etado lítico ou liogênico. 15

16 A figura 9 e 10 ilutram o ciclo biológico do fago em uma célula hopedeira e o genoma do fago com algun do eu principai gene, repectivamente. 2.3 Controle de expreão do gene do fago Seja qual for a via a er eguida pelo fago, ou eja via lítica ou liogênica, a expreão do gene envolvido nete circuito começa pelo produto do gene N e Cro, regulado pelo promotore pl e pr repectivamente ituado à equerda (pl) e à direita (pr) do gene ci. Durante o trancuro da via lítica, o produto do gene cro etá diretamente relacionado com a replicação do genoma do fago, atravé da indução da expreão do gene OP. Por outro lado, o produto do gene N etá diretamente relacionado com a expreão do gene da região de empacotamento, ou eja gene A e J, reponávei pela íntee da proteína da cabeça e da cauda do fago, como também da expreão do gene S e R, diretamente envolvido com a lie da célula hopedeira Figura 9. Replicação do fago no interior da célula hopedeira. Apó adorção (1) e injeção (2) do genoma do fago na bactéria, a via lítica indicada pelo número 3, 4 e 5 leva a formação de nova partícula virai. Alternativamente, a via liogênica (6) pode er ativada levando à integração do Empacotamento Recombinação Regulação Replicação Lie co A J int.ciii ci cii O P S R 16 N pl Cro pr

17 material genético viral ao genoma da bactéria hopedeira. Figura 10. Repreentação equemática do genoma do fago. Durante a via liogênica, a trancrição também inicia-e pelo promotore pl e pr coordenando a expreão do gene cii e ciii. O produto dete doi gene coordena a expreão do gene ci que produz uma proteína repreora inibindo a expreão do gene reponávei pelo empacotamento e a lie. Por outro lado, um outro gene importante é o int, cujo produto relaciona-e com a integração do fago no genoma bacteriano etabelecendo o etado liogênico. 2.4 O uo do fago como vetor de clonagem molecular Durante o ciclo lítico, o gene envolvido no proceo de liogênia ão dipenávei e conequentemente a região de integração do genoma do fago pode er totalmente ubtituída por um outro fragmento de DNA, em que haja qualquer alteração no proceo envolvido na via lítica. Uma da maiore vantagen de uar o fago como vetor de clonagem é que o DNA inerido no fago é empacotado in vitro. Embora a eficiência de empacotamento eja cerca de 10%, uma vez que o fago ão empacotado teremo 100% de eficiência na infecção da E.coli hopedeira. Ete proceo é altamente eficiente quando comparado com o da tranformação bacteriana com plamídeo. Nete cao, o melhore reultado ituam-e ao redor de 10 8 tranformante por µg de DNA o que ignifica que meno de 1 em 1000 plamídeo ão incorporado na E.coli hopedeira. Atualmente, exitem vário derivado do fago no quai um ou mai ítio de retrição flanqueiam a região de recombinação, facilitando a ua ubtituição por um outro DNA. Ete ão o chamado vetore de ubtituição. Um exemplo típico dete vetore é o EMBL3, no qual a região de recombinação é flanqueada pela enzima de retrição EcoRI, BamHI e SalI. Ee vetor quando quando clivado pode receber fragmento de DNA variando de 10,4 a 20 kb, como motra a figura abaixo. 17

18 Outro derivado do fago ão o chamado vetore de inerção. Nete tipo de vetor, o fragmento de DNA que podem er inerido devem ter no máximo até 7kb de tamanho para não alterar o proceo de empacotamento do genoma do fago. O vetore de inerção derivado do fago mai bem utilizado epecialmente na clonagem de cdna, ão o vetore gt10 e o gt11. Vamo a eguir fazer alguma conideraçõe obre ete doi tipo de vetore. No fago gt10, o inerto geralmente cdna, é inerido no ítio da EcoRI ituado no gene repreor ci. O fago recombinante terá agora o gene ci obtruído e conequentemente durante a cultura provocará a lie da colônia de bactéria tranformada. Ea colônia liada ão viualizada como círculo com o centro claro (placa de lie), batante ditinto da colônia não recombinante, que por pouírem o gene ci íntegro não ão liada e permanecem como colônia turva. 18

19 DNA bacteriófago a b b b c EcoRI a b ligae c informaçõe deneceária ã replicação EcoRI empacotamento in vitro bacteriófago contendo gene do camundongo DNA camundongo Figura 11. Repreentação equemática da clonagem de um fragmento de DNA genômico no fago. A regiõe indicada por a contém toda a informaçõe neceária para replicação em E. coli e empacotamento in vitro. O diferente fragmento obtido da digetão do DNA de interee com enzima apropriada etão indicado pela letra b e c, onde omente c poui tamanho adequado para o empacotamento. Por outro lado, o fago gt11 contêm um ítio de retrição EcoRI localizado num gene chamado LacZ, a 53 nucleotídeo do códon de término da enzima codificada por ee gene ( -galactoidae). Ea enzima, cuja expreão pode er induzida por IPTG (iopropil- -D-galactoídeo), degrada o ubtrato X-gal produzindo um precipitado de cor azul. Portanto, colônia de bactéria carregando o DNA do fago com o gene LacZ intacto (em inerto), na preença do indutor IPTG e do ubtrato X-gal, ficarão azui. Enquanto que, 19

20 aquela portanto o DNA o fago que incorporou o inerto no ítio de EcoRI, não expream a -galactoidade e permanecem de cor branca, o que facilita a identificação do clone recombinante. 3. COSMÍDEO A clonagem de fragmento de DNA no fago apreenta uma limitação, poi o fragmento a er clonado não pode er maior do que cerca de 15kb (Figura 12). Na maioria da veze, eta dimenão é uficiente para conter um gene completo, incluindo a equência flanqueadora. Entretanto, muito gene apreentam dimenõe da ordem de 35 a 40 kb e nete cao, a técnica uada para a clonagem dete tipo de fragmento é a chamada clonagem em comídeo. O comídeo, ão plamídeo que contêm um fragmento de DNA do fago que inclui o ítio co. Ete comídeo podem er uado como veículo de clonagem molecular empregando o itema de empacotamento in vitro que recontitui a etrutura do fago (cabeça e cauda) e aim é uado para infectar a célula hopedeira. A enzima do itema de empacotamento do fago reconhecem o doi ítio co ituado de 35 a 49 kb de ditância e nete cao, omente fragmento deta ordem de tamanho erão convenientemente empacotado. O DNA genômico de interee é clivado com uma enzima de retrição que produz grande fragmento de DNA, o quai erão ligado ao comídeo, também clivado com a mema enzima. A ituação ideal é que cada fragmento do DNA genômico apreente um ítio co na ua extremidade. Durante o empacotamento, a enzima do itema reconhecem o ítio co ituado a uma ditância dentro de 49Kb, clivam ete ítio e empacotam eta molécula. O DNA do comídeo é injetado no interior da célula hopedeira, circulariza igual ao DNA do fago e replica como um plamídeo normal, em expreão de qualquer função do fago. A célula infectada erão elecionada com bae na reitência adquirida a um determinado antibiótico. A figura 12 ilutra um típico proceo de clonagem em comídeo. 20

21 R Amp Sítio alvo de retrição fragmento de retrição de 35 a 40 kb co eleção de clone reitente a ampicilina DNA circulariza apó infecção Figura 12. Equema de clonagem em comídeo. 4. VÍRUS A biologia molecular do víru de DNA e RNA foi extenivamente etudada ante do advento da metodologia do DNA recombinante. O víru SV40, iolado de célula tumorai de macaco, foi um do primeiro itema virai utilizado para introduzir gene em célula de mamífero. O DNA do SV40 apreenta pare de bae e pode er dividido em dua regiõe quanto a expreão gênica viral. Eta regiõe ão chamada de região precoce e região tardia. 21

22 A região precoce é exprea atravé do ciclo lítico, enquanto que a expreão do gene da região tardia ocorre omente apó o início da replicação do DNA viral. Entre eta dua regiõe itua-e a origem de replicação do DNA do víru. Um produto de expreão da região precoce é o antígeno T, o qual é reponável pela tranformação maligna de célula não permiívei (célula na quai o víru não completa a ua replicação), como também pelo início da replicação viral em célula permiívei. O produto de expreão codificado pela região tardia correpondem à proteína que formam o capídeo da partícula viral. A figura 13 ilutra o genoma do viru SV40. o Expreão precoce Expreão tardia SV40 Genoma do SV40 Figura 13. O DNA do viru SV Clonagem no víru SV40 A produção de DNA recombinante no víru SV40, pode er realizada atravé da ubtituição do egmento de expreão precoce ou do egmento de expreão tardia. No primeiro cao, o víru recombinante não produz o antígeno T, ao pao que na egunda opção não haverá produção da proteína do capídeo. Entretanto, eta funçõe deletada podem er uprimida como veremo a eguir Clonagem no SV40 pela ubtituição da região tardia Quando a região tardia do SV40 é ubtituída com outro DNA, perde-e a expreão da proteína do capídeo (funçõe tardia). Para que o itema de clonagem funcione adequadamente pode-e realizar a infecção imultânea com um outro víru SV40 que tem 22

23 uma deleção no gene da região precoce, ma a região tardia intacta. Na célula coinfectada a proteína da região precoce erão produzida pelo víru recombinante e a proteína do capídeo pelo víru deletado. Como reultado, teremo a produção de uma população de partícula virai mita, ou eja, víru deletado e víru recombinante. A figura 14 ilutra ete procedimento. O Região funcional precoce SV40 Região funcional tardia gene da globina SV40 SV40-globina cotranfecção empacotamento e lie partícula Virai Figura 14. Clonagem no SV40 pela ubtituição da região tardia 23

24 Clonagem no SV40 pela ubtituição da região precoce Quando a clonagem no SV40 é feita na região precoce, a produção de partícula virai depende do uprimento, por uma outra fonte, da proteína codificada pela região precoce (antígeno T). Para evitar uma infecção mita com um víru SV40 deletado, ua-e uma linhagem celular, a célula COS a quai, apreentam uma porção do genoma do SV40 integrado ao eu próprio cromoomo. Eta linhagem celular produz a proteína viral denominada antígeno T, a qual liga-e na origem de replicação do víru e induz a ua replicação. A figura 15 ilutra ete tipo de clonagem. Apear dete itema viral ter ido uado como vetor de expreão em muita etratégia de clonagem, exitem alguma devantagen de eu uo. Uma dela é que o gene a er clonado não pode er grande, a outra é que a célula hopedeira ó podem er célula de macaco e finalmente, o genoma da célula hopedeira pode ofrer rearranjado ou deleçõe. Atualmente, doi outro itema virai mai verátei etão em uo, ão ele o víru da vacina e o Baculovíru, o quai podem aceitar gene bem maiore do que aquele aceito pelo SV40. Um inconveniente para ete doi itema virai é que ambo apreentam um grande genoma e o gene a er clonado ó pode er inerido por proceo de recombinação dentro da célula, o qual é batante lento em relação ao proceo tradicionai em uo na metodologia do DNA recombinante. Finalmente, um itema viral batante promior ão o retrovíru que ão víru cujo material genético é o RNA e apreentam um ciclo batante diferente do mencionado anteriormente que ão ciclo lítico. O retrovíru infectam uma grande variedade de célula de mamífero e o eu RNA é trancrito reveramente para DNA o qual é incorporado ao genoma da célula hopedeira. Nete etado ele produz continuamente nova partícula virai, juntamente com o produto do gene nele clonado. Devido a ua veratilidade, o retrovíru ão atualmente o vetore eleito para uo em terapia gênica. 5. BACTERIÓFAGO M13 O bacteriófago M13 é um fago filamentoo da E. coli e contém uma única fita de DNA envolvida por proteína virai. Durante o eu ciclo, a célula hopedeira é infectada 24

25 pela fita (+) a qual ervirá como molde para a íntee da outra fita (-). A dupla fita denominada de forma replicativa, permanece no interior da célula hopedeira e é amplificada até 200 cópia por célula, quando então a fita negativa não mai e replica e a fita poitiva continua a er intetizada, adquire a proteína da cápula viral e ai da célula hopedeira atravé de proceo não lítico (Figura 16). 25

26 O Região funcional precoce SV40 Região funcional tardia gene da hemaglutinina (Ha) SV40 mutante SV40-Ha co-tranfecção SV40 mutante integrado ao genoma da célula COS antígeno T replicação empacotamento e lie Partícula Viral Figura 15. Equema de clonagem no SV40 pela ubtituição da região precoce. 26

27 E.coli + M Figura 16. Replicação do bacteriofago M Clonagem no bacteriófago M13 A grande utilidade dete itema de clonagem é a ua facilidade na produção de DNA fita imple, facilmente recuperável do obrenadante de uma cultura líquida da E.coli infectada com ete vetor. Como veremo futuramente, ete DNA fita imple é batante útil no proceo de equenciamento do DNA pelo método deenvolvido por Sanger e colaboradore (1977). Para facilitar o eu uo epecialmente em etratégia de eqüenciamento, foram deenvolvido vetore da érie M13mp, o quai contém o MSC inerido no gene que exprea a -galactoidae. Mutaçõe foram realizada de tal modo que a enzima ó é ativa quando o vetor etá na célula hopedeira, convenientemente preparada. Ete proceo denomina-e de alfacomplementação. A incluão do múltiplo ítio de clonagem no gene da galactoidade via a identificação do poívei recombinante quando na preença de um ubtrato cromogênico o X-gal ou Bluogal (5-bromo-4-cloro-indolil- -D-galactoídeo) e o indutor IPTG. Quando o vetor etá intacto (não recombinante), a enzima é funcional e frente ao ubtrato cromogênico ete é clivado produzindo placa de cor azul. Por outro lado, quando um fragmento de DNA é inerido no múltiplo itio de clonagem, a expreão da enzima é uprimida, portanto a célula ão incapaze de metabolizar o ubtrato cromogênico formando placa incolore. 27

28 5.2. Etratégia de clonagem em vetore da érie M13mp A utilização de vetore com diferente orientaçõe do múltiplo ítio de clonagem, tai como M13mp8 e o M13mp9, facilita a inerção de um fragmento de DNA em amba a orientaçõe. Como veremo adiante, eta etratégia apreenta grande aplicação no programa de equenciamento de um DNA pelo método de Sanger. A figura 17 ilutra a inerção de um fragmento de DNA clivado com a enzima Pt1 (P) e EcoRI (E) no vetore M13mp8 e M13mp9, ambo clivado com a mema enzima. Eta clonagem orientada permite a inerção do fragmento de DNA na orientação 5' 3' no vetor M13mp8 e na orientação 3' 5' no vetor M13mp9. P E 5 3 P E E P M13 mp9 M13 mp8 P E E P Figura 17. Clonagem de um fragmento de DNA no vetore M13mp8 e M13mp9 clivado com a enzima EcoRI (E) e PtI (P). 6. FAGOMÍDEOS Apear do bacteriófago M13 apreentar grande aplicabilidade epecialmente no proceo de eqüenciamento de DNA, foram deenvolvida outra geraçõe de fago, o quai reunem a vantagen do fago M13 e a do plamídeo. O primeiro foram o vetore da érie pembl e mai tarde o plamídeo ptz, pbluecript e pgem (+/-). Ete vetore ão chamado de famídeo ou fagomídeo e apreentam a eguinte caracterítica principai: 28

29 fagomídeo apreenta um verátil MSC, permitindo a clonagem de grande inerto em maiore dificuldade, além de que, a enzima ituada nete ítio foram ordenada de tal modo a permitir uma alternativa intereante durante o proceo de equenciamento. utilizando uma combinação etratégica de dua enzima de retrição, é poível criar terminaçõe 5' e 3' proeminente, tornando agora uma extremidade (a do inerto) uceptível à ação da Exonucleae III. Eta etratégia, permite a obtenção progreiva e controlada de vário fragmento deletado do inerto, o quai apó a recircularização tornam-e apropriado para o equenciamento. Ete procedimento, facilita o eqüenciamento de um grande inerto de DNA, em a neceidade de múltipla ubclonagen como é uual no itema M13 ou a íntee de vário oligonucleotídeo interno, uado como iniciadore no proceo de eqüenciamento Clonagem no fagomídeo Vamo utilizar como exemplo, o fagemídeo ZAP que é particularmente útil para clonagem de cdna. Ete vetor, incorpora a biologia do fago M13 de tal modo que um cdna clonado nete vetor pode er automaticamente exciado do fago para um fagomídeo denominado pbluecript. Baicamente, qualquer DNA clonado no MSC inativa o gene LacZ, produzindo uma proteína de fuão quando na orientação correta, podendo aim também er ratreada com anticorpo. Quando uma cepa da E.coli (F') é infectada com o fago recombinante e uperinfectada com o fago auxiliar, ee produz a proteína do itema M13. Ea proteína reconhecem o inai de iniciação e término da íntee de DNA do fago auxilar (f1) que etão flanqueando o pbluecript, que por ua vez etá incorporado no fago ZAP e carrega o inerto. Com a clivagem deta dua eqüência, o DNA é automaticamente circularizado na bactéria para originar a forma recombinante do plamídeo Bluecript SK(M13). O inerto clonado no Bluecript é flanqueado por promotore para a RNA polimerae do fago T3 e T7. Nete entido, apó o vetor er convenientemente 29

30 linearizado, cópia do RNA relativo ao inerto, podem er obtida em amba a direçõe atravé do uo da RNA polimerae T3 e T7. 7. VETORES PARA TRANSFORMAÇÃO DE LEVEDURAS O grande interee exitente no etudo da levedura Saccharomyce cereviiae e Schizoacharomyce pombe deve-e ao fato de que tratam-e de organimo eucarioto inferiore e como tai pouem organização celular imilar à de eucarioto uperiore. Além dio, muita proteína de levedura ão imilare etrutural e funcionalmente à ua homóloga em mamífero. A utilização de levedura como um modelo de etudo traz a eguinte vantagen: tempo de crecimento reduzido que permite a obtenção de grande quantidade de levedura em pouco tempo. genoma de pequeno tamanho, cerca de 200 veze menor que o genoma de mamífero, o que implifica análie moleculare e genética. poibilidade de manter a levedura como célula haplóide ou diplóide, o que permite a obtenção de mutaçõe receiva em célula haplóide, bem como a realização de experimento de complementação genética. A célula de mamífero ão diplóide o que torna impoível a detecção de mutaçõe receiva. Exitem diferente marcadore de eleção que ão utilizado em levedura. A maior parte do gene marcadore utilizado em levedura ão gene envolvido na bioíntee de aminoácido e nucleotídeo. Um do marcadore frequentemente utilizado é o gene de levedura LEU2 que codifica para uma da enzima da via de íntee da leucina, a enzima - iopropilmalato dehidrogenae. A linhagem mutante de levedura, leu2, não crece em meio de cultura que não contém leucina. Aim quando o gene LEU2 é utilizado na tranformação da linhagem leu 2, a célula deta linhagem que adquiriram o gene LEU2 erão capaze de crecer em meio de cultura deficiente no aminoácido leucina. Eta etratégia é emelhante a reitência à ampicilina adquirida por bactéria que foram tranformada com plamídeo que contém o gene que promove a reitência à ampicilina. 30

31 levedura. A tabela a eguir lita algun do marcadore de eleção comumente utilizado em GENE ENZIMA SELEÇÃO HIS3 Imidazol glicerolfofato deidratae Hitidina LEU2 -Iopropilmalato deidrogenae Leucina LYS2 -Aminoadipato redutae Liina TRP1 N-(5'-foforiboil)- antranilato iomerae Triptofano URA3 Orotidina-5'fofato decarboxilae Uracil Tabela 2. Gene marcadore de eleção em levedura. O meio de cultura utilizado em geral contém todo o aminoácido neceário à manutenção da levedura com exceção de um. Aim, por exemplo, célula tranformada com o gene HIS 3 ão elecionada em meio de cultura deficiente em hitidina. O vetore utilizado na tranformação de levedura ão capaze de e propagar tanto em E. coli quanto em levedura. A manipulação dete vetore (clonagem, mutagênee, eqüenciamento, etc) é realizada em bactéria como para qualquer plamídeo convencional e então o memo é tranferido para levedura, organimo onde o enaio de interee ão realizado. Tai vetore ão denominado vetore do tipo ponte ( huttle vector ) e contêm entre outro elemento origen de replicação de bactéria e levedura bem como gene marcadore que funcionam para a eleção no doi organimo. Diferente tipo de vetore ão utilizado na tranformação de levedura: Vetore de integração: tai vetore contêm origem de replicação de bactéria e gene marcadore para eleção em bactéria e levedura. Nete cao o plamídeo não é capaz de replicar de modo autônomo na levedura. O modo pelo qual ete tipo de vetor é propagado e é capaz de exprear o marcador de eleção é atravé da integração em um do cromoomo de levedura. Vetore que replicam em levedura: tai vetore também contém origem de replicação de bactéria e gene marcadore para eleção em bactéria e levedura. Doi tipo de origen de replicação de levedura ão empregada nete plamídeo. O primeiro tipo conite na origem de replicação do plamídeo de 2 m, que é de ocorrência natural em levedura. O egundo conite de origen de replicação iolada de DNA cromoomal denominada ARS (Autonomouly Replicating Sequence, equência de replicação autônoma). Plamídeo contendo a origem de replicação do plamídeo de 2 m ou equência tipo ARS replicam em 31

32 múltipla cópia em levedura (Figura 18). Uma variante dete tipo de vetor inclui, além da equência ARS, uma equência tipo centromérica, denominada CEN, que garante que a replicação dete plamídeo eja etável, ocorrendo uma única vez por ciclo celular e que ele ejam egregado de modo precio durante a mitoe e meioe. Vetore contendo equência tipo CEN ão mantido em cópia única na levedura (Figura 18). YAC: (Yeat Artificial Chromoome, cromoomo artificial de levedura) ão uma variação de um vetor de cópia única, que contêm equência centromérica (CEN) e equência telomérica, que ão equência da extremidade do cromoomo. A preença de equência telomérica nete vetore permite que ejam replicado como molécula lineare, com comportamento emelhante ao do DNA cromoomal. YAC não ão utilizado de rotina em experimento de clonagem, entretanto, têm e motrado uma ferramenta valioa na caracterização de grande egmento genômico na medida em que é poível clonar em um YAC fragmento que vão de 100 a 2000 kb (Figura 19). LEU2 LEU2 ARS ARS Puc118 Multicópia Puc118 Cópia única CEN DNA Levedura DNA Levedura Figura 18. Vetore de levedura. Contêm equência de plamídeo (aqui de puc118) que permitem a propagação e dão reitência a ampicilina em E.coli, o gene de eleção em levedura (nete cao LEU 2) e ítio único de retrição. Vetore multicópia: Ete plamídeo exitem na forma circular na levedura. Algun dete vetore empregam a origem de replicação do plamídeo de 2 m, outro utilizam origen de replicação iolada de cromoomo que ão denominada ARS. 2 m e ARS permitem a replicação do plamídio em múltipla cópia. Vetore cópia única: Vetore que contém origen de replicação tipo ARS podem er mantido etavelmente atravé da adição de equência centromérica, CEN. A exitência de equência tipo CEN aegura que o plamídeo eja mantido em 1 ou 2 cópia na levedura e egregado de modo precio durante a divião celular. GLOSSÁRIO - ARS: (autonomou replication equence, equência de replicação autônoma). Sequência que funciona como uma origem de replicação em cromoomo de levedura. - BAC: (bacterial artificial chromoome, cromoomo artificial de bactéria). Vetor utilizado na clonagem de DNA genômico, baeado no fator F de plamídeo que aegura que o plamídeo eja mantido em pequeno número de cópia na bactéria. 32

33 - Centrômero: região do cromoomo que apreenta uma contricção e à qual liga-e o fuo mitótico durante a meioe ou mitoe. É neceária para a manutênção da etabilidade e egregação correta do cromoomo durante a divião celular. - Origem de replicação: região onde é iniciada a íntee de DNA em um dado fragmento de DNA. - Telômero: extremidade do cromoomo que contém equência repetitiva de DNA intetizada pela enzima telomerae e importante na manutenção da integridade cromoomal. - YAC: (yeat artificial chromoome, cromoomo artificial de levedura). Sitema de clonagem em levedura que conite de um vetor linear que tem capacidade de replicação autônoma e que contém um centromêro de levedura e dua equência telomérica em ua extremidade. ARS1 TRP1 CEN4 EcoRI YAC URA3 R Amp +EL BamHI +EL Figura 19. YAC: Contêm um centrômero, doi telômero, gene() marcadore para eleção em levedura e uma eqüência tipo ARS. Devido à preença deta eqüência o YAC ão replicado como pequeno cromoomo lineare na levedura. III. CONSTRUÇÃO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE A obtenção de uma molécula de DNA recombinante, atravé da ligação de um fragmento de DNA de interee com o DNA de um vetor, é um proceo direto e relativamente imple. Entretanto, problema epeciai urgem quando o fragmento de interee contitui uma fração pequena do DNA total. Ete é o cao encontrado comumente quando o objetivo é o iolamento de gene preente em uma única cópia num genoma complexo, ou quando o objetivo é o iolamento de clone portadore do DNA complementar 33

34 à RNA menageiro raro. Dete modo, é claro que quando queremo clonar um determinado gene ou o DNA complementar da menagem ou menagen por ele codificado() é neceário à obtenção de coleçõe de clone recombinante, portadore de molécula repreentante de todo o genoma, ou de coleçõe de clone de cdna derivado de toda a população de menageiro da célula ou tecido de interee. Ea coleçõe de clone de DNA recombinante ão chamada de biblioteca: Biblioteca Genômica, no cao do clone terem ido obtido a partir do DNA genômico ou Biblioteca de cdna, no cao do clone terem ido contruído a partir de DNA complementar. O DNA de organimo uperiore é batante complexo: por exemplo, o genoma haplóide de mamífero é compoto de aproximadamente 3x109 pare de bae (pb). Portanto, e o fragmento de interee tiver 3000 pb, ele compreenderá omente 1 parte em 106 de uma preparação do DNA total. De modo imilar, uma epécie de RNAm particularmente rara pode compreender omente 1 parte em 105 ou 106 da fração de RNA menageiro de uma célula. Dete modo, para que eja garantida a preença na biblioteca de pelo meno uma verão de toda a eqüência da população alvo, um do ponto principai na contrução de biblioteca útei é a obtenção de grande quantidade de clone. Embora a olução dete problema envolva etratégia epecífica no preparo do DNA alvo e na ecolha do vetor de clonagem, em linha gerai a contrução de biblioteca genômica e de cdna egue um procedimento báico batante emelhante. No doi cao, o DNA genômico ou o cdna ão preparado para a inerção no vetor ecolhido. O vetor e o DNA alvo ão ligado e introduzido em E. coli atravé de infecção ou em algun cao, por tranformação direta (Figura 20). 1. BIBLIOTECA DE cdna A decoberta da enzima trancriptae revera, uma DNA polimerae dependente de RNA encontrada predominantemente em víru de RNA de tumor, tornou poível a íntee in vitro de DNA uando-e como molde RNAm. O DNA produto dea reação é o DNA complementar ou cópia da menagem, abreviadamente chamado de cdna. A íntee e poível clonagem de cdna contribuíram para grande avanço na análie da etrutura e expreão de gene de eucarioto e propiciaram uma revolução tecnológica na indútria farmacêutica e de alimento. Ee clone ão comumente iolado de biblioteca de cdna, 34

35 contruída a partir da população de RNAm iolada da célula ou do tecido de interee. Portanto, em comparação com biblioteca do genoma total ea biblioteca ão enriquecida com eqüência gênica. Uma vez que o cdna é cópia da menagem, ele não contém intron e apreenta ignificativamente pouca eqüência que não codificam para proteína (Figura 21). A auência de intron permite que cdna relativo a célula de eucarioto uperiore ejam diretamente trancrito e traduzido em bactéria e em outro microorganimo, permitindo aim a produção em grande ecala de polipeptídio importante tanto na área de pequia como na área aplicada. A auência de intron também facilita a determinação direta da eqüência da menagem e ubeqüente dedução da eqüência de aminoácido da proteína por ela codificada. Io tem reultado na identificação da eqüência de uma enorme quantidade de proteína, alguma veze memo ante de terem ido identificada genética ou bioquimicamente. Tecido Ecolha do Vetor mrna DNA Digerir o DNA, Parcial ou completamente cdna Fra cionar por tamanho DNA clonável Ligar DNA a um vetor Introduzir o produto da ligação em E.coli Titulação e caracte rização da Bibliote ca Figura 20. Pao envolvido na contrução de Biblioteca de cdna e Biblioteca genômica. 35

36 Figura 21. Diagrama repreentando de forma implificada a diferença entre um fragmento de DNA genômico e do cdna relativo a ele. De modo reumido, o procedimento para a íntee, clonagem e iolamento de cdna epecífico envolve 4 etapa: 1) Síntee in vitro de cdna de fita dupla a partir de RNA menageiro iolado do tecido de interee. 2) Preparo do cdna para a ligação com o vetor ecolhido. 3) Introdução do cdna recombinante na célula hopedeira, onde erão replicado. Ito reultará na amplificação do recombinante e dependendo do vetor utilizado, na expreão da proteína codificada pela menagen que deram origem ao cdna. 4) Identificação do clone de interee atravé de um proceo de triagem do clone recombinante Síntee de cdna de fita dupla A contrução de uma biblioteca de cdna inicia-e com o iolamento do RNA total do tecido e ubeqüente eleção da fração de RNA poli(a)+, que compreende a maioria da menagen preente na célula. O iolamento de RNA poli(a)+ de boa qualidade é eencial, 36

37 uma vez que qualquer degradação do RNAm afetará a repreentatividade da eqüência na biblioteca. Uma vez obtida a fração de RNA poli(a)+, procede-e à íntee do cdna atravé de uma érie de reaçõe enzimática (Figura 22). No último dez ano foram decrito vário método para íntee de cdna, cada um apreentando vantagen e devantagen particulare. Como exemplo, apreentamo a eguir um procedimento amplamente uado para ee fim: a) Síntee da fita de DNA complementar ao RNAm (cdna) atravé da enzima trancriptae revera. Ea enzima é capaz de cataliar in vitro a polimerização de DNA a partir RNA e requer um "primer" com a extremidade 3'OH livre para iniciar a íntee. Na maioria da veze, a molécula utilizada como "primer" é um oligo (dt), que e anela na cauda poli (A)+ do RNA. b) Apó a íntee dea fita de cdna, o RNAm é parcialmente removido, pelo uo da RNae A para cortar pedaço do RNA da molécula híbrida RNA-DNA. c) Utilizando como "primer" o fragmento de RNA não digerido pela RNaeA, a DNA polimerae de E. coli ubtitui eficientemente o RNA por DNA, reultando em uma molécula de cdna de fita dupla. d) O cdna fita dupla é tratado com T4 polimerae. Atravé da atividade 3'-5' exonucleáica dea enzima remove-e poívei nucleotídeo extra na extremidade 3'. e) O produto final dee conjunto de reaçõe é uma molécula de DNA de fita dupla, cópia exata da menagem Preparo do cdna para a ligação com o vetor Uma vez obtido o cdna, o próximo pao é prepará-lo para a inerção em um vetor de clonagem (Figura. 22). Para io também exitem vário método diponívei, que diferem entre i dependendo do tipo de vetor ecolhido: plamídio ou fago. O fago tem ido o vetor de ecolha para a contrução de biblioteca de cdna. A razão báica deta preferência é a eficiência. Em comparação com plamídio, o fago requer cerca de 16 veze meno cdna por g do vetor para produzir número equivalente de clone recombinante. Além dio, biblioteca em fago ão mai fácei de erem manipulada do 37

38 que biblioteca em plamídio. Entretanto, uma devantagem do vetore é que não ão favorávei para procedimento de eqüenciamento do DNA e de mutagênee dirigida. Mai recentemente, outro tipo de vetor foi idealizado para uprir ea deficiência. Ea clae de vetore compreende o fagemídio que, como o próprio nome ugere, ão plamídio contendo porçõe do genoma de fago e que reúnem vantagen dee doi vetore. Figura 22. Síntee de cdna fita dupla. Para dar uma noção do pao implicado na clonagem do cdna relatamo a eguir um procedimento adotado para a clonagem de cdna em fago. metilação do ítio de EcoRI atravé do tratamento do cdna com EcoRI, na preença de S-adenoil metionina. Ee pao é eencial para proteger o ítio EcoRI que poam exitir no cdna contra a ação da EcoRI em digetão a er realizada ubeqüentemente no proceo de clonagem. 38

39 adição de adaptadore, com o ítio EcoRI, na dua extremidade do cdna. Ea reação reulta em molécula de cdna com adaptadore múltiplo ligado na dua ponta (ver figura 23). um único ítio de EcoRI é produzido em cada ponta do cdna pela digetão com EcoRI, liberando o exceo de adaptadore ligado na molécula. A metilação prévia do cdna garante que não haja digetão interna do cdna. ante de er inerido no vetor, o cdna é eparado do exceo de molécula de adaptadore. Io é feito atravé de filtração em coluna de Sephadex. a molécula de cdna ão ligada ao vetor, atravé de reação com T4 ligae. o produto da ligação é empacotado com a proteína formadora do capídeo do fago. o fago obtido ão utilizado para infectar bactéria de linhagem que favorece o crecimento do recombinante. apó a infecção da bactéria com o cdna recombinante temo como produto uma biblioteca de cdna, que deve conter cópia de toda a eqüência de RNAm da população original. Ea biblioteca pode er etocada na geladeira, ou ubmetida a uma triagem em buca do clone de interee. 2. BIBLIOTECA GENÔMICA Para e obter informaçõe obre a etrutura molecular de um gene de eucarioto é neceário o iolamento da porção do DNA genômico que contenha toda a unidade de trancrição, mai a regiõe flanqueadora onde e localizam o elemento controladore da expreão dee gene. O modo mai eficiente para e coneguir iolar ea porção do DNA é atravé do uo de uma biblioteca genômica, que deve conter clone portando fragmento de DNA repreentante de todo o genoma do organimo em quetão. Dete modo, o apecto principal coniderado na contrução de uma biblioteca genômica etá na obtenção de um número grande de clone portando fragmento do genoma, obtido aleatoriamente. O tamanho neceário de uma biblioteca genômica, para que um dado fragmento de interee eteja entre o fragmento clonado, é determinado pelo tamanho do fragmento clonado e 39

40 pelo tamanho do genoma. Dete modo, a etratégia báica na contrução de biblioteca genômica buca minimizar o número de clone neceário atravé da clonagem de fragmento de DNA de maior tamanho poível, e maximizar a eficiência da clonagem, atravé da utilização de vetore baeado no fago. Baicamente, a contrução da biblioteca genômica envolve o eguinte pao: a) iolamento de DNA de alto peo molecular, que é poteriormente quebrado de modo a produzir fragmento de tamanho compatível com o vetor de clonagem. b) ligação dee fragmento no vetor e introdução do recombinante obtido na célula hopedeira Me Me Metilação do cdna para proteger o ítio interno de Eco RI Ligação do adaptadore EcoRI com o cdna Digetão com EcoRI para gerar ítio coeivo EcoRI Separação do cdna do exceo de adaptadore cdna purificado Ligação do cdna do braço do fago lambda Empacotamento do recombinante com a proteína formadora da partícula viral Infecção da bactéria hopedeira o fago recombinante Plaqueamento do recombinante Figura 23. Clonagem de cdna em fago 40

41 Dentre ee pao, o modo de preparo do fragmento a erem clonado (inerto) merece er dicutido criticamente dada ua importância na repreentatividade da biblioteca. 41

42 2.1. Preparo do DNA do inerto A repreentatividade de uma biblioteca genômica depende grandemente da aleatoriedade com que o fragmento a erem clonado ão gerado, para que não haja excluão itemática de nenhuma eqüência. O fracionamento mecânico do DNA é o meio de e obter completa aleatoriedade na fragmentação do DNA. Entretanto, ee método não é comumente adotado devido à trabalhoa manipulação neceária para que o fragmento aim obtido poam er inerido no vetor. Com bom eno e cuidado é poível coneguir fragmentação uficientemente aleatória atravé de digetõe parciai do DNA com enzima de retrição. Uma vantagem em e utilizar a digetão parcial do DNA é a produção de fragmento com ponta coeiva e que, portanto, podem er diretamente ligado ao vetor. Para garantir que a digetão atinja todo o genoma ão utilizada enzima de retrição que cortam freqüentemente o DNA e que não apreentam devio de ditribuição de ítio. A enzima Sau3A I, que reconhece o ítio de 4 bae GATC, e que gera fragmento compatívei com ítio de clonagem de vário fago e comídio, tem provado er batante útil na produção de biblioteca de DNA genômico digerido parcialmente. Apó a digetão parcial, o fragmento gerado preciam er fracionado ante de erem ligado ao vetor. Sem ee fracionamento, fragmento pequeno poderão ligar-e entre i produzindo falo recombinante. Fragmento muito grande que não permitem o crecimento do fago poderão ligar-e ao braço do fago, alterando a relação entre a quantidade de DNA de inerto e vetor. Um método de fracionamento freqüentemente adotado é o de centrifugação em gradiente de acaroe. Apó a digetão parcial, a olução de DNA é aquecida para que poívei fragmento agregado e diociem, e então, é aplicada obre um gradiente de acaroe de alta alinidade. Apó a centrifugação, ão coletada fraçõe dee gradiente. Ea fraçõe ão analiada por eletroforee em um gel de agaroe. A fraçõe contendo o fragmento de DNA de tamanho apropriado ão utilizada para a ligação com o vetor. A figura abaixo ilutra ee procedimento. 42

43 Tubocapilar Tubodeplático Bomba Gradientede Tubo decoleta acaroe Figura 24. Método para fracionamento do DNA por centrifugação em gradiente de acaroe. O gradiente é apirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peritáltica. A porção mai dena do gradiente contendo o DNA de maior peo molecular, é apirada primeiro. Uma vez garantida a aleatoriedade do fragmento clonado, é batante razoável e penar que a probabilidade de uma dada eqüência de interee etar preente em uma biblioteca genômica poa er etimada etatiticamente, com bae na ditribuição de Poion. Epecificamente, o número de clone independente (N) que preciam er triado para uma probabilidade (P) de e iolar uma eqüência epecífica é dada por: N = ln(1-p)/ ln[1-(i/g)] onde I é o tamanho médio do fragmento clonado, em pare de bae, e G é o tamanho do genoma, em pare de bae. Dete modo, preciamo triar cerca de clone de uma biblioteca que ua como vetor um fago, para termo 99% de chance de iolar qualquer dada eqüência preente em uma única cópia em um genoma típico de mamífero. N = ln(1-0,99)/ln[1- (2x104/3x109)]= Vetore utilizado na contrução biblioteca genômica Fago e comídeo ão comumente uado na contrução de biblioteca genômica. No doi cao, fragmento grande de DNA gerado por fragmentação aleatória ão ligado com o DNA do vetor para formar concatâmero que podem então er empacotado em 43

44 partícula de fago. A biblioteca contruída em vetore ão armazenada e propagada na forma de fago recombinante. No cao de clonagem em comídio, entretanto, ea partícula virai ervem meramente como veículo para introduzir o DNA recombinante dentro da bactéria. Uma vez dentro da bactéria o comídio e comporta como um plamídio grande. O comídio podem aceitar inerto de aproximadamente 45kb, quae dua veze o tamanho do inerto clonávei em fago. Dete modo, uando-e o comídio como vetor, é neceário gerar omente recombinante para atingir 99% de probabilidade de uma eqüência de cópia única etar repreentada em uma biblioteca genômica de mamífero. Entretanto, biblioteca em comídio ão mai difícei de e contruir e manter do que a biblioteca de fago. Comídio ão então uado quando o gene de interee é muito grande ou quando uma região extena do DNA cromoomal é deejada. No cao de iolamento rotineiro de egmento de gene ou em circuntância onde a biblioteca erá uada muita veze, o uo de vetore é mai recomendado. Na figura abaixo apreentamo um diagrama da etrutura de um vetor tipo, batante utilizado na contrução de biblioteca genômica. 5' co 3' B B SE ES BE Fragmentocentral BD 3' co 5' BE=braçoequerdo BD=braçodireito Figura 25. Etrutura do vetor EMBL3. BE=braço equerdo; BD=braço direito; tuffer= fragmento central; S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI. Conforme indicado no diagrama ete vetor apreenta um fragmento central flanqueado por doi fragmento eenciai (direito e equerdo). O fragmento à equerda, chamado de braço equerdo, codifica para a proteína do capídeo e o fragmento à direita, chamado de braço direito, contém a origem de replicação do fago e promotore de outro gene eenciai. Entre o fragmento central e o doi braço encontram-e o ítio de retrição utilizado na clonagem - SalI, BamHI, EcoRI - em orientação invera. 44

45 Como todo fago, a extremidade de cada braço apreenta um egmento de fita imple (co). Ee egmento ão complementare entre i e permitem a recircularização da molécula, e a coneqüente replicação do DNA do fago dentro da célula hopedeira. Ee tipo de vetor é chamado de vetor de ubtituição por que no proceo de clonagem a parte central do DNA do fago é ubtituída pelo fragmento de DNA a er clonado, originando a molécula recombinante. Mai recentemente outro vetore com capacidade para grande inerto foram deenvolvido. O cromoomo artificiai de levedura (YAC) ão molécula lineare de DNA cuja arquitetura mimetiza a etrutura de um cromoomo autêntico (Figura 26). O YAC recombinante ão criado pela ligação de fragmento grande de DNA genômico exógeno (até 2000 kb) com o doi "braço" do vetor YAC e o produto da ligação é introduzido na levedura por tranformação. No YAC recombinante, o egmento de DNA genômico exógeno é flanqueado de um lado por um centrômero, uma origem de replicação e uma marca de eleção e pelo outro lado, por uma egunda marca de eleção. A levedura tranformante com cromoomo artificial ão elecionada como colônia em meio com a droga de eleção. O cromoomo artificiai de bactéria (BAC) ão molécula de DNA circulare que carregam uma marca de eleção a antibiótico. O egmento de DNA genômico exógeno ão clonado no vetor BAC in vitro e o produto da reação de ligação é introduzido por eletroporação em cepa de E. coli, onde é mantido como um plamídio de cópia única. O vetore BAC carregam marcadore que permitem a dicriminação do clone vazio e cheio. A média de tamanho do clone de BAC é 120 kb, ma algun clone podem chegar 300kb. O vetore de bacteriófago P1 acomodam fragmento genômico de 70 a 100Kb. Nete itema, a molécula lineare recombinante gerada a partir de eqüência do vetor e do genoma ão empacotada in vitro em bacteriófago P1. Apó a injeção em E. coli, a molécula e tornam circulare pela atividade de uma recombinae, que promove a recombinação de eqüência epecífica preente no vetor. Ete vetore carregam marca de eleção para antibiótico, marca de eleção poitiva para eleção do clone com inerto de DNA genômico exógeno e uma origem de replicação plamídial P1, que mantém uma ou 45

46 dua cópia do plamídio recombinante na célula. Uma egunda origem de replicação pode er ativada para amplificação do plamídio ante do iolamento do DNA. Figura 26. Contruindo um cromoomo artificial de levedura (YAC). O vetor YAC carrega uma origem de replicação (ORI), um centrômero (CEN), doi telômero e marca de eleção (X e Y). Lehninger, Principle of Biochemitry. Figura 29-16, p O cromoomo artificiai P1 combinam a caracterítica do bacteriófago P1 e do BAC, incluindo a marca de eleção poitiva e a origen de replicação do bacteriófago P1. O clone circulare recombinante de PAC gerado durante a reação de ligação in vitro ão introduzido em E.coli por eletroporação e mantido como um plamídio de cópia única na célula. O inerto da biblioteca de DNA do genoma humano em PAC variam de 60kb a 150kb. IV. DETECÇÃO E ANÁLISE DO CLONE RECOMBINANTE 46

47 Um pao crucial na Tecnologia do DNA recombinante é encontrar o clone correto na mitura de clone que foi criada durante o procedimento da confecção da biblioteca genômica ou de cdna. Embora eja relativamente fácil elecionar a colônia que abrigam o vetore de clonagem uando o marcadore de reitência a antibiótico que etão preente no vetore (Figura 27A), é muito mai difícil elecionar o clone que contenha o gene de interee. Note que no cao do vetor er um plamídio deverão er examinada milhare de colônia de bactéria crecida em placa de petri contendo agar, para a detecção daquela() colônia() que produza(m) pequena quantidade da proteína exprea pelo gene de interee ou então que poua(m) o gene de interee em qualquer expreão protéica que o caracterize (Figura 27B). Será dicutida inicialmente a ituação na qual a proteína é exprea no hopedeiro. Em eguida erá dicutida a ituação mai comum onde a proteína não é exprea e a análie erá feita atravé da própria preença do DNA de interee no fago ou na bactéria. 1. QUANDO O GENE DE INTERESSE É EXPRESSO NO HOSPEDEIRO Se o gene de interee é capaz de e exprear na célula hopedeira pode-e identificar o clone que carrega ete gene pela preença deta proteína entre a colônia recombinante. Para ito, o hopedeiro não deve produzir eta proteína, a meno que ele carregue o clone que a produza. Se eta proteína for produzida normalmente pela célula hopedeira, erá então neceário o uo de uma célula hopedeira defectiva ou mutante para o gene de interee. Quando ete gene for incorporado ele pode er detectado por complementação daquela função. Se a proteína a er detectada for epecífica de mamífero, por exemplo, a célula hopedeira já erá naturalmente defectiva. Se a proteína for uma enzima que catalia uma reação menurável pode er poível triar a colônia por ua atividade enzimática. Se a proteína de interee não for uma enzima com função detectável, uma outra etratégia erá neceária para a identificação do clone correto, como por exemplo, o uo de um anticorpo epecífico para a proteína de interee. Anticorpo é uma proteína do oro produzida pelo mamífero que e combina com alta epecificidade com outra proteína, o antígeno. Nete cao, a proteína de interee é o antígeno. Como o anticorpo e combina epecificamente com o antígeno, e o antígeno etiver preente em uma ou mai colônia de 47

48 uma placa de petri, a identificação deta colônia poderá er feita obervando-e a reação antígeno-anticorpo. Figura 27. Em A, etrutura do plamídio pbr322, um típico vetor de clonagem. Em B, método da inativação inercional para iolar plamídio contendo DNA exógeno. A inerção do DNA exógeno no plamídio pbr322 caua inativação da reitência à tetraciclina, permitindo o iolamento de tranformante contendo o fragmento de DNA clonado (B). Lehninger, Principle of Biochemitry. Figura 29-6, p Para que o antígeno eja produzido na célula hopedeira a biblioteca de cdna terá de er contruída num vetor de expreão. Nete cao o cdna ão inerido nete vetore em regiõe que promovam ua expreão em E.coli, normalmente em promotore que poam er regulado. Eta proteína antigênica erá exprea como uma proteína de fuão, ou eja, erá intetizada ubeqüente a algun aminoácido pertencente à proteína do vetor 48

49 bacteriano. Eta proteína de fuão ão geralmente mai etávei que a correpondente proteína de eucarioto produzida em bactéria e, portanto podem er obtida em grande quantidade. Para viualizar a produção deta proteína, uma parte do fago de cada placa de lie (ou bactéria) recombinante deenvolvido numa placa de Petri ão tranferido (como um carimbo) para uma membrana de nitroceluloe, tratado para expor ua proteína e então ubmetido a uma olução contendo um anticorpo epecífico para a proteína deejada. Depoi que o anticorpo livre ão removido, um egundo anticorpo é adicionado para localizar a poição do primeiro. O egundo anticorpo é normalmente radioativo e pode er identificado por autoradiografia utilizando-e um filme de raio X. Se uma colônia radioativa etiver preente, uma mancha no filme de raio-x erá obervada depoi que o filme for revelado (Figura 28). A localização deta mancha no filme correponde à localização da colônia que produziu aquela proteína, na placa de petri original. Eta colônia erá então recuperada da placa original e cultivada. Uma limitação dete procedimento é que o anticorpo utilizado neta triagem precia er epecífico para a proteína de interee. A produção de anticorpo pode er obtida pela injeção da proteína (antígeno) em um animal. No entanto, eta proteína injetada deve er pura, cao contrário mai que um anticorpo erá formado. 2. O USO DE SONDAS MOLECULARES DE ÁCIDOS NUCLÉICOS PARA IDENTIFICAR O GENE DE INTERESSE Como pode er detectado um gene de interee entre a colônia da biblioteca genômica ou de cdna, e ete gene não é expreo? Quando o DNA em olução aquoa é aquecido à 100 C, ou expoto à ph alto, a bae complementare que normalmente eguram a dupla hélice junta ão diociada em dua fita imple. Ete proceo é chamado de denaturação. Eta mema fita imple poderão e reaociar e forem conervada à 65 C, por longo período, num proceo chamado de renaturação (ou hibridação, quando a aociação ocorre entre ácido nucléico de diferente origen). Reaçõe de hibridação ocorrem entre quaiquer dua cadeia de ácido nucléico de fita imple (DNA:DNA, RNA:DNA ou RNA:RNA) dede que tenham eqüência de nucleotídeo complementare. 49

50 P r o m o t o r E c o R I la c g f ll - G a la c t o id a e E c o R I E c o R I " li n k e r " c D N A E c o R I E c o R I P r o t e in a d e F u ã o E m p a c o t a m e n t o d o f a g o in v it r o e p la q u e a m e n t o e m c a m a d a b a c t e r ia n a M e m b r a n a d e n it r o c e lu lo e P l a c a d e li e N it r o c e lu lo e o b r e a p la c a d e l i e R e m o ç ã o d a m e m b r a n a P r o t e í n a e l ig a m a n i t r o c e lu lo e F i lm e d e r a io - X a n t i c o r p o e c u n d á r io I n c u b a m e m b r a n a c o m a n t i c o r p o p r im á r io L a v a m e m b r a n a I n c u b a m e m b r a n a c o m a n t i c o r p o e c u n d á r io a n t i c o r p o p r im á r io Figura 28. Triagem de biblioteca de expreão com anticorpo. Se o inerto etiver na orientação correta e na apropriada eqüência aberta de leitura é traduzido em proteína de fuão (antígeno). O anticorpo identificam a placa de lie epecífica dete antígeno. 50

51 Ete princípio da hibridação molecular é fundamental para caracterizar DNA recombinante quando o gene de interee não é expreo. Sonda de ácido nucléico (fragmento de ácido nucléico marcado radioativamente, geralmente com 32 P) ão utilizada para localizar clone, numa biblioteca genômica ou de cdna, que carreguem uma eqüência de DNA de interee. Apó a confecção da biblioteca genômica (ou de cdna) o fago carregando DNA recombinante ão epalhado juntamente com uma upenão de bactéria numa placa de petri contendo meio de cultura ólido. Uma vez viualizada a placa de lie (ou a colônia, no cao do vetor er um plamídio) é preparada uma réplica de cada placa de petri com uma membrana de náilon ou de nitroceluloe. Ete proceo permite a tranferência de uma porção de fago de cada placa de lie (ou de bactéria de cada colônia) para a membrana, de tal maneira que o padrão da placa de lie da placa de petri original eja mantido na membrana. Para identificar qual da placa de lie porta o gene de interee eta membrana é tratada para expor e denaturar o DNA da colônia ali preente e incubado com uma olução de DNA ou RNA fita imple, marcada radioativamente e complementar ao gene de interee para permitir a hibridação. Doi polinucleotídio imple fita omente irão e hibridar e forem complementare. A localização da placa de lie que e hibridou à onda é determinada apó a expoição da membrana a um filme de Raio-X (autoradiografia) e a comparação dete filme com a dipoição da colônia na placa de petri original (Figura 29). Eta onda molecular radioativa pode er parte de um gene já clonado para o qual e procura o gene total, pode er o DNA de um gene vizinho ao gene de interee, pode er o RNA de gene que ão expreo em tecido epecífico ou em etágio epecífico do ciclo celular, ou memo o gene de uma outra epécie que codifica para a mema proteína. Nete último cao, a reação de hibridação pode er realizada em baixa temperatura (42 0 C ao invé de 65 0 C) e em baixa concentração de al (baixa etringência) para permitir a hibridação memo entre DNA que tenham alguma bae não complementare. 51

52 M e m b r a n a d e n it r o c e lu lo e P la c a d e li e F a g o a b o r v e m a n it r o c e lu lo e P la c a m e t r a S o n d a d e á c id o n u c le ic o m a r c a d a c o m 3 2 p M e m b r a n a r é p lic a S o n d a H ib r id iz a D N A lig a d o a o f ilt r o L a v a g e m d a o n d a n ã o in c o r p o r a d a S o n d a h ib r id iz a a o D N A d o f a g o q u e c o n t e m a e q u ê n c ia c o m p le m e n t a r F ilm e d e r a io - X D N A la m b d a i o la d o d a p la c a d e li e D N A c lo n a d o P la c a m e t r a C lo n e la m b d a p u r if ic a d o Figura 29. Triagem de uma biblioteca genômica ou de cdna, contruída no fago, com uma onda molecular para encontrar um clone de interee. Eta triagem é feita epalhando-e o fago previamente incubado numa cultura de bactéria, em vária placa de agar. Depoi que a placa de lie tornam-e viívei, ão feita a réplica em membrana de nitroceluloe, eu DNA é expoto e hibridizado com a onda molecular. A poição do clone recombinante de interee é identificada atravé de autoradiografia. O DNA é iolado do fago preente na placa de lie poitiva, identificada na placa de petri original e ubmetida a análie poteriore. 52

53 Gene que repondem a um memo mecanimo de regulação podem er identificado numa biblioteca de cdna por hibridação diferencial. Ito é, gene expreo em tecido epecífico, em etágio epecífico do deenvolvimento ou do ciclo celular e gene regulado por fatore de crecimento ão adequado para erem analiado por ete tipo de abordagem. Para eta identificação é neceário produzir dua populaçõe celulare (ou extrair mrna de doi diferente tecido) uma na qual ele não e expream e outra na qual ele e expream. Suponha por exemplo, que uma biblioteca de cdna eja preparada uando o mrna iolado de célula tratada com fatore de crecimento. Eta biblioteca é plaqueada e tranferida para doi conjunto de membrana de nitroceluloe. Um conjunto é enaiado com DNA marcado radioativamente preparado por trancrição revera do RNA da célula tratada com o fatore de crecimento. O outro conjunto de filtro é hibridado com cdna preparado de célula não tratada. Clone poitivo identificado por hibridizar mai fortemente com a primeira onda codificam mrna induzívei pelo fatore de crecimento (Figura 30). Quando o DNA a er clonado exprea uma proteína cuja eqüência é conhecida pode-e inferir a eqüência de um trecho de DNA que lhe deu origem e intetizar oligonucleotídeo que lhe ejam complementare para erem utilizado como onda moleculare. Ete nucleotídeo devem ter pelo meno 17 a 20 nucleotídeo de comprimento para er epecífico para a eqüência procurada. Um problema enfrentado para intetizar ete oligonucleotídeo é a degenerecência do código genético. Algun aminoácido ão codificado por quatro ou memo ei diferente códon e, portanto memo um pequeno polipeptídio pode ter ido codificado por vária eqüência de DNA. Para contornar ete problema a onda oligonucleotídica ão alguma veze intetizada como uma mitura de toda a poívei combinaçõe do códon que ão traduzida naquela eqüência protéica (Figura 31). Uma deta eqüência é correta e irá hibridar com o clone de interee, ma a poível hibridação do outro oligonucleotídeo com eqüência em interee pode levar a obtenção de clone falo poitivo. Uma variação dete método é utilizar o menor número poível de oligonucleotídeo como onda, ecolhendo a região da proteína que contém o menor número poível de códon degenerado (por exemplo, metionina é omente codificada pelo códon AUG). 53

54 Deve-e levar em conta também qual é o códon de uo mai freqüente para cada aminoácido, na epécie que etá endo analiada. Célula com fatore de crecimento Célula Quiecente Crece em 3 h Iola o mrna poli(a) Iola o mrna poli(a) AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA mrna induzido pelo fatore de crecimento AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA Oligo(dt) Trancritae Revera 32p-dNTPA hibridação Prepara bibliotéca de cdna com fago lambda e infecta Ecoli Oligo(dt) Trancritae Revera 32p-dNTPA hibridação Placa metra Réplica em membrana de nitroceluloe cdna comum Autoradiográfia Clone de cdna induível por fatore de crecimento Hibridação negligenciavel Iola o clone do fago Autoradiográfia Filme de raio-x Filme de raio-x Placa metra Figura 30. Clonagem de gene regulado por fatore de crecimento atravé de hibridação diferencial. Eta etratégia é utilizada para clonar uma família de gene que ão induzida quando célula quiecente ão etimulada a crecer pela adição do fatore de crecimento. 54

55 C y-m et-a p-g lu-m et-ly-a rg-a n-ile S equência P arcial de A m inoácido A T C A A A C TG -ATG-GA -GA -ATG-AA -AG -AA -ATT C T G G G T C P arte da equência com pouca am bigüidade CG A C G T S equência P oívei do D NA S onda contendo toda a poívei com binaçõe de condon de parte da equência TGTATGGATGAAATGAA TGCATGGATGAAATGAA TGTATGGACGAAATGAA TGCATGGACGAAATGAA TGTATGGATGAGATGAA TGCATGGACGAGATGAA TGCATGGATGAGATGAA TGTATGGATGAGATGAA 5' S onda tentativa TGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATC 3' Hibridação com cd na 5' TGCATGGACGAAATGAA 3' TGCATGGACGA G 5' ATGAAGCGCAA C ATC3' ---ACGTACCTGCT T TACTTCGCGTT TAG--- A ---ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG--- Figura 31. Deenho de onda oligonucleotídica baeada na eqüência protéica. Como a maioria do aminoácido é epecificada por doi ou mai códon ete oligonucleotídeo ão intetizado uando-e uma mitura do nucleotídeo da poiçõe ambígua. A eqüência correta etará repreentada entre o oligo. Uma outra poibilidade é uar uma onda tentativa cuja ecolha é baeada na freqüência de uo do códon na epécie em etudo. Nete cao pareamento incompleto podem ocorrer. 3. ANÁLISE DO DNA E RNA POR ELETROFORESE EM GEL E BLOTTING Vária técnica foram deenvolvida baeada na propriedade de hibridação do ácido nucléico viando a triagem e iolamento de eqüência epecífica deta molécula. A maioria deta técnica, conforme já mencionado, trabalha com uma réplica do DNA de 55

56 interee imobilizado num uporte ólido tal como uma membrana de náilon ou de nitroceluloe. Um dete método, deenvolvido na década de 70 por E. M. Southern, tornou-e conhecido por "Southern blotting". Neta técnica o DNA é digerido com uma ou mai enzima de retrição e o fragmento reultante eparado por eletroforee num gel de agaroe. O fragmento de DNA dupla fita ão viualizado por coloração com brometo de etídio, denaturado 'in itu' com hidróxido de ódio e tranferido para uma membrana por capilaridade, com o auxílio de uma olução de alta concentração alina. Tai condiçõe permitem que o DNA eja retido na membrana no ponto de contacto entre o gel e a membrana, criando uma réplica do gel. O DNA é covalentemente ligado à membrana uando-e calor ou luz ultravioleta. Sonda de ácido nucléico (DNA ou RNA marcado radioativamente) podem er utilizada para hibridar com o DNA fixado na membrana e a poição na qual a ligação epecífica ocorrer pode er detectada por autoradiografia da membrana (Figura 32). O padrão de hibridação pode er comparado diretamente com a região no gel original que contém a eqüência de DNA de interee. Southern blotting é uma técnica tão poderoa que permite que a informaçõe obtida ejam utilizada para a contrução de um mapa de retrição de uma determinada parte do DNA clonado, por exemplo, para identificar a região que contém o gene de interee. Eta técnica poibilita também que a onda de ácido nucléico ejam utilizada para diagnótico de ditúrbio genético, enaiando-e o DNA genômico do indivíduo afetado e de eu familiare. De modo análogo, molécula de RNA também podem er identificada apó erem eparada por eletroforee, tranferida para nitroceluloe, ofrerem hibridação com onda de DNA ou RNA. Eta técnica de analiar RNA, por analogia ao Southern blotting, recebeu o nome de Northern blotting. Eta técnica é útil como auxiliar na análie de clone de cdna porque, o tamanho do mrna epecífico pode er comparado com o tamanho do cdna clonado, revelando a integridade do clone. Além dito, eta técnica permite indicar em qual tecido ou tipo celular um determinado gene é expreo ou quai ão o fatore que regulam a ua expreão. 56

57 SondadeDNA marcadacom 32 P eletroforee tranferência dodnapor "blotting". autoradiografia gel de agaroe papel de nitroceluloe autoradiograma Figura 32. Southern blotting. Um fragmento de DNA epecífico pode er identificado eparando-e a mitura de fragmento por eletroforee, tranferindo-e para nitroceluloe e hibridizando-e com uma onda molecular complementar à eqüência e marcada com 32 P. 4. COMO OS GENES CLONADOS SÃO UTILIZADOS? O clone de interee pode er explorado ob vário apecto. Ele pode er eqüenciado e comparado com outra eqüência já decrita, er utilizado no etudo da expreão gênica do() gene() contido() no clone, er alterado epecificamente por mutagênee ítio dirigida ou er uado para gerar um produto de interee comercial. Para ito quae empre erá neceário tranferir o clone, ou parte dete para um vetor mai apropriado para atingir o objetivo deejado. A tranferência de parte do DNA clonado para um novo vetor é conhecida como ub clonagem. Alguma deta aplicaçõe erão abordada no capítulo eguinte. 5. MAPA DE RESTRIÇÃO O mapa de retrição do DNA clonado ou de pequena molécula de DNA de fago, plamídio ou mitocôndria pode er batante útil na caracterização da molécula. Eta técnica envolve a eparação por eletroforee do fragmento de DNA obtido apó digetão do DNA total com determinada enzima de retrição. A ordem do fragmento na molécula pode er decoberta com o uo de outra enzima de retrição, em dupla digetõe e/ou por digetõe eqüenciai uando 2 enzima. Aim cada fragmento obtido apó digetão com a enzima x é removido do gel e ubmetido à digetão com a enzima y e vice-vera (Figura 33). 57

58 Informaçõe obre o mapa de retrição de um fragmento de DNA ão utilizada, por exemplo, para ubclonar parte dete fragmento para o eqüenciamento. O mapa de retrição do DNA mitocondrial vem endo útil na caracterização de linhagen e/ou epécie de vário organimo, auxiliando em etudo taxonômico e evolutivo. Figura 33. Mapa de retrição do DNA do fago para vária endonucleae. A barra verticai indicam o locai de clivagem de cada enzima e o número no alto indicam o tamanho da molécula em unidade de 5000 pare de bae. Eta molécula poui no total pare de bae. V. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) A reação em cadeia da polimerae poibilita a amplificação de uma eqüência rara de DNA a partir de uma mitura complexa, em a neceidade de clonagem molecular. Eta técnica é amplamente utilizada em pequia báica, em medicina forene e no diagnótico de doença genética e infeccioa. Inicialmente, é neceária a contrução por íntee química de doi oligonucleotídeo de DNA (iniciadore) complementare a extremidade de cada fita de DNA, flanqueando a região de interee. Ete oligonucleotídeo ervem como iniciadore da íntee de DNA in vitro, que é cataliada pela DNA polimerae. Um ciclo de PCR começa com a denaturação por calor (95 C), que promove a eparação da fita dupla de DNA. A reação é refriada na preença de um exceo do doi oligonucleotídeo, poibilitando a hibridização do doi iniciadore com a eqüência complementar preente no DNA alvo. Em eguida, a reação é incubada para atividade da DNA polimerae, produzindo nova fita de DNA a partir do iniciadore e utilizando o quatro deoxirribonucleotídio (datp, dctp, dgtp e dttp) (Figura 34). 58

59 Figura 34. A 3 etapa do ciclo de PCR ( A cada novo ciclo da reação inicia-e com o aquecimento para denaturação da dupla fita de DNA, eguido de refriamento para hibridação do iniciadore e íntee de uma nova fita pela DNA polimerae a partir do iniciadore, endo que a fita de DNA recém intetizada ervem de molde no ciclo eguinte. Portanto, em cada ciclo é intetizado o dobro do DNA produzido no ciclo anterior (Figura 35). Uualmente, ão realizado de 20 a 30 ciclo para amplificação de um egmento de DNA epecífico dentro de um genoma. Na primeira iniciativa para amplificar fragmento de DNA utilizava-e a enzima DNA polimerae da Echerichi coli, que poui atividade máxima a 37 C. Eta enzima deveria er adicionada a cada ciclo poi o pao de denaturação inativa a enzima. Um importante avanço ocorreu com a decoberta da enzima Taq DNA polimerae (Saiki et al, 1988) oriunda da bactéria Thermu aquaticu. A Taq DNA polimerae poui atividade ótima a 72 C e permanece razoavelmente etável memo a 95 C e com ito, a enzima é adicionada omente no inicio do proceo. 59

60 Figura 35. O primeiro 4 ciclo de um PCR em detalhe.no terceiro ciclo, dua dupla fita que apreentam o tamanho correto ão copiada (a dua fita com o memo tamanho). No quarto ciclo, 8 dupla fita que apreentam o tamanho ão copiada ( allerv.rug.ac.be/ ~aviertr/index.html). Além de er utilizada para a amplificação de um egmento epecífico de DNA dentro de um genoma, a metodologia de PCR pode er utilizada para amplificar um egmento ou toda a eqüência de um produto gênico. Io pode er feito a partir da população de RNA de uma determinada célula ou tecido. Entretanto, como a Polimerae utilizada na metodologia de PCR é uma DNA Polimerae depedente de DNA, ela não pode uar RNA diretamente como molde para a amplificação. Aim, inicialmente é realizada uma reação de trancrição revera, onde pela ação da trancriptae revera o RNA é utilizado como molde para geração de cdna, que é então utilizado como molde em uma PCR ubequente. Ea abordagem denominada de RT-PCR (Revere Trancription and Polimerae Chain Reaction) é muito útil para e analiar de maneira rápida a expreão de gene de interee, poi uma vez que a PCR é realizada a partir de cdna, o fragmento correpondente ao gene de interee ó erá amplificado naquela célula ou tecido onde o gene é expreo. Eta técnica pode er utilizada para clonagem de um cdna de interee, dede que já e tenha alguma informação de ua eqüência, em a neceidade de e contruir uma biblioteca de cdna para iolá-lo. 60

61 VI. SEQUENCIAMENTO DE DNA A partir do final da década de 70 tornou-e poível a determinar a eqüência nucleotídica de fragmento de DNA. O deenvolvimento da metodologia decrita por Sanger e col aociado a avanço tecnológico, permite que hoje genoma inteiro ejam eqüenciado. O princípio do método de terminação da cadeia para eqüenciamento de DNA baeia-e na íntee de DNA in vitro realizada na preença dideoxirribonucleotídeo. Um DNA purificado pode er intetizado in vitro em uma mitura que contém molécula de fita única de DNA, enzima DNA polimerae, um DNA iniciador que poibilita a polimerae iniciar a íntee de DNA utilizando o deoxirribonucleotídio. Alternativamente, na preença de dideoxirribonucleotídeo (ddatp, ddctp, ddgtp e ddttp) na reação, o elongamento da cadeia de DNA é bloqueado pela incorporação do nucleotídeo em um grupo OH na poição 3'. No método originalmente deenvolvido por Sanger para eqüenciamento de DNA, uma fita complementar é intetizada utilizando um mitura de deoxirribonucleotídeo, um dele marcado com P 32 ou S 35. São realizada 4 reaçõe independente, contendo uma pequena quantidade de um tipo de dideoxirribonucleotídio em cada uma da reaçõe. Cada reação produz um conjunto de cópia do DNA inicial que terminam em diferente ponto da ua eqüência. O produto deta quatro reaçõe ão eparado por eletroforee, utilizando quatro raia paralela em um gel de poliacrilamida e o fragmento ão detectado atravé da marcação radioativa. Em cada um da raia, a banda repreentam fragmento que foram terminado em dado nucleotídeo em diferente poiçõe do fragmento inicial de DNA. Pela análie da ordem da banda, começando pelo final do gel atravé da quatro raia, pode-e determinar a eqüência do DNA recém intetizado (Figura 36). Ete método ainda é amplamente utilizado, endo que vário avanço tornaram o eqüenciamento de DNA uma técnica imple e rápida. O principai avanço foram a adaptação da PCR ao método de terminação da cadeia e a utilização de dideoxirribonucleotídeo marcado com diferente corante fluorecente (fluorocromo). A utilização de fluorocromo permite que toda a quatro reaçõe ejam realizada em um único tubo e o produto da reação de eqüenciamento eja eparado em uma única raia do gel. 61

62 Figura 36. Seqüenciamento de nucleotídeo pelo método do término do crecimento da cadeia. Lehninger, Principle of Biochemitry. Figura 10-36, p Atualmente, todo o proceo de eqüenciamento de DNA pode er realizado em eqüenciadore automático. Nete equipamento o produto da reação de eqüenciamento é eparado por eletroforee em gel ou em capilar, o fluorocromo ão excitado por um feixe laer, o inai fluorecente ão amplificada e detectado por tubo fotomultiplicadore ou no modelo mai moderno por câmara CCD. Análie computacionai identificam cada nucleotídeo pelo comprimento de onda de emião epecífico de cada fluorocromo. A bae ão identificada de acordo com a forma do pico fluorecente e a ditância entre pico uceivo (Figura 37). 62

63 Figura 37. O produto da reação de eqüenciamento é ubmetido à eletroforee em uma raia de gel. À medida que o fragmento paam pelo feixe de laer, o fluorocromo ão excitado e a luz emitida é detectada por um fotomultiplicador. Eta informação é traduzida na forma de eqüência atravé de um computador. VII. EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS 1. INTRODUÇÃO A decoberta de promotore e repreore epecífico do genoma de E. coli, de uma variedade de víru de E. coli e de célula eucariótica permitiu a manipulação da expreão de proteína e a clonagem de gene ob o controle de um dado promotor, cuja expreão pode er indutível ou contínua. O primeiro, e mai comumente uado, itema de expreão de proteína heteróloga em E. coli é baeado no operon lac (Figura 38). Nete itema, o DNA de interee é clonado em fago (no cao de biblioteca de cdna de expreão) ou plamídeo contendo o laci (repreor), lacp (promotor) e lacz (gene etrutural trancrito para mrna da -galactoidae). A indução da trancrição é obtida pela adição de um análogo de lactoe intético e não degradável (iopropiltio- -D-galactoídeo, IPTG), o qual 63