GRUPO HOSPITALAR CONCEIÇÃO HOSPITAL NOSSA SENHORA DA CONCEIÇÃO LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS

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1 POP n.º: I 140 Página 1 de 6 1. Sinonímia Detecção qualitativa do DNA bacteriano de Chlamydia trachomatis (CT) e Neisseria gonorrhoeae (NG) por PCR ( Polymerase Chain Reaction) em urina de homens e mulheres, em swab de secreção endocervical e em swab de secreção uretral de homens 2. Aplicabilidade Bioquímicos do Setor de Imunologia. 3. Aplicação clínica Chlamydia são bactérias gram-negativas desprovidas de mobilidade que se encontram presentes como parasitas obrigatórios nas células eucarióticas em virtude da sua incapacidade de sintetizar ATP. Existem três espécies declaradas de Chlamydia: C. trachomatis,c. psittaci (predominantemente animal) e C. pneumoniae. Infecções por C. trachomatis são uma das mais freqüentes DST. Causam cervicite, doença inflamatória pélvica (DIP), conjuntivites infantis, pneumonia infantil, uretrite, epididimite e proctite. Causa mais freqüente de uretrite não gonocócica (UNG) em homens e infertilidade em mulheres. Neisseria gonorrhoeae é um diplococo gram-negativo, positivo para a citocromo oxidase, imóvel e não formador de esporos. A N. gonorrhoeae apresenta uma estreita relação com A N. meningitidis (meningococos) agentes da meningite bacteriana e menor relação com N. lactâmica (patógeno humano ocasional). Existem várias espécies adicionais de Neisseria que podem ser consideradas como flora normal do ser humano, entre elas N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. mucosa, N. sicca e N. subflava. As infecções por N. gonorrhoeae traduzemse em gonorréia, como a terceira causa de DST mais freqüente. No homem provoca uretrite anterior, acompanhada de exsudato purulento. Nas mulheres, a doença é mais freqüentemente encontrada no colo uterino, mas a vagina e o útero também podem ser infectados. N. gonorrhoeae em amostras de esfregaços endocervicais ou vaginais de mulheres, esfregaços uretrais de homens ou em amostras de urina de ambos os sexos. Diagnóstico de infecção por Chlamydia trachomatis e/ou Neisseria gonorrhoeae. 4. Princípio do teste O ensaio Abbott Realtime usa a tecnologia de PCR com detecção homogênea da fluorescência em tempo real. O ensaio CT/NG é utilizado para a detecção dupla dos patógenos das doenças sexualmente transmitidas C. trachomatis e N. gonorrhoeae.

2 POP n.º: I 140 Página 2 de 6 5. Amostra 5.1 Preparo do paciente Homens - ficar sem urinar por um período mínimo de uma hora antes da coleta. Mulheres - o exame não pode ser feito durante a menstruação. 5.2 Tipo de amostra Urina, swab vaginal, swab endocervical e swab uretral. 5.3 Colheita Quantidade mínima de urina: 20 ml Quantidade ideal de urina: 30 ml. 5.4 Preservação e transporte Swabs devem ser, em seguida da coleta, colocados no tubo de coleta específico do kit em contato com o tampão de transporte. Para o transporte, observar as normas de biosegurança legais vigentes. 5.5 Identificação da amostra Etiqueta com código de barras, gerada pelo sistema SIL do LAC. 5.6 Armazenamento Por até 14 dias de 2 C a 30 C. Para armazenamento por tempo maior, conservar a -10 C ou menos por até 90 dias. Descongelar de 2 C a 30 C. As amostras não devem passar por mais de quatro ciclos de congelamento/descongelamento. 5.7 Amostras inadequadas Amostras coletadas em frascos errados, mal identificadas e que não observem as regras de preservação e transporte e/ou armazenamento. 6. Reagentes e materiais 6.1 Reagentes do kit Sistema de Preparação de Amostra (48 testes/caixa) Tampão de lise Micropartículas Tampão de lavagem 1 Tampão de lavagem 2 Tampão de eluição Kit de reagente de amplificação Controle interno Cassete de reagentes de amplificação (48 testes/cassete): Enzima AmpliTaq Gold Reagente de amplificação

3 POP n.º: I 140 Página 3 de 6 Reagente de ativação Kit de controle Controle negativo para CT/NG Controle de ponto de corte para CT/NG (CT/NG cutoff control) 6.2 Preparo Controles, controle interno e reagentes de amplificação Descongelar em geladeira ou temperatura ambiente (2-30 C, 8 horas). Homogeneizar em vórtex antes da utilização. Utilizar um cassete de reagente para cada 48 amostras. Tampão de lise Pipetar 250µL do controle interno no frasco do tampão de lise. Homogeneizar girando o frasco suavemente. Verter, pelas paredes, o conteúdo no vaso de reagente identificado pela etiqueta do tampão de lise. Utilizar um frasco para até 96 testes. Micropartículas Homogeneizar suavemente, observando a suspensão dos grumos de partículas no fundo e nas paredes do frasco. Verter, pelas paredes, o conteúdo no vaso de reagente identificado pela etiqueta de micropartículas. Utilizar um frasco para até 96 testes. Tampão de lavagem 1, tampão de eluição Homogeneizar girando os frascos suavemente. Verter, pelas paredes, o conteúdo no vaso de reagente identificado pelas etiquetas de cada reagente. Utilizar um frasco para cada 48 testes. Tampão de lavagem 2 Adicionar 70mL de etanol Grau USP (95%-100% de etanol) ao frasco. Homogeneizar girando o frasco suavemente. Verter, pelas paredes, o conteúdo no vaso de reagente identificado pela etiqueta de mwash 2 DNA. Utilizar um frasco para cada 48 testes. 6.3 Estabilidade Uma vez aberto, utilizar em seguida. Desprezar a parte não utilizada. Fechados, os reagentes são estáveis até a data do vencimento. 6.4 Armazenamento Sistema de Preparação de Amostra: temperatura ambiente, entre 15 e 30 C. Kit de reagente de amplificação: em freezer -10ºC. Kit de controles: em freezer 10ºC. 7. Equipamentos Centrífuga com capacidade para 2000g, pipetas automáticas calibradas para entre 20 µl e 1000 µl, ponteiras com barreira de 200 µl e de 1000 µl, ponteiras descartáveis de 200 µl e de 1000 µl, cobertura adesiva ótica Abbott, aplicador da cobertura adesiva, suporte para tubos, placa de 96 poços profundos, placa ótica de reação de 96 poços, suporte para tubos

4 POP n.º: I 140 Página 4 de 6 com tampa de segurança, tubos para amostra de 13mm a 16mm, vasos de reagente de 200mL, tubos de Master Mix com tampa, geladeira, freezer 30ºC, agitador (Vórtex), Abbott m2000sp, Abbott m2000rt, cabine de segurança biológica classe II. 8. Calibração A calibração é realizada a cada corrida, através de cálculos a partir dos resultados dos controles de ponto de corte para CT/NG. 9. Procedimento 9.1 Preparação das amostras Limpar a área de trabalho com álcool 70%. Remover as amostras do refrigerador ou descongelar tubos ou frascos entre 2 e 30 C O ensaio requer, no mínimo, 500 µl de amostra por tudo individual. Preencher as racks de amostra em posições sucessivas, sem saltar nenhuma posição. 9.2 Extração dos ácidos nucléicos Conforme descrito no pop I 124, item Extração de amostras. 9.3 Adição da mistura principal Conforme descrito no pop I 124, item Adição de mistura principal. 9.4 Amplificação dos ácidos nucléicos Conforme descrito no pop I 125, item Operação. 10. Controle de qualidade 10.1 Interno Controles do kit: Controle Negativo e controles de ponto de corte para CT/NG com concentrações conhecidas documentadas na bula que acompanha a caixa dos controles. Freqüência: testar a cada placa, independente do número de amostras Externo Vide tabela PCIQ/PAEQ. 11. Resultados 11.1 Unidades

5 POP n.º: I 140 Página 5 de 6 Não se aplica Cálculos Não se aplica Critérios de aceitação O teste é considerado válido se todas as condições abaixo forem cumpridas: Controle Negativo sem detecção de CT ou de NG. Controles de cutoff e negativo com resultados de CI dentro do limite inferior para validade. Os valores dos controles podem variar a cada lote. 12. Valores de referência Negativo. 13. Valores críticos Não se aplica. 14. Linearidade Não se aplica. Amostras com evidência de amplificação além do cutoff e interpretadas como Reteste devem ser testadas novamente. 15. Especificações de desempenho O mais baixo limite de detecção do ensaio é de 320 cópias de plasmídeo de DNA por 400 µl de amostra. O ensaio CT/NG objetiva o plasmídeo críptico da Clamídia (presente em aproximadamente 10 cópias por organismo de Clamídia) e o gene de opacidade multicópia de Neisseria gonorrhoeae (repetido aproximadamente 11 vezes por organismo). Assim, 30 cópias de alvo sintético por entrada de amostra (400 µl) traduzem aproximadamente organismos. 16. Fontes potenciais de variabilidade Degradação e/ou contaminação de reagentes e/ou amostras. 17. Limitações do método

6 POP n.º: I 140 Página 6 de 6 Somente para uso diagnóstico in vitro; A otimização do desempenho deste teste requer coleta, manuseio, preparação e armazenamento apropriados da amostra; O ensaio pode ser realizado apenas em amostras de esfregaços de endocérvix, vagina ou uretra masculina, ou urina de homens e mulheres. Não foi validade o uso de outros tipos de amostra; O ensaio Abbott RealTime CT/NG não detectará variantes de C. trachomatis isentas de plasmídeo; Os aparelhos e procedimentos do ensaio reduzem o risco de contaminação pelo produto de amplificação. No entanto, a contaminação por ácido nucléico dos controles ou amostras deve ser controlada por meio das boas práticas de laboratório e adesão cuidadosa aos procedimentos especificados nestas instruções de uso; Como acontece com qualquer outro teste diagnóstico, o resultado do ensaio deve ser interpretado em conjunto com outros achados clínicos e laboratoriais. 18. Interpretação dos resultados Amostras CT com número de ciclo menor ou igual ao ciclo de decisão de cutoff são interpretadas como Positivas. Um número pequeno de amostras CT pode ter evidência de amplificação além do cutoff e pode ser interpretada como Reteste. Amostras CT sem evidência de amplificação são interpretadas como Negativas. Amostras NG com um número de ciclo menor ou igual ao ciclo de decisão de cutoff são interpretadas como Positivas. Amostras NG sem evidência de amplificação são interpretadas como Negativas. 19.Biossegurança Obedecer às normas de segurança vigentes no laboratório e usar equipamentos de proteção individual. 20.Anexos Planilhas de Manutenções do m2000sp e do m2000rt. 21.Bibliografia Bulas dos Abbott Real Time CT/NG Amplification Reagent Kit e Control Kit. Bula do Abbott msample Preparation System DNA

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