DNA, RNA e PROTEÍNAS

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1 DNA, RNA e PROTEÍNAS DNA PROTEÍNA Carla Costa Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Serviço e Laboratório de Biologia Celular e Molecular

2 OBSERVAÇÃO A descoberta do DNA foi crucial para o entendimento da biologia ao nível molecular.

3 O QUE É O DNA? DNA Ácido desoxiribonucleíco é a molécula que contém a informação genética.

4 DNA - MARCOS HISTÓRICOS Desoxiribose Friedrich Miescher Phoebus Levene Erwin Chargaff Descoberta do DNA (1869) Identificou os componentes do DNA (1920s) T=A G=C Purinas Nucleótido Pirimidinas

5 MARCOS HISTÓRICOS Rosalind Franklin Francis Crick James Watson Difracção DNA por raios-x (1952) Modelo da dupla hélice (1953)

6 ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DO DNA Francis Crick mostra a James Watson o modelo do DNA em dupla hélice

7 DUPLA HÉLICE E ESTRUTURA MOLECULAR DO DNA DNA mede-se em número de pares de bases (bp) 1000 bp = 1 kb bp = 1 Mb 10 nucleótidos em uma volta da hélice

8 ESTRUTURA MOLECULAR DO DNA Purinas Pirimidinas

9 DUPLA HÉLICE E ESTRUTURA MOLECULAR DO DNA Cadeias anti-paralelas

10 LOCALIZAÇÃO CELULAR Núcleo: 5-8 µm de diâmetro DNA: 2 m de comprimento DNA+Histonas Nucleossomas Cromatina Cromossomas

11 CROMOSSOMAS NÚCLEO CROMOSSOMAS

12 NÚMERO DE CROMOSSOMAS Organism # of chromosomes DNA (Mb) mug shot Escherichia coli (bacterium) 1 47 Saccharomyces cerevisae (yeast) Caenorhabditis elegans (nematode) 6 97 Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) Drosophila melanogaster (fruit fly) Mus musculus (mouse) 19 + X/Y 3,059 Homo sapiens sapiens (human) 22 + X/Y 3,286

13 LOCALIZAÇÃO CELULAR Núcleo: 5-8 µm de diâmetro DNA: 2 m de comprimento DNA+Histonas Nucleossomas Cromatina Cromossomas

14 CROMATINA E NUCLEOSSOMA NÚCLEO CROMOSSOMAS CROMATINA DNA + HISTONAS NUCLEOSSOMA - Contém ~ 200 pb de DNA enrolado à volta de uma região central composta por 8 histonas (H2A, H2B, H3, H4). 10 nm de diâmetro - Histona H1 junta a estrutura. - O empacotamento do DNA em fibras de cromatina de 10 nm diminui em cerca de 6 vezes o seu comprimento! -Os nucleossomas originam uma fibra de cromatina de ~10 nm de diâmetro. - A cromatina pode ser condensada em fibras de 30 nm.

15 FIBRAS DE CROMATINA

16 EUCROMATINA E HETEROCROMATINA HETEROCROMATINA EUCROMATINA NÚCLEO EM INTERFASE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

17 GENES ESTRUTURA DO DNA Segmento de DNA que codific para a síntese proteínas - Regiões reguladoras - Regiões codificantes (Exões) - Regiões não codificantes (Intrões Proteínas

18 OMO É QUE UMA SEQUÊNCIA DE DNA CODIFICA PARA UMA PROTEÍNA?? DNA PROTEÍNA DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

19 DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR Núcleo Citoplasma

20 REPLICAÇÃO, TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO Núcleo Citoplasma

21 REPLICAÇÃO DO DNA DNA MAKES DNA - INICIAÇÃO - REPLICAÇÃO - TERMINAÇÃO

22 REPLICAÇÃO SEMI-CONSERVATIVA DO DNA DUPLA HÉLICE ORIGINAL MOLÉCULAS DE DNA APÓS A REPLICAÇÃO

23 REPLICAÇÃO - INICIAÇÃO GARFO DE REPLICAÇÃO - Origem de replicação (ori) sequência particular de DNA onde a replicação é iniciada. - Na ori ligam-se várias proteinas, as cadeias de DNA são abertas, formando a replication bubble. - A replicação inicia-se no garfo de replicação. - A replicação do DNA a partir dos garfos de replicação é bidireccional. DNA POLIMERASE

24 DNA POLIMERASE - EUCARIOTAS Activas em células em divisão - replicação.

25 REPLICAÇÃO -Topoisomerases desenrola a dupla hélice de DNA. - Helicase abre a molécula de DNA no topo do garfo de replicação (quebra as ligações por pontes de hidrogénio entre as bases). Síntese 5 -> 3 - Single-Stranded DNA binding proteins (SSB) ligam-se a regiões do DNA em cadeia simples para prevenir a re-ligação em cadeia dupla. - DNA Polimerase inicia a síntese da nova cadeia de forma contínua. - Sintetizada descontinuamente sobre a forma de fragmentos de Okasaki que são pequenas moléculas de DNA (1 a 3kb). -RNA primase liga-se ao local de iniciação no DNA. - DNA Polimerase sintetiza os fragmentos de Okazaki.. - DNA ligase liga os fragmentos de Okazaki.

26 SÍNTESE DA CADEIAS LEADING E LAGGING

27 FRAGMENTOS DE OKAZAKI Primase DNA Pol DNA Polimerase

28 SÍNTESE DA CADEIAS LEADING E LAGGING DNA Polimerase Polimerase 5 ->3 Exonuclease 3 ->5

29 PROOFREADING (capacidade de verificação) 1 base em bases incorporadas é adicionada incorrectamente

30 REPLICAÇÃO - TERMINAÇÃO - Ocorre quando os garfos de replicação se encontram. - DNA Ligase. - Topoisomerase enrola o DNA.

31 REPLICAÇÃO DO DNA - RESUMO

32 MUTAÇÕES NO DNA ESPONTÂNEAS - INDUZIDAS - RADIAÇÕES - QUÍMICOS

33 MUTAÇÕES ESPONTÂNEAS NO DNA Para além dos erros de incorporação de bases que podem ocorrer durante a replicação. Várias modificações químicas na molécula de DNA podem ocorrer espontâneamente. (perda de purinas) Resultando na quebra da ligação entre as bases puricas e a desoxirribose deixando um local apurinico no DNA.

34 MUTAÇÕES INDUZIDAS POR RADIAÇÕES OU QUÍMICOS A radiação UV induz a formação de dímeros de pirimidina, em que duas timinas adjacentes são unidas por um anel ciclobutano. A formação destes dímeros distorce a estrutura do DNA e bloqueia a transcrição e replicação. adição de grupos alquilo (metil ou etil) a várias posições nas bases de DNA Benzo-apyrene reagem com as bases de DNA adicionando grandes grupos químicos à molécula de DNA.

35 MECANISMOS DE REPARAÇÃO DO DNA RADIAÇÕES REPARAÇÃO QUÍMICOS ESPONTÂNEA -DIRECTA - EXCISÃO DE BASE - EXCISÃO DE NUCLEÓTIDO - REPARAÇÃO MISMATCH

36 REPARAÇÃO DIRECTA DO DNA O processo de reparação dos dímeros de timina designa-se fotoreactivação uma vez que energia proveniente da luz visível é utilizada para quebrar a estrutura de ciclobutano. As pirimidinas originais permanecem na molécula de DNA, agora no seu estado normal.

37 REPARAÇÃO POR EXCISÃO - EXCISÃO DE UMA BASE - EXCISÃO DE NUCLEÓTIDOS - REPARAÇÃO POR MISMATCH

38 EXCISÃO DE UMA BASE O uracilo pode ser erradamente incorporado no DNA em vez da timina durante a replicação ou pode ser formado por desaminação da citosina. A excisão do uracilo é catalizada pela DNA glicosilase, uma enzima que cliva a ligação entre a base e a desoxirribose, formando-se um local apirimidinico (apurinico se for outro tipo de base a ser removida). O local AP é reparado por uma AP endonuclease que remove a desoxirribose. O espaço vazio de um nucleotido é preenchido pela DNA polimerase e estabelecidas as ligações pela ligase.

39 REPARAÇÃO POR EXCISÃO - EXCISÃO DE UMA BASE - EXCISÃO DE NUCLEÓTIDOS - REPARAÇÃO POR MISMATCH

40 EXCISÃO DE NUCLEÓTIDOS Mecanismo de reparação em todo o genoma As bases modificadas são removidas como parte de um oligonucleotido contendo a lesão Reconhecimento da base alterada por um complexo contendo a proteína XPC e a hhr23b. A esta interacção segue-se a ligação das proteínas XPB, XPD (são componentes do factor de transcrição TFIIH necessário para o inicio da transcrição) e XPG ao DNA danificado. Actuam como helicase desenrolando 30 pb de DNA à volta do local danificado. A proteína XPA confirma a mutação e recruta a XPF em heterodímero com ERCC1 ao complexo de reparação. As XPF/ERCC1 e XPG são endonucleases que clivam o DNA a 5 e 3 do local danificado. O espaço vazio resultante é preenchido pela DNA polimerase e unidos pela ligase.

41 EXCISÃO DE NUCLEÓTIDOS

42 REPARAÇÃO POR EXCISÃO - EXCISÃO DE UMA BASE - EXCISÃO DE NUCLEÓTIDOS - REPARAÇÃO POR MISMATCH

43 REPARAÇÃO POR MISMATCH Reconhece bases não emparelhadas que são incorporadas durante a replicação e escapam ao controlo do mecanismo de Proofreading faz um scaning ao DNA replicado de novo. 6 homólogos de MutS e 5 homólogos de MutL, designados por MSH e MLH, respectivamente. Os factores melhor caracterizados em reparação MMR são o MSH2, MSH3 e MSH6. Reparação pós replicativa de erros e é essencial para a manutenção da integridade do genoma.

44 REPARAÇÃO POR MISMATCH - Incorporação mismatch durante a replicação. - Reconhecimento. -Excisão. - Síntese.

45 DEFEITOS NOS SISTEMAS DE REPARAÇÃO DO DNA

46 REPLICAÇÃO, TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO Núcleo Citoplasma

47 TRANSCRIÇÃO - INICIAÇÃO - ELONGAÇÃO Citoplasma - TERMINAÇÃO - PROCESSAMENTO DO mrna

48 TRANSCRIÇÃO - OVERVIEW

49 RNA ÁCIDO RIBONUCLEÍCO Estruturalmente semelhante ao DNA contudo: - Ribose em vez de desoxiribose - Uracilo em vez de timina - Moléculas de RNA são mais pequenas - RNA é em cadeia simples

50 TIPOS DE RNA

51 TRANSCRIÇÃO DE UMA ÚNICA CADEIA DE DNA 3 5 Cadeia molde Anti-sense 3 RNA Polimerase 5 3 5

52 RNA POLIMERASES EM EUCARIOTAS

53 INICIAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO: REGIÃO PROMOTORA REGIÃO PROMOTORA: sequência no DNA onde a RNA Polimerase II inicia a transcrição

54 TRANSCRIÇÃO - INICIAÇÃO Inúmeras proteínas envolvidas designadas por factores de transcrição. - Formação de um complexo de transcrição da RNA polimerase II envolve a ligação do factor TFIID (Transcription Factor II) à TATA Box. O factor TFIID é composto por várias subunidades, incluindo uma TBP (TATA binding protein) e aproximadamente 10 outros polipeptideos designados TBP-associated factors (TAFs). - A ligação do TFIID é seguida pelo recrutamento de um segundo factor de transcrição, o TFIIB que serve como ponte para a RNA polimerase II, que se liga ao complexo TBP-TFIIB em associação com outro factor, o TFIIF. - Ao complexo ligam-se mais dois factores, o TFIIE e TFIIH. - A RNA Polimerase II separa a dupla cadeia de DNA e inicia a transcrição do mrna.

55 TRANSCRIÇÃO - ELONGAÇÃO ELONGAÇÃO: O mrna vai-se formando ligado ao DNA, na transcription bubble, através da adição de bases (Ex: adenina a uracilo e guanina a citosina) na direcção 5' 3. ProcessomediadopelaRNA Polimerase II.

56 TRANSCRIÇÃO - TERMINAÇÃO TERMINAÇÃO: - Um sinal stop no DNA faz com que a RNA Polimerase II seja removida. - O mrna sintetizado é libertado. - A transcription bubble no DNA é fechada. Pré-mRNA

57 TRANSCRIÇÃO - RESUMO

58 TRANSCRIÇÃO: PROCESSAMENTO DO mrna O pré-mrna sofre 3 grandes modificações antes de sair do núcleo e ser traduzido em proteína CAPPING - POLIADENILAÇÃO -SPLICING

59 PROCESSAMENTO DO mrna 1) Capping uma metilguanosina é adicionada à extremidade 5' do mrna. Esta modificação é necessária para a estabilização do mrna e para a eficiente iniciação da síntese proteíca. 2) Poliadenilação o mrna é poliadenilado na extremidade 3. Adição de uma cadeia de adeninas que aumenta a estabilidad e o tempo de semi-vida de molécula de mrna. 3) Splicing remoção de intrões (sequências não codificantes) do pré-mrna para formar mrna, contendo somente a estrutura codificante, exões, para serem traduzidos em proteína. Este processo ocorre no spliceossoma.

60 SPLICING

61 PROCESSAMENTO DO mrna - RESUMO

62 DO NÚCLEO PARA O CITOPLASMA mrna

63 ENVELOPE NUCLEAR Heterocromatina Eucromatina Nucléolo Complexo Poro nuclear

64 TRANSPORTE DO mrna DO NÚCLEO PARA O CITOPLASMA

65 TRANSPORTE DO mrna DO NÚCLEO PARA O CITOPLASMA A molécula de mrna é transportada através do poro nuclear. Antes da translocação começar, algumas proteínas (Ex: componentes de splicing) são dissociadas do mrna. Proteínas envolvidas na exportação ligam-se ao mrna e posteriormente a receptores no complexo poro nuclear. O mrna é translocado pelo poro nuclear, com a extremidade 5 CAP na frente. Quando o mrna chega ao lado citoplasmático do poro nuclear, muitas proteínas se dissociam deste Como as proteínas de exportação que regressam ao núcleo. A molécula de mrna está pronta para o próximo passo - TRADUÇÃO

66 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA TRANSPORTE DO mrna mrna transportado com a extremidade 5 na frente mrna torna-se alongado de modo a facilitar o transporte através da abertura do CPN. mrna associado ao CPN. Núcleo Citoplasma Quando chegado ao lado citoplasmático os ribossomas ligam-se ao mrna e a síntese proteíca é iniciada. Microscopia electrónica mrna associado a proteínas durante o transporte através do complexo poro nulear (CPN). Barra= 100 nm.

67 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA TRANSPORTE DO mrna Vista tangencial no lado citoplasmático do CPN. As setas mostram a passagem de mrna. mrna Microscopia electrónica Transporte do mrna através do complexo poro nulear (CPN) vista do lado citoplasmático.

68 TRANSCRIÇÃO - DNA transfere informação para o mrna sob a forma de uma sequência de nucleótideos TRADUÇÃO - A molécula de mrna é lida por sequências de 3 nucleótidos, CODÕES, de 5 ->3.

69 CÓDIGO GENÉTICO Sequência de tripletos de nucleótidos, codões, ao longo do mrna e que determinam a sequência de aa numa proteína. 20 aminoácidos (aa) usados na construção de proteínas, e os codões que codificam para cada aa. O código genético é degenerativo ou redundante 2 ou mais codões codificam para o mesmo aa.

70 TRADUÇÃO

71 MOLÉCULAS ENVOLVIDAS NA TRADUÇÃO A tradução é catalizada por ribossomas que são constituídos por proteínas e rrna (RNA ribossomal), responsável pela ligação entre os aminoácidos. Maquinaria básica para o processo de tradução. A tradução envolve moléculas de trna (RNA de transferência) que liga anti-codões aos codões do mrna. Cada anti-codão está ligado a um aminoácido (aa) particular. O ribossoma liga-se ao primeiro codão AUG (codão de iniciação) no mrna. Este codão codifica para o aa metionina (Met).

72 TRADUÇÃO: INICIAÇÃO - A unidade pequena do ribossoma liga-se a um local "upstream" na extremidade 5 do início do mrna. - Prosegue para dowstream (5 ->3 ) até encontrar o codão de iniciação AUG. - Liga-se o anti-codão complementar através do trna iniciador. - A unidade maior do ribossoma junta-se ao complexo. - O trna iniciador codifica para o aa metionina (Met).

73 TRADUÇÃO: ELONGAÇÃO Met -O aa inicial, Met, é covalentemente ligado através de rrna ao aa seguinte, resultado da ligação do segundo anti-codão ao codão complementar. - O trna iniciador é libertado. -O ribossoma move-se ao longo do mrna fazendo a ligação de anticodões a codões, adicionando aa à cadeia polipeptídica.

74 TRADUÇÃO: ELONGAÇÃO Quando o ribossoma atinge um codão stop no mrna, o polipeptídeo e o mrna são libertados.

75 TRADUÇÃO - RESUMO

76 TAKE HOME MESSAGE PROCESSOS DE REPARAÇÃO DE DANOS ESSENCIAL PARA A MANUTENÇÃO DA INTEGRIDADE DO DNA MUTAÇÕES NOS PROCESSOS DE REPARAÇÃO ESTÃO ASSOCIADOS A DIVERSAS PATOLOGIAS

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