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1 Faculdade de Ciências e Tecnologias Curso de Bioquímica Relatório de estágio Estudo sobre a regulação da mineralização in vitro de duas linhas celulares derivadas de vértebra de um peixe teleósteo marinho, Sparus aurata Autor: Orientadores: Duarte Miguel P. Molha Prof. Doutora Leonor Cancela Doutor Vincent Laizé Faro, 29 de Janeiro de 2003

2 Research is to see what everyone else has seen, and to think what no one else has thought. Albert Szent Gyoergi TÉá Åxâá ct á ÑÉÜ àéwé É TÅÉÜ x VtÜ Ç{É

3 Agradecimentos Existem muitas pessoas a quem gostaria de agradecer Gostaria em primeiro lugar, agradecer à professora Leonor Cancela, por me ter permitido realizar o estágio no seu laboratório, por toda a sua orientação e apoio. Agradecer também o imenso apoio, amizade e orientação científica do Doutor Vincent Laizé sem o qual todo este projecto teria sido bastante mais difícil. Merci Vincent! Agradeço ainda a todos os meus colegas do laboratório, pelo ambiente caloroso que vim encontrar e pela forma como me acolheram e me ajudaram. São eles António Pombinho, Assuncion Lago, Brian Schaff, Bruno Pardelha, Carla Viegas, Dina Simes, João Fidalgo, Jorge Pinto, Juan Bosco, Natércia Conceição, Nuno Henriques, Patrícia Cabrita, Paulo Gavaia, Ricardo Afonso, Ricardo Leite, Sandra Marques e Vera Fonseca. Quero também agradecer a todos os meus colegas de curso, pelos anos inesquecíveis que partilharam comigo e pelos momentos de amizade que relembrarei para o resto da minha vida. Entre muitos outros gostaria de destacar os meus colegas de casa João Fidalgo ( Joni ) e João Matos ( Jepe ) por me terem aturado durante todos estes anos, pelo carinho e amizade que sempre demonstraram. Gostava ainda de agradecer a todo o corpo de docentes da licenciatura em Bioquímica da Ualg. pela sua dedicação ao ensino e à motivação dos alunos para esta área tão nobre que é a química da Vida! Quero agradecer à Natasha, todo o amor que me deu e por estar ao meu lado tanto nos momentos mais difíceis como nos momentos de alegria Por último quero agradecer à minha família, aos meus pais e à minha irmã a quem dedico todo este trabalho e sem os quais nunca teria chegado onde cheguei. Obrigado por tudo i

4 Abstract Abstract Studies on regulation of bone formation and mineralization in fish have been hampered due to a lack of well characterized in vitro model system. The purpose of this work was to investigate the ability of recently developed bone-derived cell lines to induce extracellular matrix mineralization and their suitability to study specific gene expression and regulation. We found that both cell lines were tetraploid, and that the mineralization of their extracellular matrix is dependent on several factors. Calcium and β-glycerophosphate are required for the mineralization and an excess of calcium leads to a decrease in mineralization rates. We also found that vitamin C may have a role on the estabilization of the mineralized nodules, decreasing the quantity of mineralization but increasing the quality of the mineralization nodules. We have also investigated the effect on mineralizing rates, of levamisole, a known inhibitor of alkaline phosphatase and warfarin, an inhibitor of the γ-carboxilation. We have observed that levamisole inhibits and warfarin stimulates the mineralization of the extracellular matrix, both in a dose dependent manner. Our results indicate that this new in vitro model system constitutes a valuable tool for further studies on expression of genes involved in extracellular matrix mineralization. ii

5 Resumo Resumo Estudos sobre a regulação da mineralização e formação óssea em peixes têm sido limitados a estudos in vivo, devido à ausência de um sistema in vitro, bem caracterizado. O objectivo deste trabalho, foi o de investigar a capacidade de indução de mineralização da matriz extracelular em linhas celulares recentemente desenvolvidas, derivadas de osso de Sparus aurata (VSa13 e VSa16), bem como avaliar a sua utilização para estudos de expressão e regulação de genes relacionados com o processo de mineralização. Descobriu-se que ambas as linhas celulares são tetraplóides e que a sua capacidade de mineralizar a matriz extracelular se encontra dependente de diversos factores. Verificou-se que estas células necessitam de cálcio e β-glicerofosfato para a indução da mineralização, tendo-se no entanto observado que um excesso de cálcio leva a uma diminuição mineralização. A vitamina C poderá ter um papel importante na estabilização dos nódulos mineralizados. Neste estudo também se determinou o efeito da adição de levamisole, que é um conhecido inibidor da fostafase alcalina, e de warfarina, inibidora da γ-carboxilação, na capacidade de mineralização destas linhas celulares. Verificamos que o tratamento com concentrações crescentes de levamisole leva a uma redução no nível de mineralização de ambas as linhas celulares, enquanto que o tratamento com concentrações crescentes de warfarina induz a mineralização da matriz extracelular. Verificou-se que este novo sistema in vitro, pode ser utilizado como modelo de sistemas osséos de Sparus aurata e constitui uma ferramenta bastante útil para novos estudos envolvendo expressão e/ou regulação de genes, bem como estudos sobre a função de diversas proteínas envolvidas na regulação dos processos de ossificação. iii

6 Índices e Abreviaturas Abreviaturas Aa aminoácido Abs Absorvância ADN Ácido desoxiribonucleico ADNc Ácido desoxiribonucleico complementar AMPc Adenosina monofosfato cíclica ARN Ácido ribonucleico ARNm Ácido ribonucleico mensageiro BGP Proteína Gla do osso (derivado do Inglês - bone Gla protein) BSA Albumina de soro bovino (derivado do Inglês - bovine serum albumin ) Da Dalton D-MEM Dulbecco s modified Eagle medium DMSO Dimetil sulfóxido EDTA Tetra-acetato de etilenodiamina (derivado do Inglês - ethylenediaminetetra-acetate ) FBS Soro fetal bovino (derivado do Inglês - fetal bovine serum ) Gla Resíduo de ácido glutâmico γ-carboxilado Glu Resíduo de ácido glutâmico IPTG Isopropilthio-β-D-galactosidase kb kilobase (1 kb => 1000 pb) kda kilodalton (1 kda => 1000 Da) MCS Região de inserção fragmentos em vectores (derivado do Inglês multiple cloning site MEC Matriz extracelular MGP Proteína Gla da Matriz (derivado do Inglês - matrix Gla protein ) ORF Região codante de um gene (derivado do Inglês open reading frame ) pb Pares de bases PBS Tampão fosfato salino (derivado do Inglês phosphate-buffered saline ) PCR Reacção de polimerização em cadeia (derivado do Inglês - polymerase chain reaction ) RPM Rotações por minuto SDS Sodium dodecyl sulphate T.A. Temperatura ambiente TAE Tris-acetato-EDTA TBE Tris-borate-EDTA TGFβ Transforming growth factor β u.v. Ultra-violeta X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside iv

7 Índices e Abreviaturas Índice AGRADECIMENTOS I ABSTRACT II RESUMO III ABREVIATURAS IV ÍNDICE V 1. INTRODUÇÃO ESTRUTURA E DESENVOLVIMENTO DE OSSO ANATOMIA ÓSSEA DESENVOLVIMENTO ÓSSEO ORGANIZAÇÃO CELULAR DENTRO DA MATRIZ ÓSSEA 3 i. Osteoblastos 3 ii. Osteócitos 4 iii. Osteoclastos e a reabsorção óssea TECIDO ÓSSEO EM PEIXES TELEÓSTEOS COMPOSIÇÃO MOLECULAR DA MATRIZ 7 i. Colagénio 8 ii. Proteínas não-colagénicas 8 Proteoglicanos 9 Glicoproteinas 10 Proteínas com resíduos de ácido glutâmico γ-carboxilados 10 BGP (Bone Gla Protein) 11 Estrutura 11 Biossíntese 12 Função 13 Regulação 13 Importância clínica 14 MGP (Matriz Gla Proteico) 15 v

8 Índices e Abreviaturas Estrutura 15 Biossíntese 15 Função 16 Regulação 16 Importância clínica FORMAÇÃO DE MINERAL EM CULTURAS CELULARES CARACTERIZAÇÃO DA ESPÉCIE EM ESTUDO: SPARUS AURATA POSIÇÃO SISTEMÁTICA BIOLOGIA E ECOLOGIA DA ESPÉCIE INTRODUÇÃO AO PROBLEMA COM A SPARUS AURATA TRABALHOS PRELIMINARES OBJECTIVO MATERIAIS E MÉTODOS MATERIAIS MÉTODOS MANUTENÇÃO BACTÉRIAS E CULTURAS CELULARES 21 i. Escherichia coli 21 ii. Sparus aurata 22 Meio de cultura 22 Propagação e contagem de células 22 Criopreservação DETERMINAÇÃO DE CARIÓTIPO DE CÉLULAS EM CULTURA QUANTIFICAÇÃO PROTEICA TOTAL 24 i. Método de Bradford 24 ii. Método de BCA DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA DETECÇÃO DE NÓDULOS MINERALIZADOS POR MÉTODO DE COLORAÇÃO DE VON KOSSA QUANTIFICAÇÃO DE CÁLCIO CURVA DE RESISTÊNCIA À GENETICINA EM VSA13 E VSA TRANSFECÇÃO POR CO-PRECIPITAÇÃO DE ADN COM FOSFATO DE CÁLCIO ANÁLISE DE PROTEÍNAS 29 i. Obtenção das proteínas secretadas pelas células 29 ii. Electroforese de SDS-PAGE 30 vi

9 Índices e Abreviaturas TRANSFORMAÇÃO EM E. COLI PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ADN 31 i. Mini-preparação de ADN plasmídico 31 ii. Maxi-preparação de ADN plasmídico EXTRACÇÃO E PURIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ADN DE GEL DE AGAROSE ELECTROFORESE DE ADN EM GÉIS DE AGAROSE DIGESTÃO E LIGAÇÃO DE ADN AMPLIFICAÇÃO DE ADN POR PCR SEQUENCIAÇÃO DE ADN RESULTADOS FENÓTIPO DAS LINHAS CELULARES EM VSA13 E VSA CARACTERIZAÇÃO DO CARIÓTIPO DAS LINHAS CELULARES CARIÓTIPO DA LINHA VSA CARIÓTIPO DA LINHA VSA ESTUDO DA MINERALIZAÇÃO IN VITRO ANÁLISE DE CONDIÇÕES DE MINERALIZAÇÃO EM VSA13 E VSA16 40 i. Nódulos mineralizados por coloração de von Kossa para a linha celular VSa13 41 ii. Nódulos mineralizados por coloração de von Kossa para a linha celular VSa EFEITO DA ADIÇÃO DE LEVAMISOLE NA MINERALIZAÇÃO DA MEC EM LINHAS CELULARES DE VSA 46 i. Estimativa da de taxa de mineralização 46 ii. Medição da deposição de cálcio 47 iii. Determinação da actividade da fosfatase alcalina EFEITO DA ADIÇÃO DE WARFARINA NA MINERALIZAÇÃO EM LINHAS CELULARES DE VSA 49 i. Estimativa da de taxa de mineralização 49 ii. Medição da deposição de cálcio CARACTERIZAÇÃO POR SDS-PAGE DAS PROTEÍNAS EXCRETADAS POR VSA13 E VSA CONSTRUÇÃO DE LINHA CELULAR CAPAZ DE SOBREPRODUÇÃO DE BGP CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO 52 i. Construção do vector pcdna3-bgp 52 ii. Construção do vector prc/cmv-bgp 55 iii. Construção do vector pcdna3-bgporf 58 vii

10 Índices e Abreviaturas CURVA DE RESISTÊNCIA À GENETICINA DE CÉLULAS VSA13 E VSA16 59 i. Resistência da linha celular VSa13 a geneticina 59 ii. Resistência da linha celular VSa16 a geneticina CONTROLO POSITIVO DE TRANSFECÇÃO POR ENSAIO POR PβGAL TRANSFECÇÃO DAS VSA13 COM OS PLASMÍDEOS PCDNA3-BGP E PRC-BGP DISCUSSÃO 63 i. Cariótipos das linhas celulares VSa13 e VSa16 63 ii. Efeito da vitamina C e cálcio na mineralização da MEC 63 Efeito da vitamina C 64 Efeito do cálcio 64 iii. Efeito de levamisole e warfarina na mineralização da MEC 65 Efeito do levamisole 65 Efeito da warfarina 65 iv. Transfecções com plasmídeos de forma a obter uma linha celular capaz de sobreexprimir BGP 66 v. Identificação de proteínas expressas em VSa13 e VSa PASSOS FUTUROS BIBLIOGRAFIA ANEXOS ANEXO I SOLUÇÕES UTILIZADAS ANEXO II CURVAS DE CALIBRAÇÃO 80 Método de Bradford 80 Método de BCA 80 Curva de calibração de p-nitrofenol ANEXO III PLASMÍDEOS 82 pcdna3 82 pcdna3-bgp 82 prc/cmv 83 prc-bgp 83 pgem-t-easy 84 viii

11 Introdução 1. Introdução 1.1. Estrutura e desenvolvimento de osso O tecido ósseo e a cartilagem são dois tipos de tecido conjuntivo especializado, que compõem em conjunto o sistema esquelético dos vertebrados. Estes tecidos têm como principal função conferir suporte mecânico, pelo alojamento dos músculos responsáveis pela locomoção, participar na protecção dos órgãos vitais e da medula óssea e por fim funcionar como agente de armazenamento de iões, especialmente cálcio e fosfato [Murray 1999]. Um dos principais constituintes destes tecidos, tal como nos restantes, é a sua matriz extracelular. Esta é rica em fibras de colagénio bem como uma grande quantidade de outras proteínas. No entanto, os tecidos ósseos, os dentes e as cartilagens, ao contrário do restante tecido conjuntivo, têm a habilidade única de permitir a calcificação da sua matriz [Murray 1999] Anatomia óssea Do ponto de vista anatómico é possível subdividir o tecido ósseo em dois grupos. Os ossos lisos ou planos, nos quais podemos incluir, entre outros, os ossos do crânio e mandíbula e os ossos longos, tais como a tíbia, o fémur. Como podemos observar na Figura 1, a parte externa dos ossos é formada por uma camada de tecido calcificado muito espessa e densa chamada de córtex ou osso compacto, no qual se encontra enclausurada ao nível da diafase, uma cavidade medular onde a medula óssea hematopoietica se encontra alojada. Na região da metáfase e da epifase o córtex torna-se progressivamente mas fino e o espaço interior é preenchido por uma rede calcificada à qual se dá o nome de osso trabecular ou esponjoso, devido ao seu aspecto poroso. Estes poros não se encontram vazios, e neles podemos encontrar a medula óssea, que vem em continuidade da cavidade medular. 1

12 Introdução Continuando na direcção da extremidade do osso, encontramos uma placa de crescimento de cartilagem não mineralizada. Desta forma podemos verificar que existem duas superfícies ósseas que se encontram em contacto com outros tecidos; uma superfície externa denominada periosteal e uma interna chamada de endosteal. É nestas superfícies que podemos encontrar células osteogénicas (ou osteoprogenitoras) organizadas por camadas [Murray 1999]. Figura 1 Regiões nas quais se podem subdividir os ossos longos longos. As setas indicam a localização das regiões indicadas por baixo de cada imagem. (adaptado de Desenvolvimento ósseo O tecido ósseo forma-se sempre a partir de um tecido conjuntivo pré-existente. A sua formação pode ocorrer de duas formas distintas. Quer pela mineralização directa a partir da matriz segregada por osteoblastos, à qual se dá o nome de ossificação intramembranosa, quer por deposição de matriz óssea sobre uma matriz cartilagínea pré-existente (ossificação endocôndrica) [Bloom and Fawcett 1975, Junqueira et al. 1995]. Na via intramembranar, as células embrionárias do mesenquima, existentes no tecido conjuntivo, diferenciam-se em osteoblastos que são as células formadoras de novo osso. O osso formado contém inicialmente apenas fibras de colagénio dispostas irregularmente. Este osso vai depois sofrer um processo de maturação, formando-se então um osso maduro, denominado lamelar devido à sua disposição por camadas. Por outro lado, as partes terminais dos ossos 2

13 Introdução longos sofrem um processo de formação por via endocondral, em que as células mesenquimais se diferenciam em condroblastos. Estas células segregam uma matriz cartilagínea que forma o tecido molde no qual ocorre calcificação Organização celular dentro da matriz óssea Podemos distinguir 4 grupos diferentes de células nos ossos em crescimento: células osteoprogenitoras, osteoblastos, osteocitos e por fim osteoclastos (Figura 2). À excepção dos osteoclastos, esta divisão pode ser encarada como 3 diferentes estados funcionais do mesmo tipo de células. Este processo de alterações morfológicas e funcionais é, ao contrário do processo de diferenciação celular, um processo reversível ao qual é dado por isso o nome de modelação celular [Bloom and Fawcett 1975]. Figura 2 Esquema do processo de remodelação óssea e das células envolvidas neste processo. (adaptado de: i. Osteoblastos Os osteoblastos são as células responsáveis pela produção dos principais constituintes da matriz extracelular. São originárias das células da medula óssea ou do tecido conjuntivo. Estas células precursoras, mediante o estímulo correcto, iniciam a sua proliferação e diferenciação em 3

14 Introdução preosteoblastos. Os osteoblastos nunca actuam isolados, podendo ser encontrados em grupos ao longo da superfície do osso (Figura 3). Estas células caracterizam-se por um núcleo arredondado, e por um proeminente aparelho de Golgi. Podem encontrar-se na superfície óssea, sobre a matriz que estão a produzir, ainda antes desta se encontrar calcificada (a qual é chamada nesta fase de tecido osteóide). A existência deste tecido é uma consequência do intervalo de tempo entre a formação da matriz e a sua posterior calcificação (cerca de dez dias). Uma outra característica marcante dos osteoblastos é a presença de um retículo endoplasmático rugoso extremamente desenvolvido. Sendo responsáveis pela formação da matriz óssea, estas células segregam grandes quantidades de colagénio. Este colagénio organizase para formar estruturas semelhantes a cordas. A estas estruturas é dado o nome de fibras em espiral ou osteóides (o que dá origem ao nome do tecido formado nesta fase tecido osteóide). Os osteoblastos causam a precipitação de sais de cálcio e fósforo a partir do sangue, que se ligam aos osteóides, e iniciam a mineralização do tecido osteóide. Frequentemente também se verifica a presença de ligações entre as células ( Gap junctions ). A membrana plasmática dos osteoblastos é rica em fosfatase alcalina e possui receptores para a hormona da paratiróide. Os osteoblastos também expressam receptores esteróides para estrogénios e vitamina D no núcleo, bem como diversas moléculas de adesão (integrinas) e receptores de citoquinas. Figura 3 Secção de osso, no qual se encontra indicado pelas setas a localização de osteoblastos. (adaptado de ii. Osteócitos A matriz óssea calcificada, embora muito estável, não é metabolicamente inerte. No interior desta matriz podemos encontrar osteócitos, em pequenas lacunas chamadas de lacunas osteocíticas. Estes osteócitos são células derivadas de osteoblastos. 4

15 Introdução A morfologia dos osteócitos varia de acordo com a sua idade e actividade funcional. Um osteócito jovem é morfologicamente semelhante a um osteoblasto, tendo no entanto um visível decréscimo do seu volume celular, bem como o retículo endoplasmático e o aparelho de Golgi menos desenvolvidos. Num osteócito mais maduro, já bastante mais embebido na matriz calcificada (Figura 4), as características referidas anteriormente são ainda mais evidentes, verificando-se ainda uma acumulação de glicogénio no citoplasma [Murray 1999]. O destino dos osteócitos é a fagocitação e digestão, conjuntamente com os restantes componentes do osso quando se dá a reabsorção óssea por parte de osteoclastos. Uma das funções importantes em que estas células podem estar envolvidas é a regulação e activação local dos processos de remodelação óssea [Murray 1999]. Figura 4 Secção de osso, no qual se encontra indicado pelas setas a localização de osteocitos. (adaptado de topics.html) iii. Osteoclastos e a reabsorção óssea Os osteoclastos são as células responsáveis pela reabsorção óssea. São células gigantes que podem conter até 20 núcleos e podem ser encontradas de modo geral em contacto com a matriz calcificada ou dentro de uma lacuna resultante da sua própria actividade de reabsorção (Figura 5). Dentro de cada uma destas lacunas é possível encontrar até cinco osteoclastos, embora geralmente apenas contenham uma ou duas células. A aparência morfológica dos núcleos varia mesmo dentro de uma mesma célula. Alguns são redondos e outros apresentam contornos irregulares, o que poderá reflectir a fusão dessincronizada de percursores mononucleares. O citoplasma apresenta muitos vacúolos e a zona de contacto com o osso é caracterizada pela presença de uma região muito enrugada com densas saliências nas partes laterais. 5

16 Introdução Os osteoclastos apresentam também eles, um complexo de Golgi extremamente desenvolvido, disposto em torno de cada um dos núcleos. São também abundantes as mitocôndrias e as vesículas de transporte. No entanto, a característica mais proeminente dos osteoclastos são as profundas invaginações da membrana plasmática na região em contacto com a matriz calcificada. A região enrugada na área central encontra-se ladeada por um anel de proteínas contrácteis, que tem como função a ligação da célula à superfície do osso, permitindo desta forma selar a área de reabsorção, também chamada de compartimento da reabsorção. Figura 5 Secção de osso, no qual se encontra indicado pelas setas a localização de osteoclastos. (adaptado de Tecido ósseo em peixes teleósteos Embora a origem dos tecidos ósseos nos peixes seja complexa, pode ser dividida em dois grupos principais, derivados dos tipos de ossificação. A ossificação intramembranar forma-se na ausência de uma matriz cartilagínea pré-existente, e as ossificações paracondrais, pericondrais e endocondrais formam-se pela mineralização das cartilagens [Junqueira et al. 1995]. A ossificação intramembranosa dá origem ao dermoesqueleto dos peixes a partir de diferenciação da superfície externa da sua epiderme [Francillon-Vieillot et al. 1975]. O endoesqueleto dos peixes teleósteos é bastante robusto e leve. O seu desenvolvimento, ao contrário do exoesqueleto, é em grande parte originado por mineralização de cartilagem [Franceschi et al. 1988]. 6

17 Introdução Nos peixes teleósteos existem sobretudo dois tipos de ossos: Osso celular (osteocítico): Tal como o nome sugere, este tipo de osso possui células. Neste caso, as células formadoras de novo tecido ósseo, os osteoblastos, à medida que vão formando a matriz óssea ficam encerrados na mesma, diferenciando-se em osteócitos que permanecem fisiologicamente activos em cavidades periosteociticas interligadas através de extensões citoplasmáticas, que passam através de minúsculos canais ósseos denominados canaliculi (Figura 6) [Parenti 1986, Weiss and Watabe 1979]. Figura 6 Nesta Figura podemos observar uma parte de uma secção de um osso osteocitico. (Adaptado de BoneRemodeling.html) Osso acelular (anosteocítico): Neste osso, os osteoblastos deslocam-se ao mesmo tempo que a frente de mineralização, nunca ficando encerrados no seu interior. Em alternativa, este tipo de osso pode enclausurar os osteoblastos na matriz óssea, no entanto estes acabam por diminuir de volume e morrer ainda antes da mineralização ocorrer [Moss 1965]. O osso celular é característico dos teleósteos inferiores, e o osso acelular surge nos teleósteos superiores, como uma evolução, ao contrário do que se poderia supor [Gavaia 1997, Parenti 1986, Weiss and Watabe 1979] Composição molecular da matriz A composição das estruturas ósseas permitem-lhes desempenhar o seu papel mecânico de protecção e de regulação da homeostase. Embora esta composição esteja dependente de diversos factores tais como a idade, a localização anatómica e a dieta, de modo geral o osso possui 50 a 70% de mineral, a matriz proteica constitui entre 20 a 40%, apenas existindo 5 a 10% de água e menos de 3% de constituintes lipídicos. O mineral que se encontra nos ossos contém muitas impurezas, sendo muito poroso e de estrutura cristalina muito irregular. Estas características tornam-no mais solúvel, permitindo que este actue como um reservatório de cálcio, fosfato e iões de magnésio. 7

18 Introdução A matriz óssea é formada por fibras de colagénio, sobretudo do tipo I (90%). Os cristais de hidroxiapatite (Ca 10 (PO 4 ) 6 ).(OH) 2 intercalam-se por entre as fibras de colagénio. No entanto na matriz óssea encontram-se muitas proteínas não colagénicas, recentemente purificadas e sequenciadas, contudo a sua função até agora apenas se encontra parcialmente caracterizada. A grande maioria destas proteínas são sintetizadas pelas células que formam os ossos, os osteoblastos, no entanto existem proteínas que são preferencialmente absorvidas pela matriz óssea sendo sintetizadas noutros tecidos tais como o fígado. i. Colagénio A unidade de construção básica da rede de fibras da matriz óssea é o colagénio do tipo I (Figura 7). Trata-se de uma molécula em hélice tripla que contem duas cadeias idênticas α1 e uma outra cadeia que embora estruturalmente seja semelhante, possui uma sequência distinta (α2). As cadeias polipeptidicas de colagénio caracterizam-se por possuírem uma subsequência repetitiva Gly-X-Y em que X é de modo geral uma prolina e em que se verificam diversas modificações pós-tradução tais como hidroxilações de certos resíduos de prolina ou lisinas, glicosilações de lisinas ou hidroxilisinas com glucose e/ou galactose e também formação de ligações covalentes intra e intermoleculares. A análise do nível destas ligações das proteínas de colagénio presentes na urina, dá-nos uma boa indicação do nível de reabsorção óssea que está a ocorrer. Figura 7 Esquema de uma molécula de colagénio A cadeia polipeptidica simples B Modelo no espaço da cadeia C Conformação em hélice tripla característica do colagénio com os resíduos de glicina no interior da hélice (D a cor vermelha). (adaptado de: ii. Proteínas não-colagénicas Constituem 10 a 15% do total de teor proteico da matriz óssea, das quais cerca de um quarto são provenientes de outros tecidos. Uma grande fracção destas proteínas exógenas são proteínas do soro tais como albumina e α2-hs-glicoproteina, que por terem um carácter ácido 8

19 Introdução conseguem ligar à matriz devido à sua grande afinidade com os cristais de hidroxiapatite. Embora não sejam provenientes do próprio tecido ósseo, podem exercer efeitos na mineralização da matriz extracelular, sendo que à α2-hs-glicoproteina (fetuina nos humanos) é atribuída uma função de regulação da proliferação das células ósseas. As restantes proteínas exógenas são sobretudo factores de crescimento e uma grande variedade de proteínas presentes encontram-se apenas em quantidades vestigiais. Um dos marcos mais importantes na formação óssea é a síntese de elevados níveis de fosfatase alcalina. Esta proteína tem como função fornecer fosfato inorgânico (Pi) para a formação dos cristais de hidroxiapatite Encontra-se primeiramente ligada à superfície celular através de uma ligação por fosfoinositol. Esta ligação pode mais tarde ser clivada encontrando-se desta forma fosfatase alcalina na matriz extracelular. Quanto às proteínas endógenas, podem ser agrupadas em 3 áreas principais: proteoglicanos; proteínas glicosiladas e por fim as proteínas γ-carboxiladas. Proteoglicanos Proteoglicanos são macromoléculas que contém pelo menos uma cadeia lateral acídica de um polissacarídeo ligada a um centro proteico. Estas proteínas podem ser encontradas tanto dentro das células, à sua superfície ou mesmo na matriz extracelular. Na matriz óssea podemos encontrar algumas proteínas pertencentes a esta família, tais como o biglicano e a decorina. O biglicano pode ser muitas vezes encontrado ligado à superfície de células em diferenciação e pensa-se que poderá estar envolvido no processo de crescimento e desenvolvimento do esqueleto, uma vez que julga que o sindroma de Happle, que se caracteriza por indivíduos de baixa estatura, poderá ser devido a um defeito no gene desta proteína [Traupe et al. 1992]. O biglicano também possui interacções com o colagénio do tipo I [Boskey et al. 1997b, Schonherr et al. 1995a, Schonherr et al. 1995b, Traupe et al. 1992]. A decorina pode ser encontrada em muitos tecidos conjuntivos, embora tenha sido inicialmente isolada de cartilagem e osso [Fisher et al. 1983, Rosenberg et al. 1985]. Foi proposto que esta proteína possa actuar como um ligando bidentado, que liga duas moléculas vizinhas de colagénio, auxiliando a estabilização das fibras [Scott 1996]. Foi também sugerido, que possa participar na regulação da espessura das fibras de colagénio [Vogel et al. 1984], no entanto, um dos papéis mais importantes desta proteína poderá envolver a regulação da divisão celular e sua diferenciação, uma vez que o seu núcleo proteico liga o TGFβ [Yamaguchi 9

20 Introdução et al. 1990] e é capaz de neutralizar o efeito de estímulo ao crescimento provocado por este factor [Ruoslahti and Yamaguchi 1991] Glicoproteinas Uma das glicoproteinas mais abundante, produzida pelas células ósseas é a osteonectina. A sua função no osso está relacionada sobretudo com o crescimento e proliferação dos osteoblastos bem como a mineralização da matriz extracelular. Existem outras glicoproteinas encontradas na matriz tais como a tetranectina e a tenascina, no entanto o seu papel ainda é desconhecido. As células ósseas sintetizam pelo menos nove proteínas que poderão estar envolvidas nos processos de ligação das células a matriz mineralizada. Estas glicoproteinas têm em comum a presença de uma sequência, denominada RGD, pois possui os resíduos Arg-Gly-Asn, e que representa a sequência de ligação à classe de integrinas da superfície celular. Dentro deste grupo, encontram-se a fibronectina, fibrilina, osteopontina, sialoproteina óssea, entre outras. Embora se saiba que, por exemplo, a osteopontina é capaz de ancorar os osteoclastos ao osso, a função da grande maioria destas proteínas é ainda desconhecida uma vez que ainda não se detectaram quaisquer tipos de defeitos esqueléticos causados pela ausência de qualquer uma destas proteínas. Proteínas com resíduos de ácido glutâmico γ-carboxilados Incluem-se neste grupo diversas proteínas tais como a BGP (bone Gla protein), mais conhecida por osteocalcina, e a MGP (matrix Gla protein), bem como diversas proteínas, a grande maioria relacionadas com a via de coagulação sanguínea, tais como a protrombina e os factores de coagulação VII, IX, X, Z. As duas primeiras são encontradas dos tecidos ósseos e as restantes são essencialmente produzidas pelo fígado. Caracterizam-se por sofrerem modificações pós-tradução pela acção de γ-carboxilases dependentes de vitamina K, que modificam resíduos de ácido glutâmico em resíduos Gla por γ-carboxilação. Estes resíduos modificados (Figura 8) conferem uma elevada afinidade destas proteínas aos iões de cálcio, fosfato e cristais de hidroxiapatite. 10

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