UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

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1 UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ MARCEL ANDRIGO MAIA AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES PSICOFARMACOLÓGICAS DO EXTRATO ETANÓLICO OBTIDO DAS FOLHAS DE Piper cernuum: ÊNFASE NA ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA Itajaí 2016

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3 UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS MARCEL ANDRIGO MAIA AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES PSICOFARMACOLÓGICAS DO EXTRATO ETANÓLICO OBTIDO DAS FOLHAS DE Piper cernuum: ÊNFASE NA ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientação: Profa. Dra. Márcia Maria de Souza Co-orientação: Profa. Dra. Ângela Malheiros Itajaí, setembro de 2016

4 FICHA CATALOGRÁFICA M28a Maia, Marcel Andrigo, Avaliação das propriedades psicofarmacológicas do extrato etanólico obtido das folhas de piper cernuum [Manuscrito] : ênfase na atividade antidepressiva / Marcel Andrigo Maia f. : il. : 30 cm.. Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas Área de Concentração em Produtos naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Orientadora: Profª. Drª Márcia Maria de Souza ; Co-orientadora: Prof. Dra. Ângela Malheiros. Bibliografia: f Inclui: Gráficos. 1. Depressão mental. 2. Pariparoba plantas medicinais. 3. Antidepressivos. 4. Extratos vegetais uso terapêutico. I. Souza, Márcia Maria de. II. Malheiros, Ângela. II. Título. CDU: Claudia Bittencourt Berlim CRB 14/963

5 AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADEDES PSICOFARMACOLÓGICAS DO EXTRATO ETANÓLICOOBITIDO DAS FOLHAS DE Piper cernuum: ÊNFASE NA ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA Marcel Andrigo Maia Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí. Márcia Maria de Souza, Dra Orientadora Clóvis Antonio Rodrigues, Dr Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores: Dra Márcia Maria de Souza Presidente Dra Ângela Malheiros (UNIVALI) Co-orientadora Dr Sérgio Faloni de Andrade (UNIVALI) Membro Dra Fátima de Campos Buzzi (UNIVALI) Membro Dra Ana Lúcia Bertarello Zeni (FURB) Membro Itajaí (SC), setembro de 2016

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7 Dedico esse trabalho as duas pessoas mais importantes em minha vida, exemplo de seres humanos, os quais são responsáveis pelo que sou hoje e serei amanhã, meus pais que amo muito, Adelci e José.

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9 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente aos meus pais Adelci e José, sempre me apoiando nos momentos difíceis, sempre com uma palavra de apoio e incentivo. Tenho muito orgulho de tê-los como referência em minha vida, e tudo que faço é para que sintam orgulho de mim. Aos meus irmãos Francielli e Rodrigo, pelo apoio e companheirismo. E sem dúvida alguma, não posso deixar de agradecer a minha amada Mariana, que juntos tivemos a coragem necessária para abandonar a nossa vida tranquila, e arriscar a alcançar um dos nossos objetivos que tínhamos em comum, que era o mestrado. Só nós sabemos as dificuldades que passamos as noites mal dormidas, a saudade de nossas famílias, o pouco tempo que tivemos para ficarmos juntos, mas sempre focando no que queríamos. Agradeço a Deus por ter colocado você em meu caminho, te amo muito e obrigado por estar aqui comigo. A professora Márcia Maria de Souza, que me acolheu no momento em que cheguei aqui, perdido, sem projeto, sem nem saber o que fazer, mas conforme foi passandoo tempo fomos nos conhecendo e tudo foi se encaminhando. Obrigado por todo o conhecimento que me passou, e tenha certeza que será de grande valia para o meu futuro. Agradeço também a pós doc Luísa Mota, que me ajudou imensamente na parte bioquímica e em tantas outras do meu trabalho. Sou muito grato por todo o tempo que esteve disponível para mim no laboratório, e tenha certeza que aprendi muito. Agradeço a Jocilene Jurcevic, primeiramente por me familiarizar com os modelos animais, e segundo, por me fornecer o extrato da Piper cernumm para seguir o trabalho. Aos meus colegas da iniciação científica Camila Cazarin, Camila do Espírito Santo e o Lucas que sempre estiveram no laboratório me ajudando, meu muito obrigado. Agradeço a todos que de alguma forma estiveram ao meu lado, meu muito obrigado.

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11 Você nunca sabe que resultados virão da sua ação. Mas se você não fizer nada, não existirão resultados. Mahatma Gandhi

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13 AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES PSICOFARMACOLÓGICAS DO EXTRATO ETANÓLICO OBTIDO DAS FOLHAS DE Piper cernuum: ÊNFASE NA ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA Marcel Andrigo Maia Setembro/2016 Orientadora: Márcia Maria de Souza, Dra. Co-orientadora: Ângela Malheiros, Dra. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas. Número de Páginas: 161 p. A depressão é considerada uma das principais doenças do sistema nervoso central (SNC), e apresenta como principais sintomas humor deprimido, anedonia e retardo psicomotor. Vários fatores podem estar envolvidos na fisiopatologia dos processos depressivos, dentre eles os genéticos, ambientais e neuroquímicos. Em trabalhos anteriores conduzidos em nossos laboratórios verificou-se que a Piper cernuum conhecida popularmente como Pariparoba, João-guarandi-do-grado e Pimentade-Morcego, apresentou atividade tipo-antidepressiva em experimentos preliminares. Dando continuidade nesse estudo investigou-se as propriedades psicoativas da planta em diversos modelos farmacológicos in vivo, além de avaliar o possível mecanismo de ação da propriedade antidepressiva. Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas (25-30 g) de 3 meses os quais foram tratados com o extrato etanólico de Piper cernuum (EEPC/50, 100 e 150 mg/kg, v.o) e controles (negativo e positivo) e submetidos a avaliação das propriedades psicoativas em diferentes modelos animais. Para avaliação da atividade locomotora (teste de campo aberto/tca); atividade anticonvulsivante (teste do pentilenotetrazol/ptz e da estricnina/estric); atividade hipnótica (modelo de indução do sono por barbitúricos/msb); atividade nootrópica (modelo da esquiva inibitória/mei); atividade ansiolítica (labirinto em cruz elevado/lce) e atividade antidepressiva (teste do nado forçado/tnf e teste de suspensão pela cauda/tsc). Para o estudo do mecanismo de ação da atividade antidepressiva o modelo de depressão adotado foi o TNF, onde investigou-se a influência dos sistemas serotonérgico, noradrenérgico, dopaminérgico, glutamatérgico, oxidonitrérgico, GABAérgico e opióide sobre a ação do EEPC (50 mg/kg, v.o.). Também foi avaliado o tempo de ação da propriedade tipo-antidepressiva do EEPC e seu efeito quando administrado subcronicamente. Em modelos in vitro foi avaliado a capacidade antioxidante do EEPC pelo método de DPPH. Em modelos ex vivo foi avaliado seu efeito sobre a atividade das enzimas glutationa reduzida (GSH); superóxido dismutase (SOD); catalase (CAT); glutationa peroxidase (GPx); glutationa-s-transferase (GST), bem como sua ação sobre a lipoperoxidação (LPO), a monoaminooxidase-a (MAO-A) e a influência sobre a atividade do óxido nítrico (NO). O tratamento com EEPC (50, 100, 150 mg/kg) não alterou a performance motora dos animais, e nem exibiu efeito anticonvulsivante tanto de forma aguda como subcrônica (14 dias) nas convulsões induzidas por PTZ ou ESTRIC. O EEPC (100 e 150 mg/kg) apresentou efeito hipnótico, mas não exibiu efeito nootrópico ou ansiolítico. O efeito tipo-antidepressivo foi observado no tratamento agudo no TSC e agudo e subcrônico no TNF, tendo essa atividade duração de até 4 horas. Quando investigado os sistemas neurotransmissores e/ou receptores farmacológicos envolvidos no efeito tipo-antidepressivo do EEPC,

14 verificou-se que seu efeito foi revertido com o pré-tratamento com reserpina (4 mg/kg, um inibidor do transportador vesicular das monoaminas), NAN-190 (0,5 mg/kg, antagonista dos receptores serotonérgicos 5-HT1A), ondansetrona (0,5 mg/kg, antagonista dos receptores serotonérgicos 5-HT3), prazosin (1 mg/kg, antagonista α1-adrenérgico), haloperidol (0,2 mg/kg, antagonista dopaminérgico não seletivo), pimozide (0,2 mg/kg, antagonista dopaminérgico D2), SCH23390 (0,05 mg/kg, antagonista dopaminérgico D1), L-arginina (750 mg/kg, precursor do óxido nítrico), L-NAME (10 mg/kg, inibidor inespecífico das óxido nítrico sintases (NOS), 7- NI (25 mg/kg, inibidor da NOS neuronal), azul de metileno (20 mg/kg, inibidor da NOS e da guanilato ciclase solúvel (GCs), sildenafil (5 mg, i.p., inibidor PDE-5), bicuculina (1 mg/kg, antagonista dos receptores GABA-A). E ocorreu um sinergismo entre EEPC e a quetamina (0,1 mg/kg, antagonista não competitivo do receptor NMDA). O EEPC apresentou atividade antioxidante pelo método de DPPH. Com relação ao sistema de oxidação enzimática verificou-se que houve diminuição das atividades da CAT, GPx, GST e aumento na atividade da GSH. O EEPC não alterou a LPO. A atividade da MAO-A e do NO também foi diminuída pelo tratamento com EEPC. Os resultados em conjunto sugerem que o EEPC exibe atividade antidepressiva e hipnótica. Porém não apresenta atividade ansiolítica e anticonvulsivante. O tratamento com EEPC não afeta a performance motora dos animais nem a memória dos mesmos. O efeito tipo antidepressivo do EEPC é duradouro e não altera-se com o uso subcrônico. O mecanismo de ação do efeito tipo-antidepressivo dos EEPC parece envolver os sistemas das monoaminas (5-HT, NA e DA), a via oxidonitrérgica, glutamatérgica e GABAérgica. Além de inibir o estresse oxidativo e a atividade da enzima MAO. Os resultados apontam o EEPC como potencial alvo para a terapêutica da depressão. Palavras-chave: Piper cernuum, depressão, mecanismo de ação antidepressivo.

15 EVALUATION OF THE PSYCOPHARMACOLOGICAL PROPERTIES OF ETHANOLIC EXTRACT OF LEAVES OF Piper cernuum: EMPHASIS ON ANTIDEPRESSANT ACTIVITY Marcel Andrigo Maia September/2016 Supervisor: Dr. Márcia Maria de Souza. Co-supervisor: Dr. Ângela Malheiros. Area of Concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of Pages: 161 p. Depression is considered one of the main disorders of the central nervous system (CNS). Its main symptoms are depressive mood, anhedonia and psychomotor retardation. Several factors may be involved in the pathophysiology of depressive processes, including genetic, environmental and neurochemical factors. In previous studies conducted in our laboratory, we found that Piper cernuum, popularly known as "Pariparoba", "João-guarandi-do-grado" and "Pimenta-de-morcego" in Brazil, presented potential antidepressant in preliminary experiments. Continuing this study, we investigated the psychoactive properties of the plant in several in vivo pharmacological models, and evaluated the possible mechanism of action of its antidepressant property. Three-month old female Swiss mice (25-30 g) were used in the study. The mice were treated with ethanolic extract of Piper cernuum (EEPC/50, 100 and 150 mg/kg, by the oral route) and controls (positive and negative), then the psychoactive properties were evaluated in different animal models. The following activities were evaluated: locomotor activity (open field test/tca); anticonvulsant activity (pentylenetetrazol test/ptz and strychnine/estric); hypnotic activity (sleepinducing model barbiturates/msb); nootropic activity (memory test inhibitory avoidance/mei); anxiolytic activity (elevated plus maze/lce) and antidepressant activity (forced swimming test/tnf) and tail suspension test/tsc). To study the mechanism of action of antidepressant activity, the depression model adopted was TNF, in which we investigated the influence of the serotonergic, noradrenergic, dopaminergic, glutamatergic, oxidonitrergic, GABAergic and opioid systems on the action of EEPC (50 mg/kg). We also assessed the duration of the action of the antidepressant property of EEPC, and its effect when used subchronically. In vitro models, free radical scavenging activity of EEPC was evaluated by the DPPH method. In ex vivo models, its effect on reduced activity of gluthione enzymes (GSH); superoxide dismutase (SOD); catalase (CAT); glutathione peroxidase (GPx); and glutathione-s-transferase (GST) was evaluated, as well as its action on lipid peroxidation (LPO); on enzyme monoamine oxidase-a (MAO-A), and the influence on the activity of nitric oxide (NO). Treatment with EEPC (50, 100, 150 mg/kg) did not alter the motor performance of the animals, neither did it exhibit anticonvulsant effect, whether in acute or subchronic form (14 days) in PTZ or STRIC induced seizures. EEPC (100 and 150 mg/kg ) had hypnotic effect, but did not exhibit nootropic or anxiolytic effect. Antidepressant-like effect was observed in acute treatment in TSC, and acute and subchronic in TNF, and this activity lasted for up to 4 hours. When investigating the neurotransmitter systems and/or pharmacological receptors involved in the antidepressant effect of EEPC, it was demonstrated that its antidepressant-like effect was reversed by pretreatment of mice with reserpine (4 mg/kg, an vesicular

16 monoamine carrier inhibitor), NAN-190 (0.5 mg/kg, of antagonist serotonergic 5- HT1A), ondansetron (0.5 mg/kg, antagonist serotonergic 5-HT3), prazosin (1 mg/kg, α1 adrenergic antagonist), haloperidol (0.2 mg/kg, nonselective dopamine antagonist), pimozide (0.2 mg/kg, dopaminergic D2 antagonist), SCH23390 (0.05 mg/kg, dopamine D1 antagonist), L-arginine (750 mg/kg, precursor to nitric oxide), L- NAME (10 mg/kg, nonspecific inhibitor of NO synthase nitric oxide), 7-NI (25 mg/kg, of inhibitors NOS neuronal), blue methylene (20 mg/kg, a NOS and GCs inhibitor), sildenafil (5 mg, i.p., a PDE-5 inhibitor), and bicuculline (1 mg/kg, a GABA receptor antagonist). There was synergy between EEPC and ketamine (0.1 mg/kg, noncompetitive NMDA receptor antagonist). EEPC demonstrated antioxidant activity by the DPPH method. With regard to the effects of EEPC on the enzymatic oxidation system, it was found that there was a decrease in the activities of CAT, GPx, GST, an increase in the GSH, and no change in LPO. MAO-A and NO activity was also decreased with EEPC treatment. Taken together, the results suggest that EEPC displays antidepressant and hypnotic activity. However, it does not present anxiolytic and anticonvulsant activity. The motor performance and memory of the animals treated with EEPC was not affected. The antidepressant-like effect of EEPC is longlasting, and does not change with subchronic use. The mechanism of action of the antidepressant-like effect of EEPC appears to involve the monoamines (5-HT, and NOR, DA) systems, the oxidonitregic, glutamatergic and GABAergic pathways. It also inhibited oxidative stress and MAO-A enzyme activity. The results show the potential of EEPC as a possible target for depression therapy. Keywords: Piper cernuum, depression, antidepressant mechanism of action.

17 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Teoria monoaminérgica da depressão Figura 2. Síntese do NO Figura 3. Mercado mundial de medicamentos fitoterápicos Figura 4. Artigos científicos publicado por brasileiros entre os períodos de 1987 e Figura 5. Partes aéreas da Piper cernuum Figura 6. Estrutura química do trans-dihidroagarofurano, αβ-cubebina Figura 7. Partes do SNC de camundongos utilizadas para obtenção das amostras Figura 8. Efeito do EEPC (50, 100 e 150 mg/kg, v.o) sobre os parâmetros locomotores dos animais submetidos ao TCA Figura 9. Efeito do EEPC sobre as convulsões induzidas por PTZ e estricnina Figura 10. Efeito do tratamento com EEPC (50,100 e 150 mg/kg) sobre o sono induzido por barbitúrico Figura 11. Efeito do tratamento do EEPC sobre a memória dos animais submetidos ao MEI Figura 12. Efeito do tratamento do EEPC (50,100 e 150 mg/kg) e diazepam (0.75 mg/kg) sobre parâmetros comportamentais de animais submetidos ao modelo de ansiedade, o teste do labirinto em cruz elevado Figura 13. Efeito tipo antidepressivo do EEPC e imipramina através do TNF Figura 14. Efeito do tratamento com EEPC (50, 100 e 150 mg/kg) e imipramina (30 mg/kg) em animais submetidos ao TSC Figura 15. Efeito tipo-antidepressivo com o tratamento sub-crônico do EEPC (50 mg/kg) e fluoxetina (10 mg/kg) em camundongos submetidos ao TNF Figura 16. Tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do EEPC (50 mg/kg) em animais submetidos ao TNF Figura 17. Efeito tipo-antidepressivo do tratamento da αβ-cubebina e do transdihidroagarofurano em camundongos submetidos ao TNF Figura 18. Efeito da reserpina sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Figura 19. Efeito do PCPA, NAN-190, ondansetrona e ketanserina, na atividade tipoantidepressivo do EEPC no TNF

18 Figura 20. Influência da ioimbina e prazosin no efeito tipo-antidepressivo do EEPC (50 mg/kg, v.o.) Figura 21. Influência do haloperidol, pimozide e SCH23390 no efeito tipoantidepressivo do EEPC Figura 22. Influência da quetamina e NMDA no efeito tipo-antidepressivo do EEPC Figura 23. Influência dos tratamentos com L-arginina, L-NAME, 7-NI, azul de metileno e sildenafil sobre o efeito tipo-antidepressivo do EEPC Figura 24. Influência da bicuculina e faclofeno no efeito tipo-antidepressivo do EEPC Figura 25. Influência da naloxona e naltrindol no efeito tipo-antidepressivo do EEPC Figura 26. Efeito antioxidante do EEPC, através da atividade sequestradora do radical livre DPPH Figura 27. Efeito da administração do EEPC sobre os npiveis da GSH Figura 28. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da enzima SOD Figura 29. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da enzima CAT Figura 30. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da enzima GPx Figura 31. Efeito da administração do EEPC sobre a enzima GST Figura 32. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da LPO Figura 33. Efeito da administração do EEPC sobre os níveis da enzima MAO-A Figura 34. Efeito da administração do EEPC através dos níveis de NO

19 LISTA DE ABREVIATURAS 5-HT = serotonina 7-NI = 7-nitroindazol a.c = antes de Cristo ACTH = hormônio adrenocorticotrófico AMPA = ácido α-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiônico ATC = ácido tricloroacético ATP = trifosfato de adenosina Bcl-2 = proteína anti-apoptótica BDNF = fator neurotrófico derivado do cérebro BHT = butil hidróxi tolueno CAT = catalase CDNB = 1-cloro-2,4 dinitrobenzeno CoQH 2 = citocromo C redutase DA = dopamina DCFH = diclorofluoresceína DMSO = dimetilsulfóxido DPPH = 2,2-difenil-1-picrilhidrazil DSM-V = Manual Estatístico e Diagnóstico de Transtornos Mentais DTNB = 5,5 -ditiobis 2-ácido nitrobenzóico EEPC = extrato etanólico de Piper cernuum enos = óxido nítrico sintase endotelial EPM = erro padrão médio EROs = espécies reativas de oxigênio ESTRIC = estricnina GABA = ácido gama-aminobutírico GCs = guanilato ciclase solúvel GLU = glutamato GMPc - monofosfato cíclico de guanosina GPx = glutationa peroxidase GSH = glutationa reduzida GST = glutationa-s-transferase GTP = guanosina trifosfato

20 HPA = hipotálamo-pituitária-adrenal i.c.v. = intracérebroventricular i.p. = intraperitonial IMAO = inibidores da monoaminoxidase inos = óxido nítrico sintase induzível ISRN inibidores seletivos da recaptação da noradrenalina ISRS = inibidores seletivos da recaptação da serotonina LCE = labirinto em cruz elevado L-NAME= N-nitro-L-arginina metil éster LPO = lipoperoxidação MAO = monoaminoxidase MEI = teste de memória a esquiva inibitória MSB = modelo de sono induzido por barbitúrico NA = noradrenalina NADPH = fosfato dinucleótideo adenina nicotinamida NMDA = N-metil-D-aspartato nnos = óxido nítrico sintase neuronal NO = óxido nítrico NOS = óxido nítrico sintase OMS = Organização Mundial da Saúde PCPA = paraclorofenilalanina PDE-5 = fosfodiesterase-5 PKG = proteínas quinases dependentes de GMPc PTZ = pentilenotetrazol SNC = Sistema Nervoso Central SOD = superóxido dismutase TCA = teste de campo aberto TNF = teste do nado forçado TNFα = fator de necrose tumoral TRIS = hidroximetilaminometano TSC = teste de suspensão pela cauda v.o. = via oral ZSG = zona subgranular ZSV = zona subventricular

21 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO OBJETIVOS Objetivo Geral: Objetivos Específicos: REVISÃO DA LITERATURA Depressão: aspectos gerais Neuroquimica da depressão Teoria monoaminérgica Glutamato e Depressão Envolvimento da via L-arginina-NO-GMPc na depressão Via GABAérgica e depressão Envolvimento da via opióide na depressão Estresse oxidativo e depressão Envolvimento da atividade da enzima MAO na depressão Neurogênese e depressão Plantas medicinais com atividades antidepressivas Da planta em estudo: Piper cernuum Compostos presentes na Piper cernuum: αβ-cubebina e o transdihidroagarofurano MATERIAIS E MÉTODOS Material Preparação do extrato Substâncias utilizadas e vias de administração Métodos Avaliação farmacológica in vivo Animais Avaliação do EEPC sobre o sistema motor dos animais através do modelo de deambulação - Teste de Campo Aberto (TCA) Avaliação dos efeitos do EEPC sobre as convulsões induzidas por PTZ Avaliação dos efeitos do EEPC sobre as convulsões induzidas quimicamente por ESTRIC... 62

22 Avaliação do efeito do EEPC sobre o sono induzido por barbitúrico (MSB) Avaliação do efeito do EEPC sobre a memória através do modelo da esquiva inibitória (MEI) Avaliação do efeito do EEPC sobre a ansiedade dos animais através do modelo de labirinto em cruz elevado (LCE) Avaliação da atividade tipo-antidepressiva do EEPC através do TNF Avaliação do efeito antidepressivo do EEPC através do Teste de Suspensão pela Cauda (TSC) Avaliação do efeito tipo-antidepressivo do EEPC através do tratamento sub-crônico dos animais Avaliação do tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do EEPC (Time course) Avaliação da atividade tipo-antidepressiva dos compostos isolados presentes na Piper cernuum, αβ-cubebina e o trans-dihidroagarofurano Determinação do mecanismo de ação da atividade antidepressiva do EEPC Avaliação da influência da reserpina sobre a atividade tipoantidepressiva do EEPC Avaliação da influência do sistema serotonérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Avaliação da influência do sistema noradrenérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Avaliação da influência do sistema dopaminérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Avaliação da influência do sistema glutamatérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Avaliação da influência da via L-arginina-NO-GMPc sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Avaliação da Influência do sistema GABAérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Avaliação da Influência do sistema opióide sobre a atividade tipoantidepressiva do EEPC Modelos bioquímicos: Avaliação de parâmetros oxidativos... 69

23 Preparação das amostras Mensuração da concentração de proteínas Avaliação da atividade sequestradora do radical livre 2,2-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) Quantificação dos níveis de GSH Determinação da atividade enzimática da SOD Quantificação da atividade da enzima CAT Quantificação dos níveis da atividade da enzima GPx Determinação da atividade da atividade da GST Quantificação da lipoperoxidação (LPO) Quantificação dos níveis da atividade da enzima MAO-A Quantificação da atividade do NO Análise estatística RESULTADOS Efeito na atividade locomotora do EEPC através do TCA em camundongos Avaliação da atividade tipo-anticonvulsivante aguda e sub-crônica do EEPC, nos modelos do PTZ e estricnina Avaliação da atividade tipo-hipnótica do EEPC sobre o sono induzido por barbitúrico em camundongos Avaliação da atividade tipo-nootrópica do EEPC (50,100 e 150 mg/kg) sobre a memória de animais avaliados através do MEI Avaliação da atividade tipo-ansiolítica do EEPC (50,100 e 150 mg/kg) sobre parâmetros de animais submetidos ao modelo de ansiedade, o LCE Avaliação da atividade tipo-antidepressiva do EEPC Efeito tratamento com EEPC (50,100 e 150 mg/kg) e imipramina (30 mg/kg) em animais submetidos ao TNF Efeito do tratamento com EEPC (50, 100 e 150 mg/kg) e imipramina (30 mg/kg) submetidos ao TSC Avaliação da atividade tipo-antidepressiva do EEPC em o tratamento subcrônico Avaliação do tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do EEPC (Time course) Avaliação do efeito tipo-antidepressivo da αβ-cubebina e do transdihidroagarofurano em animais submetidos ao TNF...85

24 5.9 Avaliação do sistema monoaminérgico sobre a atividade tipoantidepressiva do EEPC Influência da reserpina no efeito tipo-antidepressivo do EEPC Avaliação do sistema serotonérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Influência dos tratamentos com PCPA, NAN-190, ondansetrona e ketanserina, sobre o efeito tipo-antidepressivo do EEPC em camundongos submetidos ao TNF Avaliação do sistema noradrenérgico sobre a atividade tipoantidepressiva do EEPC Influência da ioimbina e do prazosin na atividade tipo-antidepressiva do EEPC Avaliação do sistema dopaminérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Influência do haloperidol, pimozide e SCH23390 no efeito tipoantidepressivo do EEPC em animais submetidos ao TNF Avaliação do sistema glutamatérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Influência da quetamina e NMDA no efeito tipo-antidepressivo do EEPC em animais submetidos ao TNF Avaliação da via L-arginina-NO-GMPc sobre a atividade tipoantidepressiva do EEPC Influência dos tratamentos com da L-arginina, L-NAME, 7-NI, azul de metileno e sildenafil no efeito tipo-antidepressivo do EEPC através do TNF Avaliação do sistema GABAérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Influência da bicuculina e faclofeno no efeito tipo-antidepressivo do EEPC em animais submetidos ao TNF Avaliação do sistema opióide sobre a sobre a atividade tipoantidepressiva do EEPC Influência da naloxona e do naltrindol no efeito tipo-antidepressivo do EEPC através do TNF via receptores opióides Modelos bioquímicos: Estresse Oxidativo Avaliação da atividade sequestradora do radical livre (DPPH)

25 Quantificação da atividade da GSH Quantificação da atividade da enzima SOD Avaliação da atividade da enzima CAT Quantificação da atividade da enzima GPx Quantificação da atividade da enzima GST Quantificação da atividade da LPO Quantificação dos níveis da enzima MAO-A Quantificação dos níveis de NO DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXO PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS CEUA/UNIVALI

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27 27 1 INTRODUÇÃO A depressão é um transtorno mental que afeta a população mundial indiferentemente da classe social a qual o indivíduo pertença. A depressão maior (forma de depressão mais expressiva na população) apresenta como principais características as alterações de humor, baixa autoestima, distúrbios do sono, prejuízo nas funções cognitivas, psicomotoras e sociais, podendo até mesmo culminar no suicídio (TANTI; BELZUNG, 2010). O índice desse transtorno é altamente prevalente, sendo uma das reclamações mais comuns em serviços de atenção primária. Além disso, é uma das formas de doença mental que mais compromete a qualidade de vida dos pacientes, sendo considerada a principal causa de incapacidade dentre as desordens neuropsiquiátricas (ROSENBAUM et al., 2016). A depressão afeta 5% da população mundial, ou seja, mais de 350 milhões de pessoas, de todas as faixas etárias, apresentando maior incidência em mulheres. E, estudos longitudinais sugerem que a incidência da depressão aumente para 41% na população mundial até o ano de 2020 (MOFFITT et al., 2010; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2016). A dificuldade em fazer um diagnóstico preciso, e o alcance de melhores resultados nos tratamentos dos pacientes depressivos se deve ao fato de que a fisipatologia da depressão maior permanece obscura. A partir do momento que for elucidado os processos envolvidos na etiologia da doença, poder-se-á direcionar tratamentos mais específicos para cada indivíduo, estabelecendo dessa forma, resultados mais satisfatórios aos pacientes (NESSE; STEIN, 2012). Em termos fisiopatológicos, estudos sugerem que morfologicamente ocorre uma atrofia e alteração no volume de algumas regiões cerebrais de pacientes depressivos como o hipocampo e o prosencéfalo e, também alguns sistemas cerebrais apresentam alterações importantes (KRISHNAN; NESTLER, 2008; SERAFINI et al., 2014). Várias vias de sinalização intracelular que regulam a neuroplasticidade também estão alteradas, por exemplo, ocorre alterações nos sistemas das monoaminas, como a serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT), noradrenalina (NA) e dopamina (DA) havendo uma diminuição desses neurotransmissores na fenda sináptica (MALYKHIN; COUPLAND, 2015; SHENG; ERTÜRK, 2013; STAHL, 2010), ou ainda, ocorre uma ineficiência e/ou disfunção dos seus receptores específicos (DURISKO et al., 2015; SAVEANU; NEMEROFF, 2012).

28 28 Entretanto, outros sistemas de neurotransmissores estão sendo estudados atualmente, como por exemplo, o sistema glutamatérgico (GERHARD et al., 2016), opióide (PANKSEPP; YOVELL, 2014), oxidonitrérgico (DHIR ;KULKARNI, 2011), GABAérgico, colinérgico (PYTKA et al., 2016), também estão sendo associados com a fisiopatologia da depressão, mostrando que as bases neuroquímicas dessa doença não se resume somente ao sistema monoaminérgico. O avanço nas pesquisas e a quantidade de fármacos disponíveis no mercado ainda não suprem as necessidades reais na terapêutica da depressão, uma vez que a maioria desses medicamentos não são eficazes em grande parte dos pacientes. Essa carência de fármacos faz com que haja atualmente, principalmente em países Europeus o aumento na utilização de plantas medicinais na terapêutica da doença e, várias são as espécies usadas baseadas na medicina tradicional que possuem essa atividade antidepressiva (BARTH et al., 2013; BUTLER; PILKINGTON, 2013; SARRIS et al., 2012). Nos países em desenvolvimento a prática de utilizar plantas medicinais para o tratamento de determinadas patologias é muito comum. Percebe-se também um aumento significativo no uso de plantas em países desenvolvidos. Cerca de 80% da população mundial faz o uso de plantas medicinais. Estimativas indicam que dos 4 bilhões de habitantes do mundo, 80% desses, não podem pagar pelos medicamentos industrializados, o que acarreta em um maior consumo de produtos de origem natural (JOY et al., 2001). O Brasil apresenta uma grande biodiversidade de plantas, o que favorece os estudos para o desenvolvimento de novos fármacos. Nesse contexto, o gênero Piper apresenta grande potencial farmacológico, dentre os quais são apontados às ações antifúngicas e bacteriostáticas (BAUMGARRT, 2007). Além disso, já foram descritos efeitos analgésicos (SILVA et al., 2014), vasodilatadores CARVALHO et al., 2013), antioxidante (SALLEH et al., 2015), antitumoral (GIROLA et al., 2015) e anti-inflamatórios (DORMAN; DEANS, 2000; SALLEH et al., 2015; BRAIT et al., 2015). Também é reportado na literatura para o gênero, espécies que apresentam atividade sobre o SNC, atuando em distúrbios de ansiedade (HRITCU, et al., 2015), convulsão (SCHMITZ et al., 1995) e depressão (SARRIS et al., 2009). Dentre os representantes do gênero com propriedades psicoativas, destaca-se a Kava-kava (Piper methysticum), indicada no tratamento da insônia e ansiedade, atuando como sedativo leve (JUSTO; SILVA, 2008; SARRIS, 2012).

29 29 A Piper cernuum conhecida popularmente como Pariparoba é uma planta nativa da Mata Atlântica. Suas folhas são amplamente utilizadas na medicina popular como analgésico, em distúrbios renais e no tratamento da hepatite (DI STASI et al., 2002). Estudos realizados por Jurcevic (2015) demonstraram que o extrato etanólico das folhas exibe efeito tipo-antidepressivo em testes preditivos de depressão. Por pertencer a um gênero no qual há inúmeras espécies com características farmacológicas importantes e, por ser pouco explorada farmalogicamente, no presente estudo nós propomos aprofundar a investigação das propriedades psicoativas da planta e investigar os mecanismos de ação envolvidos na propriedade antidepressiva, a partir dos resultados preliminares já existentes. Acreditando que o efeito tipo-antidepressivo da planta ocorre em decorrência dos seus compostos majoritários, torna-se relevante avaliar também a atividade do transdihidroagarofurano e da αβ-cubebina.

30 30

31 31 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral: Avaliar as propriedades psicofarmacológicas do extrato etanólico obtido das folhas de Piper cernuum, aprofundando a investigação sobre a ação antidepressiva. 2.2 Objetivos Específicos: Avaliar o efeito do extrato etanólico da planta em animais submetidos a modelos utilizados no estudo de substâncias psicoativas (teste de campo aberto, convulsão induzida por pentilenotetrazol e estricnina, sono induzido por barbitúrico, esquiva inibitória e labirinto em cruz elevado); Avaliar o efeito tipo-antidepressivo do EEPC em modelos agudos de depressão o TNF e TSC; Avaliar o efeito tipo-antidepressivo do EEPC administrado subcronicamente; Determinar o tempo de ação (time course) do efeito tipo- antidepressivo do EEPC; Investigar se o efeito tipo antidepressivo do EEPC está relacionado aos dois fitoconstituíntes majoritários do extrato da planta, a αβ-cubebina e o transdihidroagarofurano; Investigar o envolvimento do sistema serotonérgico, noradrenérgico, dopaminérgico, glutamatérgico, oxidonitrérgico, GABAérgico e sistema opióide no mecanismo de ação do efeito tipo- antidepressivo do EEPC; Avaliar o potencial antioxidante do EEPC, através de modelos in vitro; Avaliar a ação do EEPC sobre as enzimas antioxidantes cerebrais e sobre a peroxidação lipídica através de modelos ex vivo;

32 32 Avaliar a ação do EEPC sobre a atividade da enzima MAO-A através de modelos ex vivo; Avaliar a influência do EEPC sobre os níveis de óxido nítrico através de modelos ex vivo.

33 33 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 Depressão: aspectos gerais A depressão é conhecida como uma doença da contemporaneidade e ganhou tal status após ser considerada um efeito colateral da pós-modernidade. Entretanto, a depressão é uma patologia já descrita há séculos. O primeiro termo a ser utilizado para descrever os distúrbios de humor foi a melancolia, a qual teve sua origem na Grécia antiga, alguns séculos a.c. Esse mesmo termo já era descrito nas produções médicas de Hipócrates e nos textos de Aristóteles. Somente em meados do século XIX, melancolia foi substituída pelo vocábulo depressão e permanece até os tempos atuais (SCLIAR, 2003; TEIXEIRA, 2005; CROCQ, 2015). As síndromes que afetam o SNC são muito impactantes na população atual. A depressão e a ansiedade, por exemplo, afetam mais de 740 milhões de pessoas no mundo, ou seja, metade dos transtornos mentais. No Brasil essa incidência passa dos 50%. Os transtornos depressivos são considerados os mais importantes do SNC, sendo o principal fator de morbidade e incapacidade. Tais transtornos atingem todas as classes socioeconômicas, aparecem em todas as idades indiferentemente do sexo. Estimativas apontam que no Brasil cerca de 17 milhões de pessoas sofrem com distúrbios depressivos, e crianças tem uma incidência de 2 a 5% (COLLINS et al., 2011; GONÇALVES et al., 2014). A depressão apresenta uma variedade de sintomas, e segundo o Manual Estatístico e Diagnóstico de Transtornos Mentais V (DSM-V) o paciente que apresentar mais de cinco dos sintomas descritos abaixo, podem estar sofrendo de distúrbio depressivo. São sintomas depressivos: acentuada diminuição do prazer ou interesse em todas ou quase todas as atividades na maior parte do dia; humor deprimido; sensação de cansaço e fadiga; baixa auto estima; perda da concentração; perda ou ganho de peso acentuado; sentimento de culpa; insônia; retardo psicomotor e pensamentos recorrentes de morte. Dependendo da intensidade dos sintomas, os quadros depressivos podem até levar ao suicídio. Esses sintomas têm que perdurar por pelo menos duas semanas, para cumprir os critérios de diagnósticos (DUAILIB; SILVA, 2014; OMS, 2016). O DSM-V classificou a depressão entre leve, moderada e grave, segundo a quantidade e a gravidade dos sintomas presentes:

34 34 Leve: o paciente apresenta dois sintomas depressivos. Perde o interesse e o prazer por coisas antes prazerosas. Porém mantém a sua rotina habitual sem perda de rendimento; Moderada: o paciente apresenta três sintomas. A rotina diária começa a ser afetada, torna-se uma pessoa emocionalmente instável; Moderada a grave: o paciente passa a apresentar quatro ou cinco sintomas. Torna-se limitado e é comum apresentar comportamento suicida; Grave: o paciente apresenta de cinco ou mais sintomas, além de agitação motora, e tentativas diversas de suicídio. Torna-se incapaz de desempenhar as funções rotineiras e necessita de acompanhamento intensivo. Apesar da depressão maior apresentar uma alta incidência entre a população, a etiologia desse processo permanece em partes obscura. Vários estudos buscam compreender melhor as alterações cerebrais causadas nos processos depressivos. Entretanto, alguns fatores dificultam essa descoberta: grande parte dos processos depressivos são idiopáticos e, a etiologia encontra-se relacionada a fatores de risco (doenças crônicas, estresse, endocrinopatias, efeitos colaterais de algumas drogas); dificuldade em verificar alterações cerebrais em indivíduos vivos, possível somente com a neuroimagem, utilizando marcadores indiretos de ativação que detectam mudanças na atividade neuronal, porém, isto ainda é insuficiente para explicar a variedade de sintomas envolvidos. Além disso, não há um modelo animal ideal que mimetize todas as alterações cerebrais envolvidas em humanos; a limitação do diagnóstico fenomenológico da depressão, assentada na heterogeneidade clínica do transtorno e na sobreposição de sintomas com outras desordens neurológicas (KRISHNAN; NESTLER, 2008) Neuroquimica da depressão Teoria monoaminérgica Por muitos anos a teoria descrita por Schildkraut (1965) conhecida como teoria monoaminérgica permaneceu absoluta para a depressão. Segundo a teoria ocorre uma diminuição das catecolaminas cerebrais, promovendo um desequilíbrio bioquímico da neurotransmissão, resultando na deficiência de 5-HT, DA e NA, e/ou

35 35 uma diminuição quantitativa dos seus receptores ou ainda ineficiência dos mesmos (MEYER, 2012). Essa hipótese foi descrita na década de 60, e a partir daí, houve um avanço significativo nas pesquisas. Nesse período, dois compostos utilizados para o tratamento de doenças psiquiátricas, demostraram apresentar atividade antidepressiva em humanos, aumentando a neurotransmissão de 5-HT e NA, a imipramina e iproniazida. E, verificou-se que pacientes hipertensos que utilizavam reserpina (um inibidor do transportador vesicular das monoaminas, deixando-as expostas no citoplasma à degradação enzimática) apresentavam sintomas depressivos graves (GARDNER; BOLES, 2011). Muitos fármacos antidepressivos comprovam que a teoria das monoaminas está diretamente envolvida nos processos depressivos, pois, suas funções são restaurar os níveis das monoaminas cerebrais ocasionando a diminuição dos sintomas depressivos (figura 1). Há várias classes de antidepressivos disponíveis, dentre eles os tricíclicos, inibidores da monoaminooxidase (IMAO), inibidores seletivos da recaptação da 5-HT (ISRS) e NA (ISRN), de dupla recaptação (5- HT/NA) e ainda há os antidepressivos atípicos, sem um mecanismo farmacológico conhecido (SHIROMA et al., 2010). Os antidepressivos provocam aumento imediato nas monoaminas cerebrais, porém sua ação antidepressiva ocorre apenas semanas após o início do tratamento. A latência prolongada para o início do efeito dos antidepressivos provavelmente ocorre em decorrência do tempo necessário para que fatores tróficos como o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e a proteína anti-apoptótica (Bcl-2) sejam expressos e exerçam seus efeitos, uma vez que este é um processo lento e gradual. Após o início do tratamento o estado comportamental e o humor se reestabelecem. No entanto, o cérebro de um indivíduo tratado com antidepressivos não será igual a do indivíduo não deprimido (CHEN; MANJI; 2006; WILLNER et al., 2013).

36 36 Figura 1. Teoria monoaminérgica da depressão (a) Em sinapses saudáveis, as monoaminas (5-HT, NA e DA) são liberadas na fenda sináptica mediante estímulos e ligam-se em seus receptores nos neurônios pós-sinápticos. Uma vez liberadas, as monoaminas podem ser recaptadas novamente pelos neurônios pré-sinápticos por transportadores específicos ou degradadas por enzimas como a monoaminaoxidase. (b) Nas sinapses de pacientes depressivos ocorre redução da síntese e liberação dos neurotransmissores, diminuindo a biodisponibilidade na fenda sináptica. (c) O tratamento com antidepressivos é capaz de bloquear os transportadores de monoaminas ou inibir a monoaminoxidase, aumentando assim, as concentrações sinápticas das monoaminas (Adaptado de HOLZMANN, 2014). A 5-HT é uma monoamina neurotransmissora, sendo sintetizada a partir dos neurônios serotonérgicos no núcleo da rafe no mesencéfalo e pelas células de Kulchitsky no trato gastrointestinal, onde está em grande concentração, aproximadamente 90% do total presente no corpo humano. Desempenha várias funções fisiológicas importantes no corpo humano, atuando sobre a motilidade intestinal, no controle do apetite, sono, dor e humor (ARTIGAS, 2013; SANGARE et al., 2016; STIEDL et al., 2015). Esse neurotransmissor exerce atividade moduladora no SNC (PUIG; GENER, 2015) isso graças aos axônios dos neurônios serotonérgicos estarem presentes em quase todas as estruturas cerebrais, o que permite uma melhor modulação das funções cerebrais (CELADA et al., 2013). Estudos sugerem que a 5-HT é um potente modulador da plasticidade sináptica, sendo de fundamental importância na manutenção da homeostasia entre o equilíbrio inibitório e excitatório do SNC (LESCH; WAIDER, 2012). Os efeitos desempenhados pela 5-HT são mediados por 14 subtipos de receptores, que estão divididos em sete famílias. A maioria dos receptores são do tipo metabotrópicos e somente o receptor 5-HT3 é ligado a um canal iônico. Os

37 37 receptores 5-HT1 são subdivididos em receptores 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D enquanto que o subtipo de 5-HT2 incluem os receptores 5-HT2A, 5-HT2B, e 5- HT2C. Alguns são mais estudados atualmente por serem mais abundantes no SNC, como os receptores 5-HT1A, 5-HT2A e 5-HT3A (PUIG; GENER, 2015). Regiões cerebrais como o córtex pré-frontal e o hipocampo, são os principais alvos dos neurônios serotonérgicos. Essas regiões cerebrais estão diretamente envolvidas com fatores comportamentais, o córtex pré-frontal com a memória de trabalho, aprendizagem e cognição (MILLER; COHEN, 2001; ROBBINS; ARNSTEN, 2009), e o hipocampo nos processos de memórias declarativas, tomada de decisões, relações sociais e humor (BUZSAKI; MOSER, 2013). A disfunção e/ou diminuição nos níveis da 5-HT é postulada como uma das principais causas para a etiologia da depressão, principalmente após a teoria das monoaminas emergir. Isso fez com que houvesse um aumento significativo nas pesquisas de novos fármacos na terapêutica da depressão envolvendo os receptores de 5-HT. Além dos antidepressivos reestabelecerem os níveis serotonérgicos, também influenciam nos processo bioquímicos de alguns receptores ocorrendo a melhora dos sintomas depressivos (FERNANDEZ; GASPAR., 2012; LIN et al., 2016). A DA é um neurotransmissor independente pertencente à classe das catecolaminas. É produzida pela descarbonização da dihidroxifenilalanina, sendo precursora da adrenalina e da noradrenalina (BROADLEY, 2010; CARLSSON et al., 1958). São conhecidos cinco receptores dopaminérgicos D1, D2, D3, D4 e D5 os quais estão disseminados em várias regiões cerebrais e nos tecidos periféricos, em diferentes densidades (BLANDINI; ARMENTERO, 2014). Há estudos bem atuais sugerindo diferenças nas densidades de receptores dopaminérgicos em cérebros de pacientes depressivos, ressaltando o envolvimento da via dopaminérgica na patogênese da doença e seu tratamento (PYTKA et al., 2016). A sinalização dopaminérgica ocorre através de cinco vias diferentes (BUTINI et al., 2016). A mais importante é através da substância nigra, que está localizada no mesencéfalo, que se dissemina para o corpo estriado através da via nigroestriatal. Quando essa via é afetada, ocorrem os sinais Parkinsonianos (BLANDINI; ARMENTERO, 2014). Outra via importante é o sistema tuberoinfundibular, nessa região a DA atua mediando a liberação de prolactina (LYONS et al., 2012), e também no transporte de sódio através da musculatura lisa vascular (ZENG; JOSÉ,

38 ). A via mesolímbica decorre da área tegmentar, que está ligada ao núcleo accumbens e ao córtex límbico. Essa via exerce importante papel, pois essa região cerebral está diretamente relacionada com o controle das emoções e recompensa (EGERTON et al., 2009). Algumas evidências em neuroimagem demonstraram alterações nas funções cerebrais na região frontal-límbica de pacientes depressivos (ARNONE et al., 2012; BUSATTO, 2013), caracterizando o envolvimento dessa via na doença. Estudos tem demonstrado que o sistema dopaminérgico apresenta atividades em regiões relacionadas com o comportamento, sobretudo a região mesolímbica. Uma das principais características dos pacientes depressivos é apresentar a anedonia, caracterizada pelo total desinteresse por atividades ou aspectos que eram até então prazerosos. A anedonia é um dos sintomas característicos da depressão, esse sintoma ocorre provavelmente por alterações nos receptores dopaminérgicos presentes na região mesolímbica ou pela deficiência da neurotransmissão da DA (SHIMAMOTO et al., 2015). A bupropiona um antidepressivo que atua inibindo a recaptação da DA/NA, sobretudo nessa área cerebral tem sido uma opção de tratamento para a depressão com características anedônicas elevadas (PATEL et al., 2016). A NA denominada também como norepinefrina, é um neurotransmissor neuromodulatório, pertencente a classe das catecolaminas. No SNC a região do locus coeruleus localizado na ponte rostral, é o principal secretor de NA, além de estimular outras regiões cerebrais a secretarem o neurotransmissor. Em resposta ao estresse, a NA apresenta a capacidade de induzir uma resposta rápida e coordenada de múltiplos órgãos, a fim de coordenar a resposta de luta e fuga a partir do sistema simpatoadrenal que modula essa resposta (HENDRICKSON; RASKIND et al., 2016; JOHNSON et al., 1992) A NA exerce suas funções no organismo humano via receptores metabotrópicos conhecidos como receptores noradrenérgicos, uma família composta por duas subfamílias: os receptores α adrenérgicos (α1a, α1b, α1d, α2a, α2b, α2c) e β- adrenérgicos (β1, β2 e β3). Há estudos que postulam que os receptores do sistema noradrenérgico, estão envolvidos em alguns sintomas da depressão, como no caso da excitação e medo. Além disso, há uma diferença na densidade de alguns receptores noradrenérgicos entre pacientes depressivos e não depressivos (GURGUIS et al., 1999; PYTKA et al., 2016). Outro estudo conduzido por Gonzalez-

39 39 Maeso et al., (2002), sugerem pacientes depressivos que cometeram suicídio. o envolvimento de receptores adrenérgicos em Glutamato e Depressão O glutamato (GLU) e o ácido - aminobutírico (GABA) são respectivamente os principais neurotransmissores excitatórios e inibitórios do SNC. Ambos precisam estar em equilíbrio para manter a homeostasia fisiológica do SNC. O GLU após ser liberado na fenda sináptica, pode se ligar a uma série de receptores ionotrópicos como o n-metil-d-aspartato (NMDA R ), ácido α-amino-3-hidroxi-metil-5-4- isoxazolpropiônico (AMPA R ) e kainato. Os receptores metabotrópicos para o GLU abrangem oito subtipos os quais são acoplados a proteína G, estando presente na maioria das sinapses centrais (MCKENNA, 2007) atuando em vários processo biológicos como na regulação neuronal, crescimento neuronal (SELVAKUMAR et al., 2013), aprendizado e memória (KALIVAS, 2009; REIS et al., 2009). O GLU está presente em mais de 80% dos neurônios, estando em maiores concentrações no cérebro em relação às monoaminas (KORNMEIER; SOSIC-VASIC, 2012; SANACORA et al., 2008). Estudos indicam que em processos depressivos ou estresse crônico, os glicocorticoides endógenos aumentam a liberação de GLU na região CA/3 do hipocampo, aumentando o fluxo de cálcio e, consequentemente a neurotoxicidade, levando a um processo de atrofia hipocampal, culminando na morte celular (LUCASSEN et al., 2015; MANJI et. al, 2003). Além disso, foi observado em estudos pós-morte níveis elevados de GLU no tecido cerebral, (HASHIMOTO et al., 2007), no plasma (KUÇUKIBRAHIMOGLU et al., 2009) e no fluido cerebroespinhal (FRYE et al., 2007) de pacientes depressivos. As enzimas responsáveis pelo metabolismo e captação do GLU, estão presentes em neurônios e nas células da glia, as quais parecem ter um papel relevante na fisiopatologia dos processos depressivos (HASHIMOTO et al., 2016). Em estudos pós-morte foi observado que pacientes depressivos apresentavam um volume glial reduzido, quando comparados com indivíduos normais (RAJKOWSKA; MIGUEL-HIDALGO, 2007). Resultados semelhantes, foram obtidos por Banasr et al., (2010) em modelos animais, nos quais verificaram que animais quando submetidos

40 40 a protocolos de estresse, apresentavam um decréscimo significativo na proliferação de células da glia. Como já reportado, os achados científicos a respeito do GLU demonstram que o sistema glutamatérgico apresenta um importante papel na etiologia dos processos depressivos (GERHARD et al., 2016). Pesquisas focando em fármacos que atuam nesse sistema têm se tornado cada vez mais frequente. Agentes farmacológicos que atuam antagonizando os receptores ionotrópicos glutamatérgicos como o receptor NMDA, tanto em estudos pré-clínicos (WOLAK et al., 2015) como em estudos clínicos (OHGI et al., 2015), demonstraram apresentar atividade tipo-antidepressiva de forma rápida, aumentando a sinaptogênese e prevenindo a atrofia hipocampal (LANG; BORGWARDT, 2013; NICIU et al., 2014; ZARATE et al., 2013) Envolvimento da via L-arginina-NO-GMPc na depressão Desde 1962, quando a Science designou o óxido nítrico (NO) como a substância do ano, aumentou drasticamente os estudos envolvendo essa molécula, sobretudo seu envolvimento tanto na fisiologia quanto na patologia de doenças cerebrais. O NO é uma das menores e mais simples moléculas biosintetizadas no organismo. Atua principalmente nos vasos sanguíneos e nas plaquetas, sendo o principal responsável por causar o relaxamento do músculo liso da parede do vaso (DHIR; KULKARNI, 2011). Apresenta atividade neurotransmissora entre as células nervosas, e está envolvido em processos de neuromorfogênese (MANE et al., 2014), plasticidade sináptica (YUI et al., 2016), regulação da expressão gênica (YAMANAKA; O CONNOR, 2011), modulação sexual (BAI et al., 2015), percepção da dor (ABBASNEZHAD et al., 2016) e como mensageiro retrógrado em processos de memória (ZHIHUI, 2013). O NO é sintetizado por um grupo de proteínas denominadas óxido nítrico sintases (NOS), que utilizam como susbtrado a L-arginina para produzir NO e L- citrulina, necessitando da presença de dois co-fatores: o oxigênio e o fosfato dinucleótideo adenina nicotinamida (NADPH) (figura 2). O NO pode ser produzido por uma variedade de células epiteliais, nervosas, endoteliais e inflamatórias. Sendo que existem três isoformas de NOS: a neuronal (nnos) e endotelial (enos) dependentes de cálcio, as quais são sintetizadas em condições normais. Há

41 41 também a induzída (inos), que independe de cálcio, sendo induzida por citocinas e lipopolissacarídeos, em resposta a estímulos inflamatórios (ZHOU; ZHU, 2009). Figura 2. Síntese do NO Síntese do NO e da via L-arginina-NO-GMPc (adaptado de DHIR; KULKARNI, 2011). A nível de SNC, o NO está envolvido na fisiopatologia de diversas desordens neurológicas, como: esquizofrenia (HERNADEZ et al., 2016), epilepsia (ZHU et al., 2015), ansiedade (CHANANA; KUMAR, 2016) e depressão (OSTADHADI et al., 2016). Na depressão maior, a paroxetina (um ISRS) quando utilizado por pacientes depressivos, apresenta a propriedade de inibir a NOS, apontando não só, que a diminuição das monoaminas, mas que níveis elevados de NO podem estar envolvidos na etiologia da depressão (DHIR; KULKARNI, 2011). Estudos demonstram que o NO pode atuar em conjunto com as monoaminas, uma vez que a ativação da GMPc media a captação de NA (DHIR; KULKARNI, 2011), bem como, na modulação do sistema serotonérgico (IKENOUCHI-SUGITA et al., 2009). Em conjunto com a NA e a 5-HT, exercem um papel fundamental, na modulação do sistema dopaminérgico, inibindo a ação dos transportadores de DA (KISS et al., 2004). Essa atuação em várias vias de neurotransmissores deve-se ao

42 42 fato de o NO, apresentar a capacidade de difundir-se facilmente através das membranas celulares, e estar presente nas mais diversas reações químicas inicias (DHIR; KULKARNI, 2011). Vários fármacos que atuam inibindo a síntese de NO através da via L- arginina-no-gmpc demonstraram tanto em modelos animais como em humanos exercer um efeito tipo-antidepressivo, como por exemplo: a venlafaxina (inibidor da recaptação da NA e 5-HT) (KRASS et al., 2011), memantina (antagonista dos receptores NMDA) (ALMEIDA et al., 2006) e a bupropiona (inibidor da recaptação de NA e DA) (DHIR; KULKARNI, 2007). Um estudo realizado por Harkin e colaboradores (2004) descreveram um possível sinergismo entre fármacos inibidores da NOS com antidepressivos serotonérgicos seletivos (imipramina e fluoxetina), ocorrendo uma melhora significativa no quadro depressivo, quando comparado com antidepressivos serotonérgicos usados isoladamente. Evidências clínicas em humanos relacionados a essa via, demonstraram que pacientes deprimidos que cometeram suicídio e pacientes com quadro depressivo crônico, apresentam produção aumentada de NO (SUZUKI et al., 2001; KUDLOW et al., 2016) e níveis elevados de metabólitos de NO no plasma sanguíneo (LEE et al., 2006; TALAROWSKA et al., 2012; MORENO et al., 2013). Relacionando todos esses dados, pode-se aferir que a via L-arginina-NO- GMPc exerce uma expressiva influência na fisiopatologia da depressão maior, o que torna essa via uma boa ferramenta de estudo, a fim de desenvolver novas abordagens terapêuticas para o tratamento da depressão Via GABAérgica e depressão O GABA é sintetizado no cérebro através da descarboxilação do glutamato, utilizando o ácido glutâmico carboxilase e o piridoxal fosfato como co-fatores. Esse processo ocorre principalmente nos neurônios GABAérgicos enquanto que o processo de recaptação ocorre preferencialmente na glia. O GABA é o principal neurotransmissor inibitório do SNC compreendendo quase 40% de toda neurotransmissão, estando presente em todos os níveis do neuroeixo. Apresenta como a principal caraterística a regulação da excitabilidade neuronal em todo o sistema nervoso (MARTIN; RIMVALL, 1993; PEHRSON et al., 2015). Suas funções ocorrem através de três familias de receptores, GABA-A e GABA-C que são

43 43 receptores ionotrópicos, e GABA-B, um receptor metabotrópico ligado a uma proteína Gq (LUSCHER et al., 2011). A transmissão GABAérgica é exercida através de interneurônios que desempenham uma importante função reguladora em conexões neuronais e na neurotransmissão, atuando na modulação de neurônios dopaminérgicos, noradrenérgicos e serotonérgicos (PEHRSON et al., 2015), sendo responsável pelo controle de humor e das funções cognitivas (MCDONALD et al., 2004). O primeiro estudo avaliando o envolvimento do GABA em distúrbios depressivos ocorreu na década de 70, sendo que a progabida (agonista GABA-A) utilizada nos testes com pacientes depressivos, produziu efeitos semelhantes aos efeitos produzidos com antidepressivos tradicionais (BARTHOLINI et al., 1979). Porém apenas na década de 90 que os primeiros estudos comprovaram a relação do sistema GABAérgico com a fisiopatologia da depressão (MAGNI et al., 1989; NIELSEN et al., 1990) e, atualmente vem sendo explorada essa via em vários estudos (REN et al., 2016). Algumas pesquisas mais antigas corroborando com achados mais atuais demonstraram que os receptores GABAérgicos apresentam níveis diminuídos no fluído cerebroespinhal (GOLD et al., 1980), na região do córtex occipital (BHAGWAGAR et al., 2008; KUGAYA et al., 2003; PRICE et al., 2009; SANACORA et al., 2004) e no córtex cinculado anterior (BHAGWAGAR et al., 2008; LUSCHER et al., 2011) de pacientes depressivos. Além disso, há outras evidências mais recentes utilizando espectroscopia de ressonância magnética que também confirmam a diminuição dos níveis GABAérgicos no SNC de pacientes depressivos, sugerindo que a diminuição da neurotransmissão inibitória mediada pelo GABA está envolvida na fisiopatologia da depressão (PEHRSON et al., 2015). Alguns fármacos moduladores dos receptores GABA-A, quando utilizados concomitantemente com ISRS, causaram uma potencialização nos efeitos antidepressivos dos mesmos (MOHLER, 2012). Alguns autores sugerem ainda que esses fármacos moduladores do receptor GABA-A, podem no futuro ser utilizados isoladamente como uma nova ferramenta de tratamento para pacientes depressivos (LUSCHER et al., 2011; MOHLER, 2012; SAMARDZIC et al., 2014). Os receptores GABA-B estão presentes em todo o cérebro, estando em maiores concentrações nas regiões límbicas como no tálamo, córtex e no cerebelo (BOWERY et al., 2002; MCDONALD et al., 2004). Através dessas evidências

44 44 algumas pesquisas envolvendo moduladores dos receptores GABA-B, tem se tornado constante. Visto que, os antagonistas de receptores GABA-B já demonstraram em modelos animais exercer atividade antidepressiva (PYTKA et al., 2016) Envolvimento da via opióide na depressão No ano de 1900 surgiram as primeiras evidências de que a via opióide poderia estar envolvida nos processos depressivos. Percebeu-se que pacientes que fizeram o uso de baixas doses de uma mistura de opióides obtiveram a remissão dos sintomas depressivos, mas a dependência ligada aos opióides limitou a utilização dos mesmos na terapêutica da depressão. Após 80 anos, em 1980 ficou claro o envolvimento da via opióide endógena na depressão, quando alguns pacientes depressivos começaram a responder satisfatoriamente a infusão de β-endorfina, a qual produziu efeito antidepressivo no primeiro dia de tratamento (TENORE, 2008). Dados recentes sugerem o envolvimento dos receptores opióides (µ/mu, δ/delta e κ/kappa) na regulação dos estados de humor em áreas do sistema límbico (LUTZ; KIEFFER, 2013). Esses receptores são do tipo metabotrópicos acoplados a diferentes sistemas efetores intracelulares e são difundidos na área tegmental ventral, núcleo acumbens e o córtex pré-frontal. Os receptores opióides estão envolvidos nos processos de recompensa e respostas emocionais, tornando-se diferentes alvos para a ação de fármacos antidepressivos (HEGADOREN et al., 2009). Os receptores opióides são responsáveis pela regulação de vários sistemas ou elementos envolvidos nos transtornos de humor como o BDNF, e principalmente o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), o qual apresenta uma hiperatividade em pacientes depressivos. Pacientes tratados com morfina apresentaram uma diminuição da atividade do eixo HPA e aumento dos níveis de BNDF, elemento importante na sobrevida neuronal e na neurogênese (LUTZ; KIEFFER, 2013; TAKAYAMA; UEDA, 2005). Utilizado para o tratamento da depressão refratária a buprenorfina (agonista/antagonista parcial opiáceo que se liga aos receptores µ e κ do cérebro) tem demostrado minimizar os sintomas depressivos (BALON, 2016). Os receptores opióides delta (TAYLOR; MANZELLA, 2016) e kappa (JONES et al., 2016) estão presentes em regiões cerebrais envolvidas com o humor, na região da

45 45 amidala onde modula o estado de ansiedade, na região do córtex e do hipocampo, regiões associadas a depressão (VARONA et al., 2003). Estudos demonstram que o tratamento agudo em animais com um agonista delta, aumentou a expressão do BDNF e produziu efeito tipo antidepressivo no teste do nado forçado (TNF) (NEGUS et al., 2012; TORREGROSSA et al., 2006). A estimulação dos receptores kappa causam a diminuição das funções dopaminérgicas em diferentes regiões cerebrais. Além de produzir efeito tipodepressivo em modelos animais e em humanos. Em modelos animais de depressão a naloxona (antagonista opióide) bloqueou o efeito antidepressivo da venlafaxina e dos antidepressivos tricíclicos. Sugerindo em partes, que o efeito desse medicamento ocorre através da via opiácea (BERROCOSO et al., 2004; CARLEZON et al., 2009). Como reportado anteriormente, os receptores µ estão amplamente presentes em diversas regiões cerebrais, envolvidas no humor e na regulação do estresse (LUTZ; KIEFFER, 2013). Estudos em modelos animais sugerem que agonistas dos receptores µ, apresentam efeito tipo-antidepressivo (REEVES; COX, 2008). Um estudo realizado por Kennedy e colaboradores (2006) envolvendo mulheres que sofriam com depressão maior demonstraram que as mesmas apresentavam uma desregulação nos receptores de opióides endógenos (LUTZ; KIEFFER, 2013) Estresse oxidativo e depressão O cérebro humano utiliza a respiração aeróbia para a produção de energia, e para desempenhar as suas funções fisiológicas normais necessita de milhares de moléculas de trifosfato de adenosina (ATP) por minuto. Essa alta demanda de ATP, ocorre pela necessidade de manter e restaurar os gradientes iônicos, que são dissipados em processos de sinalização, como potencial de ação (mantendo potássio alto e sódio baixo em meio intracelular), liberação de neurotransmissores através de exocitose (mantendo níveis intracelulares de cálcio baixo, permitindo reações sensíveis após o influxo de cálcio, induzido por potencial de ação com o sequestro de cálcio no retículo endoplasmático e na mitocôndria) e participação no processo de captação e reciclagem dos neurotransmissores (ALLE et al, 2009; SIMPSON; RUSSELL, 1998). Apesar do cérebro compreender apenas 2% do peso total do corpo, ele é responsável por consumir 20% do oxigênio e 25% da glicose

46 46 que o corpo utiliza (BELANGER et al., 2011). Desta forma, os processos oxidativos exigem do cérebro um alto consumo de oxigênio tornando-o vulnerável ao estresse oxidativo e nitrosativo, que em demasia são responsáveis por alterações lipídicas, proteicas e genéticas (YAO; KESHAVAN, 2011). O estresse oxidativo é uma condição biológica em que as espécies reativas de oxigénio (EROs) geradas excedem a capacidade antioxidante das células, ocorrendo um desequilíbrio entre a produção de EROs e o sistema biológico que tem a função de remover e/ou reparar os danos causados por elas (MILLER; SADEH, 2014). Este estado provoca diferentes tipos de danos oxidativos nos componentes celulares e conduz a várias desordens. Evidêncas clínicas e pré-clínicas indicam que em doenças psiquiátricas a produção de EROs prevalece sobre os sistemas de defesa do cérebro. O dano oxidativo pode desempenhar um papel crucial na fisiopatologia de certas doenças neuropsiquiátricas, incluindo depressão (ZHANG et al., 2016), ansiedade (CHANANA; KUMAR, 2016), esquizofrenia (RUIZ-LITAGO et al., 2012), autismo (KHAN et al., 2016) e epilepsia (RAHMAN, 2015). Também, o estresse oxidativo parece estar envolvido em processos neurodegenerativos de várias doenças dentre elas o Parkinson e Alzheimer (LI; REICHMANN, 2016). As EROs podem ser geradas através de radiação ultravioleta, radiação ionizante, exposição a herbicidas, metais pesados e xenobióticos (exógena). A geração principal do estresse oxidativo é endógena que ocorre nas mitocôndrias, mas também pode ocorrer através de elétrons contidos nas cadeias de transportes nos retículos endoplasmáticos e nas membranas nucleares. Outras formas endógenas de produção de EROs são originadas por enzimas como a: xantina oxidase, NADPH oxidase, citocromo P450 monooxigenase, ciclooxigenase e monoamina oxidase (LEE et al., 2013; PIAO et al., 2014). As principais EROs formadas pelo estresse oxidativo, classificam-se em dois grupos, radicalares: hidroxila (HO ), superóxido (O - 2 ), peroxila (ROO ) e alcoxila (RO ); e não-radicalares: oxigênio (O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e ácido hipocloroso (HOCl) (SUTHAMMARAK et al., 2013). Quando aumentadas causam danos celulares, alterando as funções fisiológicas e a morte celular (SCANDALIOS, 2005). As EROs podem ser combatidas por antioxidantes endógenos ou antioxidantes absorvidos na dieta. Os antioxidantes enzimáticos endógenos compreendem glutationa peroxidase (GPx), catalase (CAT) e a superóxido dismutase (SOD) e os antioxidantes não enzimáticos como a glutationa (GSH),

47 47 peptídeos de histidina, proteínas ligadas ao ferro (transferrina e ferritina), ácido diidrolipóico e o citocromo C redutase (CoQH 2 ). Dentre os antioxidantes adquiridos na dieta se destacam o ácido ascórbico, a-tocoferol (vitamina-e), -caroteno (próvitamina-a) (SMAGA et al., 2015). A GSH é o antioxidante hidrossolúvel não proteico mais importante nos seres vivos. É constituída por três aminoácidos, o ácido glutâmico, cisteína, glicina e é catalisada sequencialmente por duas enzimas citosólicas, a gama-glutamilcisteína sintetase e GSH-sintetase (GU et al, 2015). Apresenta um papel muito importante no metabolismo de nutrientes, regulação do metabolismo celular e na defesa antioxidante. Estudos demonstram que a deficiência da atividade da GSH, contribui para a formação de EROs, e essa diminuição parece estar relacionada com a fisiopatologia de doenças psiquiátricas (MORRIS et al., 2014), dentre elas se destacam a ansiedade, esquizofrenia e depressão (SMAGA et al, 2015). A SOD, tem a função de catalisar a dismutação do superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio, causando a proteção das células expostas as reações do superóxido, além de evitar o envelhecimento precoce causado pelas EROs. Estudos apontam que ocorre uma disfunção na atividade da SOD em pacientes deprimidos (LOPRESTI et al., 2014). E pacientes com depressão maior apresentam diminuição da atividade da SOD, acarretando no aumento dos níveis do ânion superóxido (RYBKA et al., 2013). A CAT é uma enzima antioxidante endógena, que atua inibindo a formação das EROs ou promove a remoção dessas espécies, através da decomposição do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, tornando-o inofensivo ao corpo (GALECKI et al., 2008). Em pacientes com quadro depressivos a atividade da CAT foi encontrada em níveis mais elevados (SZEBENI et al., 2014). Segundo Maes et al., (2011) outra enzima com caracerísticas antioxidantes que exerce função protetora é a GPx. Trata-se de uma enzima eritrocitária intracelular que é responsável pela remoção de hidroperóxidos, hidroxila e lipídeos peroxidados. Alguns estudos in vivo (MAES et al., 2011) e pós-morte (STEFANESCU; CIOBICA, 2012) relataram a diminuição da atividade e dos níveis de GPx no plasma e no córtex pré-frontal de pacientes com depressão maior, sugerindo que a diminuição da GPx aumenta os níveis de EROs no interior da célula, ocasionando a morte celular.

48 48 Há evidências clinicas de que pacientes deprimidos, apresentam níveis elevados de EROs no plasma e no soro (WEY et al., 2009; YUMRU et al., 2009), além de níveis elevados de xantinas oxidases (HERKEN et al., 2007) e peroxidação lipídica (MAES et al., 2010). Em estudos pós-morte verificou-se que a peroxidação lipídica é aumentada no cortéx cingulado anterior (WANG et al., 2009) e a oxidação proteica aumentada no córtex pré frontal (ANDREAZZA et al., 2010) Envolvimento da atividade da enzima MAO na depressão A MAO é uma enzima presente no corpo humano, cuja função é degradar uma variedade de monoaminas primárias, secundárias e terciárias, mantendo a homeostasia no ambiente extracelular e intracelular, evitando que se acumulem e gerem efeitos indesejáveis. A MAO está presente em várias regiões do corpo, porém encontra-se em maiores concentrações nos tecidos neurais e não neurais, como o intestinal e o hepático (EDMONDSON et al., 2009). A MAO apresenta-se em duas isoformas, semelhantes estruturalmente, mas diferentes quanto a preferência pelo substrato. A enzima MAO-A utiliza como substrato a 5-HT, enquanto a MAO-B utiliza a NA e a DA, ambas são encontradas nos neurônios e astrócitos no SNC, e estão presentes na membrana mitocondrial externa (FINBERG, 2014). A atividade anormal dessas isoenzimas foram associadas a várias desordens neurológicas, a MAO-B na doença de Parkinson e doença de Alzheimer, e a MAO-A na ansiedade e depressão (YOUDIN; BAKHLE, 2006). O envolvimento da enzima MAO, é considerado uma das principais hipóteses na fisiopatologia dos processos depressivos, visto que pacientes depressivos apresentam níveis baixos de metabólitos de 5-HT no líquido cefalorraquidiano. Além disso, já é reportado na literatura que a depressão pós-parto pode estar associada a um aumento dos níveis e da atividade da MAO (BLAKELEY et al., 2013). Baseado nesses achados foi importante desenvolver fármacos que atuassem inibindo a atividade da enzima MAO. Os primeiros inibidores da MAO (IMAOs) eram fármacos utilizados no tratamento da tuberculose (isoniazida), mas percebeu-se que quando administrados por pacientes depressivos ocasionavam uma melhora do quadro de humor. Porém, atualmente o uso desses medicamentos é quase obsoleto. Já se observava desde há muito tempo que tais medicamentos desencadeavam efeitos colaterais graves o que limitava o seu uso (MASSART et al., 2012).

49 Neurogênese e depressão Os primeiros estudos detalhados a respeito das células nervosas foram realizados por Camilo Golgi e Ramón y Cajal, através de técnicas de coloração com sais de prata, no final do século XIX. Os pesquisadores afirmavam que não havia o surgimento de neurônios no decorrer da vida, além daqueles formados no nascimento. Outros autores da época, em consenso com Camilo Golgi e Ramón y Cajal, postulavam que o SNC possuia conexões fixas e imutáveis, sem qualquer possibilidade de que novos neurônios surgissem (SILVA, 2009). Percebeu-se que essa teoria era controversa e a formação de novos neurônios ocorre. Dessa forma a neurogênese adulta compreende o processo de formação de novos neurônios a partir de células-tronco neurais (TAVERNA et al., 2014). Outros mecanismos da neurogênese são a diferenciação neuronal, proliferação de células estaminais e a integração de novos neurônios gerados com circuitos neuronais existentes (MING; SONG, 2005). No hipocampo, a neurogênese ocorre em duas regiões cerebrais, a zona subgranular (ZSG) do giro dentado no hipocampo e na zona subventricular (ZSV) situada nas paredes dos ventrículos laterais, onde as novas células migram para o bulbo olfatório através do fluxo migratório rostral (APPLE et al., 2016). A diminuição da neurogênese está associada a várias doenças neurológicas e dentre elas a depressão (WANG et al., 2015), doença de Alzheimer (HERBERT; LUCASSEN, 2016) e a esquizofrenia (SCHOENFELD; CAMERON, 2015). Para ocorrer a neurogênese, às regiões onde os novos neurônios serão sintetizados precisam estar em equilíbrio com vários fatores, como oxigênio, nutrição, hormônios, fatores tróficos e o sistema imune (KOHMAN; RHODES, 2013; YIRMIYA; GOSHEN, 2011). A regulação da neurogênese hipocampal ocorre por fatores neurotróficos, como o BNDF (SCHMIDT; DUMAN, 2010; WATERHOUSE et al., 2012), GABA (SONG et al., 2012) e as monoaminas cerebrais como a 5-HT (DIAZ et al., 2012), NA (JHAVERI et al., 2010; MASUDA et al., 2012), e DA (VEENA et al., 2011; YANG et al., 2008). Há estudos que relacionam níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias, neuroinflamação (MYINT; KIM, 2014) e estresse crônico (CAMERON; GLOVER, 2015; EGELAND et al., 2015) como os principais responsáveis pela diminuição da neurogenênese. Acredita-se que os sintomas

50 50 presentes em algumas desordens neurológicas, incluindo a depressão, ocorrem pela diminuição da neurogênese na região hipocampal (SERAFINE et al., 2014). O envolvimento da neurogênese na etiologia da depressão é baseado em alguns resultados que identificaram a diminuição da região hipocampal em pacientes depressivos (PASCUAL-BRAZO et al., 2014). Em adição, pacientes deprimidos que utilizavam terapia farmacológica com antidepressivos, apresentavam aumento da neurogênese hipocampal e aumento no volume da camada de células granulares (MAHAR et al., 2014). Estudos reportam que há uma diminuição no número de células granulares e diminuição do volume da camada celular granular na região anterior do giro dentado no hipocampo, quando comparado com o grupo tratado com antidepressivos (BOLDRINI et al., 2009, 2012, 2013). O déficit da neurogênese pode estar relacionada com a alta latência para o efeito farmacológico dos antidepressivos, nos quais os novos neurônios formados levam um tempo para tornar-se hiperplásicos e funcionais (GE et al., 2007). 3.2 Plantas medicinais com atividades antidepressivas. Por possuir fácil acesso as plantas, torna-se cada vez mais frequente a população buscar nos produtos de origem vegetal o tratamento para as enfermidades, porém, a utilização de plantas medicinais como alternativa terapêutica ocorre há milhares de anos a.c. (DAL CERO et al., 2015). Estimativas apontam que o mercado global de produtos de origem natural atingiu mais de 27 bilhões de dólares no ano de 2014, sendo o continente Europeu que mais utiliza medicamentos fitoterápicos, seguido pela Ásia e EUA (figura 3). Apesar da grande biodiversidade brasileira, correspondendo a cerca de 46 mil espécies de plantas, o Brasil apresenta uma participação modesta no mercado de medicamentos fitoterápicos, representando apenas 261 milhões de dólares (DUTRA el al., 2016; (SISTEMA DE INFORMAÇÃO SOBRE A BIODIVERSIDADE BRASILEIRA SIBBR, 2016).

51 Número de artigos publicados 51 Figura 3. Mercado mundial de medicamentos fitoterápicos 40% 30% 27% 30% 20% 18% 10% 7% 0% Outros Países EUA Ásia Europa Mercado de medicamentos fitoterápicos distribuídos entre, Europa, Ásia e EUA. (adaptado de Dutra et al., 2016). Em 1994 o Ministério da Saúde estabeleceu a primeira diretiva para avaliar a segurança, eficácia e qualidade dos medicamentos fitoterápicos, diretiva essa baseada nas normas da OMS, e nas diretivas alemãs e francesas. E, com o passar dos anos as diretivas brasileiras foram melhorando e outras foram lançadas, pois fitoterápicos são medicamentos, e o seu registro é baseado em provas científicas. Desta forma, o foco em pesquisas utilizando produtos de origem vegetal vem ganhando cada vez mais ênfase por pesquisadores brasileiros com o passar dos anos (figura 4), em vários tipos de patologias (DUTRA et al., 2016). Figura 4. Artigos científicos publicado por brasileiros entre os períodos de 1987 e Números de artigos científicos publicados por cientistas brasileiros sobre plantas medicinais entre os períodos de 1987 e 2015 (adaptado de Dutra et al., 2016).

52 52 Os pesquisadores do mundo todo vêm avaliando a atividade farmacológica de plantas em diversos processos patológicos, como na dor (KIMANGA et al., 2016), inflamação (BIND et al., 2015), câncer (CHAUDHARY et al., 2015; NHO et al., 2015, dispepsias (BI et al., 2014), infestações parasitárias (MBAYA, OGWIJI, 2014) dentre outras. Também tem crescido nos últimos anos as pesquisas relacionadas a validação das propriedades farmacológicas de plantas em diversas desordens neurológicas, como na doença de Azheimer (ZHANG et al., 2016), doença de Parkinson (BHANGALE; ACHARYA, 2016), epilepsia (PAHWA; GOEL, 2016), ansiedade (BAHI et al., 2014) e depressão (SULAKHIYA et al., 2016). Uma planta nativa da Europa e Ásia, que é amplamente estudada e utilizada no tratamento da ansiedade e depressão, é o Hypericum perforatum (L), popularmente conhecido como Erva-de-São João. Em revisão de Schmidt e Butterweck, (2015) o mecanismo de ação da propriedade antidepressiva em humanos descrito para a planta ocorre através da inibição da recaptação da 5-HT na fibra pós-sináptica (efeito semelhante aos da fluoxetina, um ISRS), além de inibir a atividade da MAO (SCHMIDT; BUTTERWECK, 2015). Também tem sido descrito na literatura os efeitos da planta em ensaios pré-clinicos. Em estudos com animais o Hypericum perforatum (L) reduziu significativamente o estresse induzido nos ratos e diminuiu os níveis do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e corticoesteróides plasmáticos. Além disso, a planta também reduziu o estresse induzido através do aumento dos níveis do fator de necrose tumoral (TNF-α), sugerindo um possível mecanismo de ação através da inter-relação entre sistema imune, a defesa oxidativa do organismo e o sistema neuroendócrino (GRUNDMANN et al., 2010; BUTTERWECK et al., 2004) Outra planta que merece destaque por suas atividades psicotrópicas, é a Valeriana officinalis (L). Nativa da América, Europa e Ásia, exerce várias atividades farmacológicas, como atividade anticonvulsivante, sedativa, ansiolítica e antidepressiva. Vários mecanismos podem estar envolvidos nos efeitos farmacológicos periféricos e centrais da Valeriana officinalis (L), como o efeito agonista dos receptores GABA-A (KAKEHASHI et al., 2014) e o antagonismo de receptores da adenosina (REZVANI et al., 2010). Para a depressão, estudos demonstraram que após o uso, as concentração cerebrais de 5-HT encontraram-se aumentadas (TANG et al., 2008), e pode ser sugerido que exerça a suas ações

53 53 através da sua interação com os receptores glutamatérgicos do tipo: NMDA, AMPA e kainato (DEL VALLE-MOJICA et al., 2011). A Piper methysticum Forst, popularmente conhecida como Kava- Kava é uma planta nativa da Oceania e utilizada pela medicina tradicional há mais 3 mil anos (JOHNSTON; ROGERS, 2006). Na Europa, no ano de 1880 iniciou-se o seu uso no alívio do estresse e para o tratamento da ansiedade, infecções do trato urinário e reumatismo. Porém, só mais recentemente, focou-se o seu uso nos distúrbios do SNC como o estresse, ansiedade e depressão, sendo que muitas vezes, a Kavakava é retratada como análogo "natural" de ansiolíticos e antidepressivos industrializados. Durante os anos de 1999 a 2002, a Kava- kava esteve na lista dos 10 medicamentos fitoterápicos mais vendidos no Brasil (JUSTO; SILVA, 2008; SARRIS, 2012; SHOWMAN et al., 2015). Alguns estudos recentes avaliando a atividade antidepressiva de algumas espécies de plantas foram publicados, como por exemplo a Gastrodia elata Blume (CHEN et al., 2016), Chrysactinia mexicana (CASSANI et al., 2015), Cecropia pachystachya (GAZAL et al., 2014) e a Lafoensia pacari A.St.-Hil (GALDINO et al., 2015). Como demonstrado, vários trabalhos sugerem que as plantas exercem um relevante papel no tratamento das desordens neurológicas, pincipalmente nos processos depressivos. O que torna relevante avaliar as atividades psicotrópicas das mesmas. 3.3 Da planta em estudo: Piper cernuum A Piper cernuum (figura 5) é uma espécie com até 6 metros de altura, possui folhas grandes medindo até 40 cm. É uma planta comum em florestas primárias e secundárias e está amplamente distribuída nos estados do Amazonas, Ceará, Bahia, Espirito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná e Santa Catarina (MARIOT et al., 2003). É conhecida popularmente como Pariparoba, Joãoguarandi-do-grado e Pimenta-de-Morcego e é usada na medicina popular como analgésico, principalmente para dores no estômago, problemas renais, hepáticos e circulatórios (DI STASI et al., 2002).

54 54 Figura 5. Partes aéreas da Piper cernuum Fonte: SOLETTI (2015) Alguns estudos com a Piper Cernuum estão relacionados a investigações fitoquímicas. Danelutte et al., (2005) relatam o isolamento a partir de extratos de suas folhas derivados de ácidos cinâmicos, di-hidrocinâmicos e a lignana cubebina, além de outros compostos em quantidades menores. Capello e colaboradores (2015) isolaram do extrato metanólico das folhas seis compostos derivados fenilpropanoides, sendo eles: ácido 3',4'-dimetoxidihidrocinamico, piplaroxide, 4'- hidroxi-3',5'-dimetoxicinamato de metila, ácido 3',4',5'-trimetoxidihidrocinamico, dihidropiplartina e piplartina. Alguns trabalhos também relatam a obtenção do óleo essencial com predomínio de sesquiterpenos oxigenados (DE ABREU et al., 2005; TORQUILHO et al., 2000, CONSTANTIN et al., 2001). O óleo apresenta propriedades antimicrobiana e antifúngica (COSTANTIN et al., 2001; CORDOVA et al., 2010). Recentemente Capello e colaboradores (2015) avaliaram a atividade citotóxica e leishmanicida in vitro do óleo essencial e os resultados foram significativos. Estudos com esta espécie vegetal também vêm sendo realizados por pesquisadores do NIQFAR/UNIVALI e os resultados são bastante promissores. Muller (2011) avaliou a atividade microbiológica de diversas espécies do gênero Piper e como resultado o extrato da Piper cernuum apresentou atividade contra Staphylococcus aureus. Além disso Gon e Shaefer (2016), através da bioautografia foi possível observar que os extratos de caules e eflorescência também foram ativos contra cepas de Staphylococcus aureus, já o extrato das folhas não apresentou atividade antimicrobiana; dentre as frações analisadas foi observado ação

55 55 antimicrobiana somente na qual o cumarato de bornila estava presente, sugerindo que este seja o responsável por tal atividade biológica. Recentemente Soletti (2015) determinou a composição e avaliou a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais obtidos nas diferentes estações do ano. O óleo, independente da estação de coleta apresentou atividade contra Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, além de apresentar atividade contra dermatófitos como o Microscoprum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Epidermophyton flocosum e contra a levedura oportunista Cryptococcus neoformans. Nesta pesquisa constatou-se que aproximadamente 48% do óleo foi constituído pelos isômeros trans-dihidroagarofurano e 4-epi-cisdihidroagarofurano. Outros compostos identificados foram y-eudesmol (7.64 a 11.65%), β-cariofileno (5.94 a 8.69%), elemol (5.89 a 9.15%), α-pineno (2.63 a 5.43%) e canfeno (2.16 a 4.55%). O extrato etanólico das folhas de Piper cernuum foi avaliado em relação à genotoxicidade através do ensaio cometa in vitro, em cinco diferentes concentrações. Foi possível observar que em nenhuma destas concentrações resultou em aumento significativo de dano ao DNA, sendo possível concluir que, abaixo de 250 µg/ml não houve genotoxicidade (GUOLLO; TRAVESSINI; VITORINO, 2014). Gon e Shaefer (2016) isolaram de extratos etanólicos dos caules o sesquiterpeno trans-dihidroagarofurano, um derivado de ácido cinâmico o cumarato de bornila, e outras substâncias que pertencem à classe das lignanas, a α-cubebina e β-cubebina. Além das substâncias acima mencionadas também foram identificadas por CG/EM o elemol, guaiol, beta-eudesmol, éster do ácido palmítico, aldol, fitol, ácido linoleico, éster do ácido linoleico, ferulato de bornila, as lignanas hinoquinina e asarinina. Além disso, Gon e colaboradores (2016) avaliaram as frações de caules e folhas obtidas com diclorometano através de cromatografia a gás com detector de massas. Dentre os principais compostos encontrados estão sesquiterpenos e lignanas, destacando-se nas folhas o sesquiterpeno trans-dihidroagarafurano com aproximadamente 25% e uma mistura da lignana α e β-cubebina compreendendo aproximadamente 8%. Jurcevic (2015) avaliou a composição química e o efeito tipo antidepressivo de extratos de caules e folhas em diferentes graduações alcoólicas. O extrato

56 56 etanólico das folhas 100 ºGL apresentou atividade tipo-antidepressiva, diminuíndo o tempo de imobilidade dos animais no teste do nado forçado (TNF), além de não afetar a atividade locomotora dos camundongos no teste do campo aberto (TCA). Atualmente encontram-se em andamento por pesquisadores do grupo NIQFAR algumas outras pesquisas com a espécie Piper cernuum, entre elas a avaliação da sazonalidade na atividade antimicrobiana de extratos das folhas, caules e inflorescência da aluna de mestrado Anays Aust. Além disso, um fator relacionado com a segurança da planta também está sendo avaliado. Trata-se da análise do potencial citotóxico do extrato das folhas e caules, que está sendo realizado pelo aluno de mestrado Felipe Wolf. Alguns resultados preliminares apontam que a Piper cernuum não apresenta citotoxicidade, sugerindo que a planta apresenta segurança no seu uso Compostos presentes na Piper cernuum: αβ-cubebina e o transdihidroagarofurano Nas últimas décadas houve um avanço significativo nas pesquisas relacionadas com o isolamento de compostos a partir de recursos naturais. As principais vantagens da utilização de compostos isolados em formulações são uma toxicidade relativamente baixa, completa biodegradabilidade e em alguns casos menores custos de produção (TEPONNO et al., 2016). As lignanas representam uma enorme classe de compostos metabólitos secundários farmacologicamente ativos, que estão amplamente espalhadas dentro do reino vegetal. A principal função das lignanas nas plantas é a proteção contra herbívoros e microorganismos (TEPONNO et al., 2016). No gênero Piper, é frequente a ocorrência de lignanas, destacando-se as espécies P. solmsianum, P. regnelli, P. richardiefolium, P. cubataonum e P. cernuum (YOSHIDA, 2013). As lignanas majoritárias presentes na P. cernuum são a αβ-cubebina (figura 6B) e a hinoquinina (JURCEVIC, 2015). Já são reportadas na literatura, que as lignanas apresentam importantes atividades biológicas como, por exemplo, contra leishmaniose, malária, doença de Chagas, atividade antitumoral, antitrombótica, inseticida, fungicida, atividade antimicrobiana, anti-inflamatória e analgésica (SHI et al., 2015), atividade neuroprotetora (YANG et al., 2016) e atividades ansiolíticas (CHEN et al., 2011).

57 57 As espécies Piper apresentam não só as lignanas, mas também apresentam uma variedade de sesquiterpenos. Um estudo recente realizado por Oyemitan et al., (2015) identificaram mais de 30 compostos no óleo essencial da P. guineense, sendo que 64% do óleo é constituído por sesquiterpenos. Algumas pesquisas apontam que os sesquiterpenoides agarofuranos possuem diversas atividades biológicas relatadas na literatura, sendo elas: inseticidas, anti-tumoral, anti-hiv, atividade imunossupressora e citotóxica (TANTRY et al., 2013). Alguns estudos apontam que os dihidroagarafuranos (figura 6A) apresentam um papel biológico muito importante, porém os estudos com esses compostos a nível de SNC são escassos. Um estudo recente realizado por Alarcon et al., (2015) demonstrou que o dihidroagarofurano apresenta atividade inibitória da acetilcolinesterase, podendo ser considerado uma nova estratégia de tratamento na desordens neurológicas. Figura 6. Estrutura química do trans-dihidroagarofurano, αβ-cubebina Apesar de apresentarem características farmacológicas importantes, atuando em vários tipos de patologias, tanto a αβ-cubebina como o trans-dihidroagarofurano não foram amplamente estudadas, representando uma fonte de estudos a ser explorada.

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59 59 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Material Preparação do extrato O extrato etanólico das folhas de Piper cernuum e os compostos isolados αβcubebina e trans-dihidroagarofurano utilizados no experimento foram fornecidas pelo laboratório de Análise Fitoquímica da UNIVALI, sob a orientação da Profª Drª Angela Malheiros. As folhas da Piper cernuum foram secas em estufa a 40 ºC, moídas em multiprocessador (granulometria 9 Mesh) e submetidas à maceração com diferentes líquidos extratores. O processo de extração foi realizado pelo método de extração por agitação mecânica com solução hidroalcoólicas de etanol a 100 ºGL, proporção droga-vegetal de 1:20, com tempo de extração de 2 horas. Após filtração, o extrato foi obtido por evaporação completa do solvente e as massas dos resíduos foram pesadas em balança analítica. Detalhes sobre a preparação do extrato podem ser verificados no trabalho de mestrado de Jocilene Demetrio Jurcevic (JURCEVIC, 2015). Os compostos isolados α e β-cubebina e trans-dihidroagarofurano foram isolados pelas acadêmicas do curso de farmácia Ana Cristina Gon e Andressa Schaefer como parte do Trabalho de Iniciação Científica. Detalhes sobre os procedimentos de extração podem ser verificados no trabalho de Gon e Schaefer (2016) Substâncias utilizadas e vias de administração Durante os ensaios farmacológicos in vivo foram utilizadas as seguintes substâncias: EEPC, trans-dihidroagarofurano, αβ-cubebina, pentilenotetrazol, fenobarbital, estricnina, diazepam, fluoxetina, imipramina, reserpina, paraclorofenilalanina (PCPA), NAN-190, ketanserina, ondansetrona, prazosin, ioimbina, haloperidol, SCH23390, quetamina, L-arginina, N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), sildenafil, azul de metileno, 7-nitroindazol (7-NI), bicuculina, faclofeno, NMDA, naloxona e naltrindol. (SIGMA, EUA).

60 60 A maioria das substâncias foram solubilizadas em salina com 1% de Tween- 80 e administrados por via intraperitoneal (i.p.). Enquanto o EEPC foi solubilizado em salina com 1% de Tween-80, e administrado por gavagem (v.o.). O NMDA foi solubilizado em salina com 1% de dimetilsulfóxido (DMSO) e administrado pela via intracerebroventricular (i.c.v). Para esse procedimento em particular, os camundongos foram anestesiados com xilazina/quetamina e preparados para retirada do tecido cutâneo levando a exposição do crânio. Após 24 horas foram realizados os experimentos. Para o experimento, os camundongos foram anestesiados com éter, e receberam 3 µl da solução através de uma agulha hipodérmica acoplada a uma seringa de Hamilton de 10 µl, por via i.c.v. A fissura do bregma foi utilizada como referência para a administração i.c.v., sendo a aplicação direta no ventrículo cerebral, 1 mm lateral 1 mm posterior ao bregma, com 2,4 mm de profundidade. Os animais tratados com veículo receberam salina com 1% de Tween-80, ou seja, a mesma solução em que o EEPC foi solubilizado. As doses dos reagentes foram obtidas de trabalhos anteriores realizados em nossos laboratórios (GONÇALVES et al., 2010; HOLZMANN et al., 2015). Para a realização dos testes ex vivo e in vitro foram utilizados os seguintes reagentes, reagente de Bradford, ácido tricloroacético (ATC), hidroximetilaminometano (TRIS), 5,5 -ditiobis 2-ácido nitrobenzóico (DTNB), metanol, água destilada, butil hidróxi tolueno (BHT), ácido sulfúrico, xilenol, ferro, tampão Tris/EDTA, peróxido de hidrogênio, água milli-q, pirogallol, ácido clorídrico, 1-cloro- 2,4 dinitrobenzeno (CDNB), glutationa reduzida (GSH), azida sódica, β-nadph, glutationa redutase de levedura, tampão fosfato de sódio, 5-HT, butil acetato, vanádio, sulfonilamida, etilenodiamina, nitrato de sódio, sulfato de zinco e ácido ascórbico. 4.2 Métodos Avaliação farmacológica in vivo Animais

61 61 Para o experimento foram utilizados camundongos Swiss fêmeas (25 a 35 g). Os animais foram obtidos do biotério central da UNIVALI, e mantidos no biotério de farmacologia experimental com ciclo claro/escuro de 12 horas e aclimatados a temperatura de 22 ± 2ºC. Os animais foram divididos em grupos com N experimental constituído de 8 a 10 indivíduos. Para o processo de adaptação, os animais foram colocados 1 hora antes da realização do experimento, nos locais dos testes. Os protocolos experimentais de pesquisa foram encaminhados para o comitê de ética em pesquisa com animais (CEUA) o qual foi aprovado com o parecer 037/2014. (ANEXO 01) Avaliação do EEPC sobre o sistema motor dos animais através do modelo de deambulação - Teste de Campo Aberto (TCA) Para avaliar possíveis efeitos inespecíficos do EEPC sobre o SNC e a coordenação motora dos animais, seja por sedação e/ou por relaxamento muscular, o teste de campo aberto foi utilizado conforme descrito por Tolardo et al., (2009). O TCA utilizado é um aparato de madeira, com um lado de vidro transparente e com o assoalho dividido em 9 quadrantes. Os animais foram, pré-tratados com o EEPC, (50, 100 e 150 mg/kg, v.o.) e veículo. Ambos foram administrados por via oral e após 60 minutos, os animais foram transferidos individualmente para o aparato. Por um período de 6 minutos foi observado o número de cruzamento entre os quadrantes (crossings) bem como o número de posturas de exploração (rearings) (TOLARDO et al., 2009) Avaliação dos efeitos do EEPC sobre as convulsões induzidas por PTZ O teste do PTZ foi utilizado para avaliar o efeito anticonvulsivante agudo e sub-crônico (15 dias) da administração do EEPC. Num primeiro experimento os animais receberam o EEPC (50, 100 e 150 mg/kg, v.o), fenobarbital (30 mg/kg, i.p) e o veículo. Decorridos 60 minutos da administração do EEPC e veículo e 30 minutos da administração do fenobarbital, os animais receberam o PTZ (100 mg/kg, i.p) e foram imediatamente transferidos sob funis de vidro. Os animais foram analisados por 60 minutos, para a verificação do tempo de latência para a primeira crise convulsiva (NGUELEFACK et al., 2006).

62 62 Num segundo experimento, os animais foram pré-tratados diariamente por 15 dias com EEPC (50 mg/kg), fenobarbital (30 mg/kg, i.p) e veículo. No 15º dia de tratamento decorridos 60 minutos da administração do EEPC e veículo e 30 minutos da administração do fenobarbital, os animais receberam o PTZ (100 mg/kg, i.p) e foram imediatamente transferidos sob funis de vidro. Os animais foram analisados por 60 minutos, para a verificação do tempo de latência para a primeira crise convulsiva Avaliação dos efeitos do EEPC sobre as convulsões induzidas quimicamente por ESTRIC O efeito anticonvulsivante do EEPC também foi avaliado através das convulsões induzidas por estricnina. Os animais receberam o extrato da planta (50 mg/kg, v.o.), fenobarbital (30 mg/kg, i.p) e o veículo (v.o). Após 30 minutos da administração do fenobarbital e 60 minutos da administração do veículo e o EEPC, os animais receberam a estricnina (4 mg/kg,i.p) e foram imediatamente transferidos sob funis de vidro. Os animais foram analisados por 60 minutos, para a verificação do tempo de latência da primeira crise convulsiva (NGUELEFACK et al., 2006) Avaliação do efeito do EEPC sobre o sono induzido por barbitúrico (MSB) Para investigação de um possível efeito hipnótico do EEPC, foi utilizado o MSB conforme descrito por Devi et al., (2003) e padronizado por Holzmann (2014) com pequenas modificações. Como controle positivo foi utilizado o diazepam (DZP) (2 mg/kg, i.p.) e como negativo o veículo (v.o.). Os animais receberam os tratamentos com o EEPC (50, 100 e 150 mg/kg, v.o) e controles. Após 60 minutos da administração do EEPC e controle negativo e 30 minutos da administração do DZP foi administrado a cada grupo o pentobarbital (50 mg/kg, i.p.). Imediatamente após administração do indutor do sono, os animais foram colocados individualmente sob funis de vidro e a latência para o sono bem como o tempo total de sono foi cronometrado, representado respectivamente pela perda e recuperação do reflexo postural (HOLZMANN et al., 2014).

63 Avaliação do efeito do EEPC sobre a memória através do modelo da esquiva inibitória (MEI) Para a avaliação dos possíveis efeitos do EEPC (50, 100 e 150 mg/kg) sobre a memória de longa duração dos animais foi utilizado o modelo da esquiva inibitória conforme procedimento descrito por Holzmann et al., (2014). O aparato consiste de uma caixa automatizada (ALBARSCH), medindo 50 cm de comprimento, 25 cm de largura e 25 cm de altura, com a fase frontal de vidro. Parte do assoalho da caixa consiste de uma plataforma de madeira com 5 cm de altura. O restante do assoalho é constituído de uma grade de barras de bronze, com 1 cm de diâmetro espaçadas 1 cm uma das outras, através das quais é possível aplicar uma diferença de potencial regulável de 0 a 1 må. Durante a sessão de treino cada animal foi colocado sobre a plataforma, acionando-se o cronômetro até sua total descida. Imediatamente era acionado o dispositivo para os choques (0,4 må), por 2 segundos. Na sessão de teste repetiu-se o procedimento, mas com omissão dos choques. A diferença da latência de descida entre treino e o teste foi considerado o índice de memória (IZQUIERDO, 2002). Os animais foram treinados e receberam os tratamentos com o EEPC e controles. Após 24 hs dos tratamentos foram submetidos ao teste da esquiva inibitória Avaliação do efeito do EEPC sobre a ansiedade dos animais através do modelo de labirinto em cruz elevado (LCE) O modelo de ansiedade utilizando nesse estudo foi o LCE. O experimento foi realizado conforme descrito por Pellow et al., (1985), e padronizado por Holzmann, (2014) com pequenas modificações. O aparato utilizado é constituído de madeira, em forma de cruz grega, com dois braços abertos (30 x 5 x 2,5 cm), e dois fechados (30 x 5 x 15 cm), os braços são conectados por uma área central aberta (5 x 5 cm). O aparato é elevado a uma altura de 50 cm sobre o chão. Para a realização dos testes utilizou-se como controle positivo (diazepam 0,75 mg/kg, i.p.) e o controle negativo (veículo, v.o.). O EEPC foi administrada em três concentrações diferentes 50, 100 e 150 mg/kg. Decorridos 60 minutos após a administração do EEPC e/ou veículo e 30 minutos após a administração do

64 64 diazepam os animais foram colocados individualmente no centro do aparato com a cabeça voltada ao braço fechado e observados durante 5 minutos. Durante o período do experimento foi observado e registrado a freqüência de entrada e o tempo de permanência nos braços abertos (FEA e TPA, respectivamente), e nos fechados (FEF e TPF, respectivamente). As entradas foram definidas quando o animal esteve com todas as quatro patas no braço visitado. Para análise estatística, as percentagens das frequências de entradas nos braços abertos (%FEA) e tempo permanência nesses braços (%TPA) foram calculados de acordo com as fórmulas: %FEA = FEA / FEA + FEF X 100 e %TPA = TPA / TPA + TPF X 100, para a análise estatística nos braços fechados foram seguidas da mesma maneira Avaliação da atividade tipo-antidepressiva do EEPC através do TNF Para avaliar possíveis efeitos antidepressivos do EEPC foi utilizado o TNF conforme descrito Porsolt e colaboradores (1977) e padronizado por Holzmann et al., (2014) com algumas modificações. Nesse modelo, os animais foram colocados em uma cuba com água a uma temperatura de Cº para nadarem por um período de 5 minutos. Nesse período foi cronometrado o tempo de imobilidade dos animais, ou seja, o tempo em que cada animal permanece imóvel. Fármacos antidepressivos fazem com que os animais permaneçam mais agitados diminuíndo o tempo de imobilidade. Os animais receberam os tratamentos com o EEPC (50, 100 e 150 mg/kg, v.o), controle positivo imipramina (30 mg/kg, i. p.) e negativo veículo. Após 60 minutos (da administração do EEPC e controle negativo) e 30 minutos (da administração da imipramina) os animais foram submetidos ao TNF Avaliação do efeito antidepressivo do EEPC através do Teste de Suspensão pela Cauda (TSC) A metodologia do TSC foi descrita por Steru et al., (1985) e padronizada por Holzmann et al., (2014) para avaliar os possíveis efeitos antidepressivos de substâncias. Nesse teste a parte terminal da cauda dos camundongos foi fixada com fita adesiva, a uma altura de 50 cm do chão, em um aparato de madeira com capacidade para 4 animais, os quais ficaram isolados visível e acusticamente. O

65 65 tempo de observação dos animais suspensos foi de 6 minutos, e foi analisado o tempo de imobilidade dos mesmos. Substâncias com atividade antidepressiva tende a diminuir o tempo de imobilidade aumentando a agitação dos animais. Os animais receberam os tratamentos com o EEPC (50, 100 e 150 mg/kg, v.o) e controles positivo (fluoxetina 20 mg/kg, i.p.) e negativo (veículo). Após 60 minutos (da administração do EEPC e controle negativo) e 30 minutos (da administração da fluoxetina os animais foram submetidos ao TSC Avaliação do efeito tipo-antidepressivo do EEPC através do tratamento sub-crônico dos animais Para avaliar o efeito tipo-antidepressivo do EEPC através do tratamento subcrônico, os animais foram pré-tratados diariamente por 14 dias com o EEPC (50 mg/kg, v.o), fluoxetina (20 mg/kg, v.o) e veículo. No 7º e no 14º dias de tratamento, após 60 minutos da administração do extrato e/ou veículo e 30 minutos da administração da fluoxetina os animais foram submetidos ao TNF Avaliação do tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do EEPC (Time course) Com o intuito de avaliar o tempo de duração do efeito tipo-antidepressivo do EEPC foi realizado o time course. Nesse experimento, seis grupos de animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o) e um grupo o veículo. Passados 1, 2, 3, 4, 5 e 6 horas da administração do extrato e/ou veículo, os animais foram submetidos ao TNF Avaliação da atividade tipo-antidepressiva dos compostos isolados presentes na Piper cernuum, αβ-cubebina e o trans-dihidroagarofurano. Foi relevante avaliar se os dois compostos presentes na planta são os responsáveis pelo efeito tipo-antidepressivo. Para a realização dos testes, os animais foram pré-tratados com αβ-cubebina (4 mg/kg, v.o.) e transdihidroagarofurano (12,5 mg/kg, v.o.) e veículo. Após 60 minutos da administração dos compostos e o veículo, os animais foram submetidos ao TNF.

66 Determinação do mecanismo de ação da atividade antidepressiva do EEPC Após os resultados sugerirem o efeito tipo-antidepressivo do EEPC, tornou-se relevante avaliar o mecanismo de ação desse efeito. Para avaliar o mecanismo de ação, foi investigado a influência dos sistemas de monoaminas (envolvendo os sistemas serotonérgico, noradrenérgico, dopaminérgico), sistemas glutamatérgico, óxidonitrérgico, GABAérgico, oxidonitrérgico e sistema opióide sobre o efeito do EEPC Avaliação da influência da reserpina sobre a atividade tipoantidepressiva do EEPC Para avaliar o possível envolvimento do sistema monoaminérgico no mecanismo de ação do EEPC, os animais foram pré-tratados por 4 dias consecutivos com reserpina (4 mg/kg, i.p.), agente que causa depleção de catecolaminas das vesículas sinápticas. Decorrido 30 minutos do último tratamento (no quarto dia) com a reserpina, os animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.) e/ou veículo e foram submetidos ao TNF 60 minutos após o tratamento Avaliação da influência do sistema serotonérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Para avaliar o possível envolvimento do sistema serotonérgico no mecanismo de ação tipo-antidepressivo do EEPC, os animais foram pré-tratados durante 4 dias consecutivos com PCPA (depletor dos estoques de 5-HT no SNC o qual inibe a enzima triptofano-hidroxilase, que é responsável pela síntese de 5-HT) na dose de 100 mg/kg, i.p. Decorridos 24 horas após a última administração de PCPA e ou/veículo, os animais foram tratados com o EEPC (50 mg/kg, v.o.), e foram submetidos ao TNF 60 minutos após os tratamentos. Também foi avaliado o envolvimento dos receptores serotonérgicos subtipos 5-HT1A e 5-HT2A. Os camundongos foram pré-tratados com NAN-190 (0,5 mg/kg i.p., antagonista 5-HT1A), ketanserina (5 mg/kg i.p., antagonista 5-HT2A) e/ou

67 67 veículo. Decorridos 30 minutos do tratamento com os antagonistas, os animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.) e após 60 minutos foram submetidos ao TNF. Para avaliar a influência do receptor serotonérgico subtipo 5-HT3, os camundongos foram pré-tratados com ondansetrona (0,5 mg/kg, i.p., antagonista seletivo 5-HT3). Após 30 minutos da administração da ondansetrona, os camundongos receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.) e após 60 minutos foram submetidos ao TNF Avaliação da influência do sistema noradrenérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Para avaliar a influência do sistema noradrenérgico no efeito tipoantidepressivo do EEPC, os animais foram pré-tratados com prazosin (1 mg/kg, i.p., antagonista α1), ioimbina (1 mg/kg, i.p., antagonista α2), e/ou veículo. Passados 30 minutos os animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.), e decorridos 60 minutos os animais foram submetidos ao TNF Avaliação da influência do sistema dopaminérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Para avaliar o possível envolvimento do sistema dopaminérgico no mecanismo de ação tipo-antidepressivo do EEPC, os animais foram pré-tratados com haloperidol (0,2 mg/kg, i.p., antagonista não-seletivo dos receptores de dopamina), SCH23390 (0,05 mg/kg, i.p., antagonista D1), pimozide (0,2 mg/kg, i.p., antagonista D2) e/ou veículo. Passando-se 30 minutos dos tratamentos com os antagonistas, os animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.), e decorrido 60 minutos foram submetidos ao TNF Avaliação da influência do sistema glutamatérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Com o intuito de avaliar o possível envolvimento do sistema glutamatérgico no mecanismo de ação tipo- antidepressivo do EEPC, os animais receberam NMDA (Nmetil-D-aspartato, 0,1 picomol/sítio, i.c.v.) e após 30 minutos foi administrado o

68 68 EEPC (50 mg/kg, v.o.). Decorridos mais 60 minutos os animais foram submetidos ao TNF. Para a avaliação do efeito sinérgico EEPC com um antagonista dos receptores NMDA, utilizou-se a quetamina (0,1 mg/kg, i.p). Primeiramente foi administrado a quetamina (0,1 mg/kg, i.p) e após 30 minutos, foi administrado o EEPC (50 mg/kg, v.o.) e o veículo. Decorridos 60 minutos os animais foram submetido TNF Avaliação da influência da via L-arginina-NO-GMPc sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Para avaliar a influência do sistema sobre o efeito tipo-antidepressivo do EEPC, administrou-se a L-arginina (750 mg/kg, i.p., precursor do NO), L-NAME (10 mg/kg, i.p., inibidor da NOS), 7-nitroindazol (25 mg/kg, i.p., um inibidor específico da óxido nítrico sintase neuronal (NOSn), azul de metileno (20 mg/kg i.p., inibidor da NOS e da GCs) e o sildenafil (5 mg, i.p., inibidor específico da fosfodiasterase 5 (PDE-5) enzima responsável pela degradação do GMPc) e/ou veículo. E, após 30 minutos dos tratamentos, os animais receberam o tratamento com o EEPC (50 mg/kg, v.o.). Decorridos 60 minutos os animais foram submetidos ao TNF Avaliação da Influência do sistema GABAérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC Para avaliar o possível envolvimento do sistema GABAérgico no efeito tipoantidepressivo do EEPC os animais foram pré-tratados com bicuculina (1 mg/kg, i.p., antagonista dos receptores GABA-A) e faclofeno (1 mg/kg, i.p., antagonista dos receptores GABA-B) e/ou veículo. Após 30 minutos da administração dos antagonistas os animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.), e após 60 minutos foram submetidos ao TNF Avaliação da Influência do sistema opióide sobre a atividade tipoantidepressiva do EEPC Para avaliar o possível envolvimento do sistema opióide no efeito tipoantidepressivo do EEPC os animais foram pré-tratados com naloxona (1 mg/kg, i.p., antagonista não seletivo dos receptores opióides) e naltrindol (3 mg/kg, i.p.,

69 69 antagonista dos receptores δ-opioide) e/ou veículo. Após 30 minutos da administração dos antagonistas os animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.), e após 60 minutos foram submetidos ao TNF Modelos bioquímicos: Avaliação de parâmetros oxidativos Preparação das amostras As amostras utilizadas para a realização dos modelos bioquímicos, foram coletadas pelo método da guilhotina, após o tratamento sub-crônico por 14 dias consecutivos dos animais no TNF. Foram utilizados amostras de animais naíve (animal que não recebeu nenhum tipo de tratamento, manuseio ou passou por teste), controle negativo (veículo), controle positivo (fluoxetina, 10 mg/kg, i.p.) e o EEPC (50 mg/kg, v.o.). Por ser a principal região cerebral envolvida em distúrbios depressivos a região límbica foi utilizada para a realização dos testes. Fazem parte da região límbica estruturas cerebrais corticais que se situam em volta do tronco encefálico, na face interna (medial) e inferior dos hemisférios cerebrais (dentre essas estruturas destaca-se o hipocampo, a amigdala, a substância cinzenta periaquedutal, o hipotálamo) e subcorticais dentre as quais foram incluídos os bulbos olfatórios. A região límbica dos animais foi pesada e homogeneizada em tampão fosfato 200 mm (ph=6,5) a 4 C. Esse homogenato foi utilizado para a quantificação dos níveis de GSH, SOD, CAT, GPx, GST, LPO, MAO-A, NO.

70 70 Figura 7. Partes do SNC de camundongos utilizadas para obtenção das amostras. (A) parte do cérebro utilizada, (B) parte do cérebro descartada, (linha tracejada) corte (Fonte: Autor, 2016) Mensuração da concentração de proteínas A concentração de proteínas foi mensurada em espectrofotômetro a 590 nm utilizando o reagente de Bradford (Amresco ) e albumina bovina (0,012 0,100 mg/ml) foi utilizada como curva padrão Avaliação da atividade sequestradora do radical livre 2,2-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) Para avaliar o potencial antioxidante do EEPC, utilizou-se a metodologia descrita por BLOIS (1958) e CHEN et al., (2004) com algumas modificações. Nessa metodologia o EEPC foi avaliado através da sua capacidade em reduzir o radical livre estável DPPH, através de alterações da absorbância a 517 nm. O sistema de reação foi constituído de 750 μl de solução teste (fração) e 250 μl de solução metanólica de DPPH (1 mg em 25 ml). Após 5 minutos o decréscimo da absorbância foi medido. A solução do agente redutor ácido ascórbico (50 μg/ml) foi utilizada como controle positivo do teste e como grupo controle negativo foi utilizado água com 0,32 % DMSO (veículo). Os valores foram expressos em μg/ml.