Inativação de Patógenos em Componentes Sanguíneos

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1 Inativação de Patógenos em Componentes Sanguíneos Alfredo Mendrone Junior Fundação Pró-Sangue Hemocentro de SP

2 Risco residual transfusional O risco de transmissão de agentes infeciosos é um grande desafio em medicina transfusional. A implementação de medidas preventivas, tem reduzido este risco: Seleção cada vez mais criteriosa de doadores; Testes sorológicos e testes de biologia molecular para triagem de doadores; Testes microbiológicos em hemocomponentes. No entanto, estas medidas: Não são capazes de eliminar completamente o risco de transmissão de agentes infecciosos pela transfusão

3 Risco residual transfusional Patógeno Janela Imunológica Pré-NAT Pós-NAT HIV 22 dias 11 dias HCV 70 dias 12 dias HBV 50 dias 15 dias

4 Patógenos Emergentes / Doenças Negligenciadas West Nile Virus Dengue Chikungunia Malária Febre Amarela Leishmania Babesiose Hepatite E Parvovírus B19

5 Contaminação Bacteriana 2011: AABB também passou a exigir cultura de 100% dos concentados de plaquetas randômicas USA: O risco de contaminação bacteriana em CP = 1 / O risco de bacteremia / sepse associada com transfusão ainda é de 1 / transfusões de concentrado de plaquetas O risco de óbito devido contaminação bacteriana = 1 / / REPRESENTA A SEGUNDA CAUSA DE MORTE RELACIONADA COM TRANSFUSÃO

6 Estratégias dos Bancos de Sangue 1. Realizar os testes obrigatórios pela legislação vigente do país e assumir o possível risco possível de transmissão de patógenos pela transfusão, sabendo que este risco é baixo e que qualquer medida terapêutica não está isenta de complicações. 2. Incluir imediatamente todas as provas acessíveis no mercado para analisar todas as doações para todos os patógenos potencialmente transmissíveis. 3. Esperar a ocorrência de uma nova epidemia ou o surgimento de um novo patógeno e, então, discutir as medidas a serem implantadas para diminuir o impacto em termos de risco transfusional. 4. Implantar técnicas de redução/inativação de patógenos como complemento aos testes obrigatórios ou recomendados vigentes.

7 Risco residual transfusional Ao invés de detectar patógeno por patógeno e descartar o hemocomponente com resultado positivo, estratégias têm sido focadas no tratamento do componente sanguíneo: Inativação de patógenos presentes na bolsa Retendo a eficácia terapêutica dos hemocomponentes

8 Estratégia dos Bancos de Sangue A técnica deve ser eficaz frente aos patógenos encontrados em nosso meio, o que torna imprescindível conhecer as taxas de incidência de infecções transmissíveis pela transfusão em cada país. A presença de substâncias químicas adicionadas ao componente sanguíneo para produzir a redução de patógenos não deve produzir toxicidade nem desenvolver problemas mutagênicos futuros. O método não deve diminuir, ou diminuir em limites aceitáveis, o rendimento final do produto. Não deve interfererir na funcionalidade das células sanguíneas e ser garantido um rendimento adequado in vivo. O custo da nova tecnologia possa ser assumida.

9 Vantagens da inativação de patógenos 1. Prevenção da transmissão de agentes virais, bactérias e protozoários pela transfusão; 2. Prevenção da transmissão de CMV; 3. Prevenção de sepse pós-transfusional; 4. Prevenção da transmissão de patógenos emergentes / neglicenciados e não testados; 5. Prevenção de doença do enxerto contra hospedeiro pós-transfusional; 6. Redução da incidência de outros efeitos adversos da transfusão.

10 Possíveis Riscos dos métodos de Redução de Patógenos 1. Lesão do componente 2. Menor eficácia terapêutica 3. Toxicidade para o paciente 4. Toxicidade para aqueles que manipulam o hemocomponente 5. Toxicidade para o meio ambiente 6. Redução da disponibilidade 7. Custos

11 Métodos Disponíveis Plasma Azul de Metileno Solvente-Detergente (Octaplas*, SD* ) Componentes Celulares Plaquetas e Plasma INTERCEPT - Psoraleno (Cerus) MIRASSOL - Riboflavina (Terumo) Hemácias = S-303 (Cerus)

12 Métodos para Redução de Patógenos I - Azul de Metileno Corante carregado positivamente, com alta afinidade por compostos de carga negativa; Ação: É ativado com exposição à luz. Quanto ativado, se liga a guanina e causa dano no ácido nucleico, impedindo a replicação DNA ou RNA; Vantagens: método simples e relativamente barato Desvantagens: 1. Somente é efetivo com virus envelopados e para alguns vírus não-envelopados; 2. Devido à baixa penetração através da membrana plasmática, não inativa patógenos intracelulares nem leucócitos; 3. A ligação a proteinas plasmáticas afeta a atividade de determinadas proteínas.

13 Métodos para Redução de Patógenos II Solvente / Detergente 1. Diminue a infectividade por romper a membrana lipídica que envolve vírus, bactérias e protozoários; 2. Solvente = tri-n-butil-fostato (TNBP) / Detergente= poli-oxietileno-p-t-octilfenol (Triton X-100); 3. Ação: O solvente remove os lipídeos da membrana. O detergente estabiliza o solvente e rompe a dupla camada de lípideos, facilitando a remoção dos lipídeos pelo solvente; 4. Vantagens: A inativação é muito rápida e a eficácia é muito alta; 5. Desvantagens: 1. Não pode ser utilizado em componentes celulares 2. Não inativa vírus que tenham envelopes não lipícos: Parvovírus B19 e Hepatite A 3. Há necessidade de remoção do S/D após inativação.

14 Métodos para Redução de Patógenos MIRASSOL MIRASOL PRT (TERUMO BCT, Lakewood, CO, USA) utiliza a Vitamina B2 (Riboflavina) como agente fotossensibilizante. Após introdução da Riboflavina no componente, o mesmo é submetido à iluminação com UVA/UVB ( nm). Os radicais livres de oxigênio que se formam, causam dano irreversível às bases nucleias. Uma vez que a riboflavina é uma vitamina natural, não precisa ser removida no final do procedimento.

15 Métodos para Redução de Patógenos MIRASSOL Add Riboflavin Illuminate for 4 to 10 minutes Transfer product to illumination bag

16 Métodos para Redução de Patógenos MIRASSOL As plaquetas tratadas com MIRASOL PRT mantém-se viáveis e funcionais até o 5º dia de estoque ph também é mantido até o 5º dia. As mitocôndrias mantém sua estrutura e função independente se estocadas em plasma ou PAS

17 Métodos para Redução de Patógenos INTERCEPT Método fotoquímico que utiliza Amotosalen (Psoraleno sintético): se intercala na região helicoidal do DNA ou RNA Irradiação UVA ( nm 3J/cm 2 ): ativado, reage com a base pirimidina para formar pontes inter nucleicas O tratamento inibe replicação de qualquer DNA ou RNA Após o tratamento as plaquetas ficam estocadas com 35% plasma e 65% de SAP

18 INTERCEPT Mecanismo de ação Amotosalen (S-59) - 150uM Irradiação UV (3.9 J/cm 2, nm), Alvo Região helicoidal da cadeia dupla de DNA ou RNA Interposição Ligações cruzadas com as bases pirimídicas Múltiplas reações cruzadas bloqueiam separação da dupla fita e duplicação

19 Amotosalen crosslinks both single- and double-stranded nucleic acids Helical Regions Double-stranded DNA or RNA Single-stranded DNA or RNA

20 Métodos para Redução de Patógenos III INTERCEPT Redução de um grande espectro de vírus, bactérias e protozoários a nível abaixo do necessário para transmissão da infecção Aprovação: registro CE em 2002, França em 2005 (Afssaps), Alemanha em 2007 (Paul Ehrlich Institute), na Suiça em Como o Amotosalen tb é absorvido pela hemoglobina, não pode ser aplicado para CGV Ainda não tem aprovação do FDA

21 FDA APPROVES INTERCEPT BLOOD SYSTEM FOR PLATELETS Second U.S. Approval for Cerus INTERCEPT Blood System Extends Pathogen Reduction to Platelet Components CONCORD, Calif.-- Dec 18, Cerus Corporation (NASDAQ: CERS) today announced that the U.S. Food and Drug Administration (FDA) has approved the INTERCEPT Blood System for platelets. The INTERCEPT platelet system is approved for ex vivo preparation of pathogen-reduced apheresis platelet components in order to reduce the risk of transfusion-transmitted infection (TTI), including sepsis, and to potentially reduce the risk of transfusion-associated graft versus host disease (TA-GVHD). The approval marks the first time that a system to inactivate pathogens in platelet components will be available in the United States. The FDA approved the INTERCEPT Blood System for plasma on December 16. The INTERCEPT systems for both plasma and platelets use the same illumination device, the same active compound (amotosalen) and very similar production steps.

22 INTERCEPT Espectro de Agentes Inativados Virus Envelopados HIV-1; HIV-2 HIV-1; HIV-2 (intracelular) HBV HCV HTVL-I/II CMV/EBV/HHV-8 WNV SARS Vaccinia Chikungunya Dengue Influenza virus (H1N1) Virus Gripe Aviária (H5N1) XMRV Virus Não envelopados Adenovirus Parvovirus B19 Vírus da Hepatite A Bactérias Gram-negativas Klebsiella pneumoniae Yersinia enterocolitica Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Salmonella choleraesuis Enterobacter cloacae Serratia marcescens Bactérias Gram-positivas Propionibacterium acnes Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Listeria monocytogenes Corynebacterium minutissimum Bacillus cereus (vegetative) Lactobacillus sp. Bifidobacterium adolescentis Clostridium perfringens Espiroquetas Treponema pallidum Borrelia burgdorferi Protozoários Trypanosoma cruzi Plasmodium falciparum Leishmania Babesia microti Leucocitos residuais Linfocitos T Citocinas Em geral, a redução do patógeno é de 5 a 7 log 10

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24 Inativação de Patógenos em Concentrados de Plaquetas Vantagens Do ponto de visa do receptor do hemocomponente, não há critério de exclusão para sua utilização. Ou seja, os hemocomponentes podem ser transfundidos em: Neonatos Crianças Gestantes Transplantado de células progenitoras Pacientes em tratamento com quimioterapia Vários estudos têm estabelecido a segurança do método (mesmo com administração repetida): Fototoxicidade Mutagenicidade Carcinogênese Após inativação com INTERCEPT: Os concentrados de plaquetas podem ser estocados por até 7 dias

25 Inativação de Patógenos em Concentrados de Plaquetas International Forum. Vox Sanguinis 2010; 99:85-95 França Espanha Noruega IP está implementado para CP? Sim Sim Sim Qual Metodologia? INTERCEPT INTERCEPT INTERCEPT MIRASOL (01 centro) Resposta hemostática* Sim Sim Sim Efeitos adversos da Tx (RFNH, TRALI, Sepse) Reduzidos Reduzidos Reduzidos Efeitos adversos da IP Não observados Não observados Não observados Procedimentos -Irradiação -Irradiação -Irradiação Abolidos Screening para bactérias Screening para bactérias Screening para bactérias Screening para CMV CCI 1 hora NR NR Inferior * Medido pelo de unidades de CP e CH transfundidas/paciente

26 Alterações metabólicas das plaquetas após Inativação com INTERCEPT A integridade funcional das plaquetas tratadas com INTERCEPT tem sido analisada* in vitro Os estudos têm mostrado resultados satisfatórios com relação a capacidade funcional das plaquetas após tratamento com AMOTOSALEN, quando os seguintes testes in vitro são avaliados Consumo de glicose Geração de lactato Alteração de forma Resposta a choque hipotônico Expressão de marcadores de ativação: CD62 ph Capacidade de Adesão e Agregação *Picker SM, et al. Transfusion 2004; 44(3): *Lozano M, et al. Transfusion 2007; 47(4): **Apelseth TO, et al. Transfusion (4):653-65

27 Avaliação in vitro da qualidade de concentrado de plaquetas obtidas por PRP x INTERCEPT (BRASIL) N = 20 The RDPs were then treated with 150 μm amotosalen HCl and 3 J/cm 2 UVA, and stored at C with flatbed agitation for 6 days. In vitro assays to assess platelet quality were performed on all pools on days 1 (pre-treatment), 2, 5, and 6. Parameters evaluated: Volume, PLT, Swirling, ph at 22 C, HCO3 -, po2, pco2, Glucose, Lactate

28 Avaliação in vitro da qualidade de concentrado de plaquetas obtidas por PRP x INTERCEPT (BRASIL) Parameter (n=20) Unit Day 1 Pre Treatment Day 2 Post Day 5 Post Day 6 Post Volume ml 280 ± ± ± ± 6 PLT x 10 9 /L 1766 ± ± ± ± 154 Swirling Score ph at 22 C 7.2 ± ± ± ± 0.3 HCO 3 - mmol/l 13.2 ± ± ± ± 1.2 po 2 mm Hg 76 ± ± ± ± 27 pco 2 mm Hg 59 ± 5 58 ± 5 31 ± 3 27 ± 4 Glucose mg/dl 395 ± ± ± ± 43 Lactate mg/dl 67 ± ± ± ± 39

29 Avaliação in vivo pós transfusional de concentrado de plaquetas submetidos à inativação pelo INTERCEPT Incremento Plaquetário Pós-Transfusional (CCI) Resposta Hemostática

30 Estudos de avaliação in vivo pós transfusional de concentrado de plaquetas submetidos à inativação pelo INTERCEPT ESTUDO EuroSPRITE SPRINT HOVON Van Rhenen D Blood 2003 McCullough J Blood 2006 Kerkhoffs JL Br J Haematol 2010 Controlado Sim Sim Sim Randomizado Sim Sim Sim N (pacientes) CCI Sem diferença Inferior Inferior Efeito hemostático Sem diferença Sem diferença Sem diferença

31 Therapeutic efficacy and safety of platelets treated with a photochemical process of pathogen inactivation: the SPRINT trial McCullough J, et al. Blood 2006; 104 : Grupo A Grupo B p n CCI 1 h (x 10 3 ) 11,1 16,0 < 0,001 CCI 24h (x 10 3 ) 6,7 10,1 < 0,001 Episódio de CCI < 5,0 x 10 3 (%) 27,4 12,7 < 0,001 Sangramento * 186 (58,5%) 188 (57,5%) ns * Grau 2 da classificação WHO

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33 Estudos Proteômicos em Plaquetas Pós Inativação de Patógenos IP tem um impacto pequeno sobre o perfil proteômico das plaquetas Ocorre degradação, oxidação e fosforilação mas em pequeno número de proteínas A maioria das proteínas se mantém intacta Mesmo assim, há uma aceleração das lesões de estoque

34 Estudos Proteômicos em Plaquetas Pós Inativação de Patógenos Plaquetas contém mrna e todo equipamento ribossomal necessário para síntese de proteínas As plaquetas são capazes de síntese de novas proteínas como integrinas α 2b β O impacto das técnicas de IP sobre esta capacidade de síntese proteica ainda é desconhecido.

35 Inativação de Patógenos com INTERCEPT em unidades de PLASMA O processo é compatível tanto para plasma obtido a partir do sangue total como para plasma obtido por aférese. Pode ser utilizado pré ou pós congelamento Vários estudos têm analisado a capacidade de retenção dos fatores da coagulação e inibidores após tratamento com INTERCEPT Os valores de Fator VIII e Fibrinogênio mostram os maiores declínios (75%), mas ainda assim dentro dos limites estabelecidos para unidades de plasma com fins terapêuticos Níveis dos outros fatores se mantém 90% dos valores basais Plasma tratado com INTERCEPT se mostrou eficaz no tratamento de: Coagulopatias congênitas Coagulopatias adquiridas Como fluido de reposição em Plasmaférese

36 Inativação de patógeno em concentrado de hemácias: S-303 O processo de inativação de hemácias da CERUS utiliza o composto químico S-303 e a Glutationa (GSH). O S-303: é um agente alquilante que não requer fotoativação para ser ativo. se difunde através da membrana celular, tem afinidade pelos ácidos nucleicos (DNA e RNA), se intercalando nas regiões helicoidais formando com estes uma ligação irreversível e impedindo definitivamente sua replicação. A meia vida é de aproximadamente 25 minutos. O produto primário da decomposição, o S-300, carregado negativamente e inerte.

37 Inativação de patógeno em concentrado de hemácias: S-303 A Glutationa (GSH) O S-303 tem o potencial de reagir com outras substãncias, incluindo fosfato, água e proteínas. Para minimizar estas reações não específicas com proteínas, a glutationa (GSH), presente naturalmente como um antioxidante na maioria das células, é incluído no processo. A GSH se distribui apenas no espaço extracelular do plasma, enquanto que S- 303 difunde-se para o interior da células. Isto permite que a GSH possa neutralizar reações extracelulares do S-303, sem causar um impacto significativo sobre a sua ligação com ácidos nucleicos.

38 Inativação de patógeno em concentrado de hemácias: S-303 Linker Effector Reaction Degradation Anchor Targeting Docking & Permanent Crosslinking (Helical regions of DNA & RNA)

39 S-303 Technology: Prototype System Design for Whole Blood S-303 Inativação de patógeno em concentrado de hemácias:

40 Pathogen Inativação Inactivation de patógeno Efficacy em concentrado Evaluations de hemácias: S-303 Second Generation System Pathogen Mean Log Reduction Pathogen Mean Log Reduction S. aureus a S. marcescens a Y. enterocolitica a E. coli a S. epidermidis b > P. fluorescens b HIV a > Bovine viral diarrhea virus a > Bluetongue virus a Adenovirus Type 5 a > Dengue b K. oxytoca b Salmonella b CMV Chikungunya Pending Pending Plasmodium falciparum > DHBV >5.1 ±0.2 a REL and b Preliminary Data 40

41 Inativação de patógeno em concentrado de hemácias: S-303 NHSBT United Kingdom Avaliação in vitro completa EFS Alsace Alsace, France Avaliação in vitro completa Hoxworth, Ohio/ Blood Center Wisconsin USA Estudos clínicos em andamento Uppsala University Sweden Avaliação in vitro completa DRK Frankfurt, Germany Estudos clínicos em andamento Innsbruck Austria Avaliação in vitro em andamento Cagliari / Torino Italy Estudos clínicos em andamento Estudos clínicos ARCBS Australia Avaliação in vitro completa Avaliações in vitro

42 Inativação de patógeno em concentrado de hemácias: S-303 Estudos pré-clínicos têm demonstrado que o processo que utiliza o S-303 é capaz de inativar altos títulos de vírus e leucócitos presentes em unidades de hemácias. Estudos in vitro têm demonstrado preservação do ph, metabolismo dos eritrócitos, integridade estrutural da hemácia e deformabilidade durante 42 dias. A segurança do S-303, das hemácias tratadas com S-303 e de seu produto de degradação (S-300) tem sido avaliada em estudos pré clínicos: não foram observados toxicidade ou efeitos adversos. (North A, et al. Transfusion 2011) A concentração de S303 que permanece nas hemácias após tratamento é inferior ao limite de detecção (Rios JA, et al. Transfusion 2006)

43 Inativação de patógeno em concentrado de hemácias: S-303 S-303 PRIMEIRA GERAÇÃO: Estudos Fase III foram suspensos devido formação de Acs dirigidos contra hemácias tratadas com S-303 em 2 pacientes com anemia crônica S-303 SEGUNDA GERAÇÃO: desenvolvido com maior concentração de glutationa e ph neutro para evitar a formação de neoantígenos na superfície das hemácias Estudo clínico Fase I = Recuperação de 88% das hemácias tratadas 24 h após a transfusão Sem diferença estatística com transfusão de hemácias controles

44 Inativação de patógeno em concentrado de hemácias: S-303 Resultados de estudos clínicos necessários para obtenção do registro CE já estão completos. Registro CE do processo INTERCEPT RBC System planejado para 2016.

45 Inativação de patógeno em concentrado de hemácias: S-303 Australian Red Cross Blood Service: avaliou a as alterações metabólicas e físicas das RBC após tratamento com S-303 (Winter KM, et al. Transfusion 2014) Hemólise, consumo de glicose e liberação de potássio foi igual nos dois grupos durante os 42 dias de estoque Hemácias tratadas com S-303 tiveram redução de lactato, ph (>6,4) e 2,3 DPG Análise de tamanho, morfologia, expressão de CD-47 e glicoforina A, peroxidação lipídica foram similares. Conclusão = Hemácias tratadas com S-303 tem propriedades in vitro bastante similares às hemácias convencionais

46 Conclusões Inativação de patógeno representa uma quebra de paradigma em medicina transfusional Embora reduza o risco de transmissão de doenças infecciosas pela transfusão como um todo, é particularmente eficiente para prevenir transmissão de bactérias, Substitui a irradiação na prevenção de GvHD A Eficácia hemostática de Plaquetas inativadas parece estar mantida, embora a sobrevida e o CCI sejam inferiores quando comparado com plaquetas não submetidas à inativação As lesões de estoque precisam ser melhor conhecidas

47 Conclusões Ainda há um caminho a ser percorrido: especialmente para outros componentes celulares que não concentrado de plaquetas Deve-se avaliar muito a relação risco/benefício para implantação em unidades de plasma e de concentrados de plaquetas Custo ainda é proibitivo para países em desenvolvimento = 70,00

48 Obrigado!!

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